本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種自體nk細(xì)胞制備方法及實(shí)施該方法的試劑盒。

背景技術(shù)：

自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，nk)，是機(jī)體內(nèi)天然免疫的第一道防線。它具有高效抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)功能，在防御機(jī)體疾病中發(fā)揮著重要作用。自然殺傷細(xì)胞具有不受組織兼容性抗原限制，即殺傷活性無mhc限制。細(xì)胞具有廣譜殺毒性，且不需要抗原遞呈細(xì)胞啟動(dòng)即可直接進(jìn)攻癌細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞通過直接溶解、釋放穿孔素和分泌細(xì)胞因子兩個(gè)方面進(jìn)行殺瘤。細(xì)胞可以分泌tnf-ɑ(腫瘤壞死因子)、ifn-γ(干擾素)和il-1細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素)。這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫功能起著重要的作用。科學(xué)研究表明，自然殺傷細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫功能和神經(jīng)系統(tǒng)相互作用能力。理論上這種細(xì)胞可以成為高效治療癌癥免疫療法。然而，自然殺傷細(xì)胞在外周血中含量?jī)H為5％～10％，隨著年齡增長，免疫器官衰老，細(xì)胞活性和數(shù)量隨之降低。免疫功能降低，直接或間接導(dǎo)致疾病和惡性腫瘤發(fā)生。

目前，國內(nèi)體外培養(yǎng)nk細(xì)胞方法主要有以下幾種方法：一種是采用滋養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增nk細(xì)胞方法，即將單個(gè)核細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞株hfwt混合培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增nk細(xì)胞，此方法雖然可以大大增強(qiáng)nk細(xì)胞殺瘤性和增值率，但由于在培養(yǎng)過程中引入了腫瘤細(xì)胞，雖經(jīng)過致死劑量的γ-射線照射，如果發(fā)生存活的滋養(yǎng)層細(xì)胞隨細(xì)胞一起進(jìn)入人體，就會(huì)存在安全隱患。另一種采用免疫磁珠對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分選后再擴(kuò)增的方法，這種方法分離出的細(xì)胞雖然純度較高，但大大增加了研究成本，而且因?yàn)槿狈Τ墒斓姆诌x后體外培養(yǎng)工藝，所以很難在體外擴(kuò)增，無法滿足臨床回輸所需的細(xì)胞數(shù)量。

因此，國內(nèi)目前的nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒或nk細(xì)胞培養(yǎng)方法在細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞純度和殺瘤性上不能滿足臨床和科研需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞純度、數(shù)量、殺瘤性和活性均能達(dá)到較優(yōu)水平的一種自體nk細(xì)胞制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于實(shí)施該自體nk細(xì)胞制備方法的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種自體nk細(xì)胞制備方法，包括以下步驟：

(1)單核細(xì)胞提?。簭耐庵苎⒘馨徒Y(jié)、胸腺、骨髓、腫瘤、胸水、腹水、或臍帶血中提取單核細(xì)胞；

(2)采用細(xì)胞激活劑包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶；其中，細(xì)胞激活劑包被液為采用pbs稀釋4-1bb抗體細(xì)胞激活劑至8～12ug/ml；

(3)將單核細(xì)胞用nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶～2×10⁶/ml后接種于包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入30～50mlnk細(xì)胞刺激液以及體積分?jǐn)?shù)為2～8％的自體血漿，開始刺激細(xì)胞，并記為d0天；其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、以及il-12，nk細(xì)胞刺激液含有細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、以及ok-432；

(4)d3天解除刺激，從t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞轉(zhuǎn)移離心管離心，棄掉上清，將沉淀打散，用nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×10⁶～2.0×10⁶個(gè)/ml后接種于新的包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為7～15％的自體血漿，每隔一天計(jì)數(shù)并補(bǔ)液；其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基含有il-2以及il-15；

(5)d5天補(bǔ)液，取出t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后用移液管混勻，取出細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按照1.0×10⁵～1.0×10⁶個(gè)/ml補(bǔ)加nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為2～8％的自體血漿，依據(jù)補(bǔ)液量更換包被好的175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋；

(6)d14～d20收取細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)液中的全部細(xì)胞。

進(jìn)一步的，步驟(2)中包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的步驟為：取1-5ml細(xì)胞激活劑包被液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，35～39℃過夜后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)瓶中pbs，再置于3～5℃冰箱中放置2.5～4個(gè)月。

進(jìn)一步的，nk細(xì)胞刺激液含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的ok-432。

進(jìn)一步的，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的il-12。

進(jìn)一步的，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基含有終濃度為650～750u/ml的il-2、以及終濃度為20～30ng/ml的il-15。

本發(fā)明的一種自體nk細(xì)胞制備方法，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法采用單純因子體外誘導(dǎo)擴(kuò)增nk細(xì)胞，利用自體免疫細(xì)胞體外高效增殖成nk細(xì)胞，其細(xì)胞純度、數(shù)量、殺瘤性和活性均能達(dá)到較優(yōu)水平，且避免了其它外來細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)。

2、本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法包括nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞刺激液、以及nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，從而實(shí)現(xiàn)了nk細(xì)胞在不同時(shí)期的誘導(dǎo)、活化、與增值，根據(jù)不同時(shí)期的需求進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而提供了一種nk細(xì)胞增值速度較快、活性較高的nk細(xì)胞制備方法。

3、本發(fā)明不僅具有較好的安全性，而且加入的因子種類較少，操作更簡(jiǎn)單、質(zhì)量更穩(wěn)定、技術(shù)成本更低廉，適用于大規(guī)模培養(yǎng)和腫瘤臨床治療。

4、本發(fā)明包被的4-1bb抗體，可以直接快速有效的使nk細(xì)胞受到信號(hào)刺激，活化nk細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成，顯著提高nk細(xì)胞的殺瘤性。

5、本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法在包被好的t75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5天左右后，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入大的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)袋中，這樣既可以保證nk細(xì)胞被充分激活，又避免了高濃度抗體對(duì)細(xì)胞的持續(xù)作用誘發(fā)的凋亡，并且同等條件下細(xì)胞培養(yǎng)袋的效果要優(yōu)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

6、本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法經(jīng)測(cè)定其細(xì)胞純度高達(dá)80％～85％；殺瘤性高達(dá)85％～90％，增值率達(dá)到1000倍；在其平行試驗(yàn)中，nk細(xì)胞在細(xì)胞比例、殺瘤性、增值率指標(biāo)上比較穩(wěn)定，所以此發(fā)明方法不僅可以用在試劑盒研究而且能夠滿足臨床需求，是目前為止nk細(xì)胞體外培養(yǎng)最優(yōu)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)施該自體nk細(xì)胞制備方法的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒，包括盒體、盒蓋、基座、細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管，其中：盒體為頂面開口的不封閉盒體；盒蓋可扣合在盒體上，用于封閉盒體；基座固定設(shè)置在盒體內(nèi)；細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管可移除的插入在基座上。

進(jìn)一步的，細(xì)胞激活劑包被液試劑管包括pbs試劑管以及4-1bb抗體細(xì)胞激活劑試劑管；nk細(xì)胞刺激液試劑管包括細(xì)胞擴(kuò)增添加劑試劑管、l-谷氨酰胺試劑管、ok-432試劑管；nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管包括細(xì)胞擴(kuò)增添加劑試劑管、l-谷氨酰胺試劑管、il-12試劑管；nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管包括il-2試劑管以及il-15試劑管。

進(jìn)一步的，細(xì)胞激活劑包被液試劑管盛放有細(xì)胞激活劑包被液，細(xì)胞激活劑包被液含有8～12ug/ml的4-1bb抗體細(xì)胞激活劑；nk細(xì)胞刺激液試劑管盛放有nk細(xì)胞刺激液，nk細(xì)胞刺激液含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的ok-432；nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管盛放有nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的il-12；nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管盛放有nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基含有終濃度為650～750u/ml的il-2、以及終濃度為20～30ng/ml的il-15。

進(jìn)一步的，盒體的兩側(cè)還設(shè)置有防滑紋或盒體的兩側(cè)還設(shè)置有便于盒體移動(dòng)的把柄。

進(jìn)一步的，基座上還設(shè)置有插孔，插孔的孔壁粘接有環(huán)狀防滑橡膠套，細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管插入插孔內(nèi)并與防滑橡膠套擠壓接觸。

本發(fā)明的一種用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒設(shè)置有細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管，可以滿足臨床級(jí)別用的自體nk細(xì)胞制備的需要，功能針對(duì)性較強(qiáng)。

2、本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒具有多個(gè)試劑管，可以盛放配備好的細(xì)胞激活劑包被液、nk細(xì)胞刺激液、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，也可以根據(jù)需要盛放用于配備細(xì)胞激活劑包被液、nk細(xì)胞刺激液、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的pbs、4-1bb抗體細(xì)胞激活劑、細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、ok-432、il-12、il-15等，且各個(gè)試劑管根據(jù)盛放試劑的不同可以分區(qū)設(shè)置。

3、本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒兩側(cè)設(shè)置有防滑紋或盒體的兩側(cè)還設(shè)置有便于盒體移動(dòng)的把柄，有效防止試劑盒移動(dòng)過程中的滑動(dòng)脫落。

4、本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒，插孔的孔壁粘接有環(huán)狀防滑橡膠套，防滑橡膠套與各試劑管擠壓接觸，從而可以有效固定各試劑管，而且起到緩沖減震的作用。

5、本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便，在nk細(xì)胞制備領(lǐng)域可以廣泛推廣使用。

附圖說明

為了更清楚的說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單的介紹，顯而易見的，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它附圖。

圖1為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的培養(yǎng)前外周血中nk細(xì)胞比例圖；

圖2為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的培養(yǎng)后nk細(xì)胞比例圖；

圖3為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的nk細(xì)胞增殖圖；

圖4為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的nk細(xì)胞純度圖；

圖5為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的nk細(xì)胞殺毒性測(cè)試圖；

圖6為本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備流程圖；

圖7為進(jìn)行細(xì)胞生物治療的每種病與患者的百分比；

圖8為本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖9為本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒的基座結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中：1-盒體、2-盒蓋、3-基座、4-防滑橡膠套

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明實(shí)施例的一種自體nk細(xì)胞制備方法，包括以下步驟：

(1)單核細(xì)胞提?。簭耐庵苎?、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓、腫瘤、胸水、腹水、或臍帶血中提取單核細(xì)胞。優(yōu)選的，采用密度梯度離心法分離提取出單核細(xì)胞。

(2)采用細(xì)胞激活劑包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。優(yōu)選的，細(xì)胞激活劑包被液為采用pbs稀釋4-1bb抗體細(xì)胞激活劑至8～12ug/ml制得。此處的細(xì)胞激活劑包被液可以包被各型號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)袋，如t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶、1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋等。

(3)將單核細(xì)胞用nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶～2×10⁶/ml后接種于包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入30～50mlnk細(xì)胞刺激液以及體積分?jǐn)?shù)為2～8％的自體血漿，開始刺激細(xì)胞，并記為d0天；其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、以及il-12，nk細(xì)胞刺激液含有細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、以及ok-432。優(yōu)選的，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的il-12；nk細(xì)胞刺激液含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的ok-432。

(4)d3天解除刺激，從t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞轉(zhuǎn)移離心管離心，棄掉上清，將沉淀打散，用nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×10⁶～2.0×10⁶個(gè)/ml后接種于新的包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為7～15％的自體血漿，每隔一天計(jì)數(shù)并補(bǔ)液；其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基含有il-2以及il-15。優(yōu)選的，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為nk-ex培養(yǎng)基，并添加終濃度為650～750u/ml的il-2、以及終濃度為20～30ng/ml的il-15。

(5)d5天補(bǔ)液，取出t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后用移液管混勻，取出細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按照1×10⁵～1.0×10⁶個(gè)/ml補(bǔ)加nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為2～8％的自體血漿，依據(jù)補(bǔ)液量更換包被好的175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋；d7天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液；d9天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液；d11按著計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)其補(bǔ)液；d13天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)補(bǔ)液。

(6)d14～d20收取細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)液中的全部細(xì)胞。

本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法采用單純因子體外誘導(dǎo)擴(kuò)增nk細(xì)胞，利用自體免疫細(xì)胞體外高效增殖成nk細(xì)胞，其細(xì)胞純度、數(shù)量、殺瘤性和活性均能達(dá)到較優(yōu)水平，且避免了其它外來細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)；另外nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞刺激液、以及nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的配置與添加，從而實(shí)現(xiàn)了nk細(xì)胞在不同時(shí)期的誘導(dǎo)、活化、與增值，根據(jù)不同時(shí)期的需求進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而提供了一種nk細(xì)胞增值速度較快、活性較高的nk細(xì)胞制備方法。應(yīng)該指出，本發(fā)明的各數(shù)據(jù)范圍及數(shù)值只是一個(gè)優(yōu)選范圍或優(yōu)選數(shù)值，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。

進(jìn)一步的，步驟(2)中包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的步驟為：取1-5ml細(xì)胞激活劑包被液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，35～39℃過夜后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)瓶中pbs，再置于3～5℃冰箱中放置2.5～4個(gè)月。本發(fā)明包被的4-1bb抗體，可以直接快速有效的使nk細(xì)胞受到信號(hào)刺激，活化nk細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成，顯著提高nk細(xì)胞的殺瘤性。

進(jìn)一步的，t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶、或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行nk細(xì)胞培養(yǎng)。

在本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法的一些實(shí)施例中，還包括步驟(7)：

(7)nk細(xì)胞殺瘤活性測(cè)定：以k562細(xì)胞為靶細(xì)胞，按著不同效靶比將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14小時(shí)后,每孔加入8～12ulcellcountingkit8混勻，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～5小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長處值。

本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法經(jīng)測(cè)定其細(xì)胞純度高達(dá)80％～85％；殺瘤性高達(dá)85％～90％，增值率達(dá)到1000倍；在其平行試驗(yàn)中，nk細(xì)胞在細(xì)胞比例、殺瘤性、增值率指標(biāo)上比較穩(wěn)定，所以此發(fā)明方法不僅可以用在試劑盒研究而且能夠滿足臨床需求，是目前為止nk細(xì)胞體外培養(yǎng)最優(yōu)方法。

進(jìn)一步的，靶細(xì)胞濃度為1×10⁵～1×10⁶個(gè)/ml，效應(yīng)細(xì)胞濃度為1×10⁵～1×10⁶個(gè)/ml。優(yōu)選的，nk細(xì)胞殺瘤活性測(cè)定的效靶比為1:1、5:1、10:1。

為了更清楚的描述本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法，現(xiàn)給出具體實(shí)施例，如圖1至圖6所示：

實(shí)施例采取周邊多名健康人士血液，獻(xiàn)血者經(jīng)臨床評(píng)估無血液系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重自身免疫性疾??；外周血中單個(gè)核細(xì)胞提取后誘導(dǎo)增殖，實(shí)驗(yàn)中所有操作均在gmp實(shí)驗(yàn)室中完成。

每人采集60ml外周血樣，分別做3個(gè)平行試驗(yàn)。室溫下混勻，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，留取2ml外周血做流式。3000rpm/10min，溫度20℃，上下加速度調(diào)成5/5，離心結(jié)束后取出離心管，將血漿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管，余下血漿56℃滅活(30～40)min，滅活結(jié)束后，過70um膜，3000rpm/10min離心。用pbs將血液定容到30ml混勻，將血慢慢打到15ml淋巴細(xì)胞分離液中，溫度室溫，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心30min，上下加速度分別調(diào)為2。

離心結(jié)束后小心取出離心管，將離心管白細(xì)胞層上方約10cm處液體棄掉。將白細(xì)胞層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新離心管，用pbs定容到45ml，溫度20℃，轉(zhuǎn)速1200rpm，離心5min，離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容到45ml，混勻，取出200ul進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液以1200rpm，溫度20℃，離心5min，離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×10⁶個(gè)/ml進(jìn)行接種，加入40mlnk細(xì)胞刺激液和5％自體血漿于包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中開始刺激細(xì)胞，記為d0天。其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為26％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為20％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為100u/ml的il-12；nk細(xì)胞刺激液含有體積分?jǐn)?shù)為26％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為20％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為100u/ml的ok-432。

d3天解除刺激，從t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×10⁶個(gè)/ml接種于新的包被好的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入適當(dāng)nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％自體血漿，轉(zhuǎn)移至新75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每隔一天計(jì)數(shù)補(bǔ)液。其中，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為nk-ex培養(yǎng)基，并添加終濃度為700u/ml的il-2、以及終濃度為25ng/ml的il-15。

d5天補(bǔ)液。從37℃、5％co2培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，然后用移液管混勻，從t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按著(0.5～1)×10⁶個(gè)/ml補(bǔ)加nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和5％自體血漿。依據(jù)補(bǔ)液量更換175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋。

d7天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液。

d9天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液。

d11按著計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)其補(bǔ)液。

d13天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)補(bǔ)液。

d14～d20收取細(xì)胞。將細(xì)胞懸液分別加入到4個(gè)250ml離心管，然后用移液器混勻細(xì)胞懸液，抽取2ml細(xì)胞懸液于凍存管中進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和k562殺瘤性檢測(cè)。再抽取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，次用pbs定容離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容(容量)離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水定容到100ml，離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水重懸細(xì)胞，過70um細(xì)胞篩，將細(xì)胞懸液打入到生理鹽水中。

nk細(xì)胞殺瘤活性測(cè)定(nk細(xì)胞毒殺活性檢測(cè)方法)：

收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以k562細(xì)胞為靶細(xì)胞，靶細(xì)胞的濃度為1×10⁵個(gè)/ml，調(diào)整nk細(xì)胞濃度為1×10⁵個(gè)/ml細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,根據(jù)不同的效靶比分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×10⁵個(gè)/ml、1×10⁶個(gè)/ml。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合,同時(shí)設(shè)相應(yīng)的靶細(xì)胞孔、效應(yīng)細(xì)胞孔和培養(yǎng)基空白對(duì)照孔。每組均設(shè)3個(gè)平行孔，置于37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后,每孔加入10ulcellcountingkit8,混勻,于37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長處值。細(xì)胞毒殺活性計(jì)算方法求出平行孔的平均值,按以下方法計(jì)算各組細(xì)胞毒殺活性,以殺傷率％表示：

細(xì)胞毒殺活性＝(1-靶細(xì)胞孔o(hù)d值一效應(yīng)細(xì)胞孔o(hù)d值)/靶細(xì)胞孔o(hù)d值×100％

本發(fā)明對(duì)3例健康者實(shí)施實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表1所示，由表1可以看出，應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)體外單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，其細(xì)胞純度高達(dá)82.57％；殺瘤性高達(dá)87％，增值率達(dá)到1000倍。其平行試驗(yàn)中，nk細(xì)胞在細(xì)胞比例、殺瘤性、增值率指標(biāo)上比較穩(wěn)定，所以本發(fā)明方法不僅可以用在試劑盒研究而且能夠滿足臨床需求，是目前為止nk細(xì)胞體外培養(yǎng)最優(yōu)方法。

表1

如圖7顯示，本發(fā)明的自體nk細(xì)胞制備方法對(duì)于臨床上各種細(xì)胞生物治療的疾病將會(huì)起到至關(guān)重要的作用，對(duì)亞健康保健、免疫治療領(lǐng)域具有了廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明實(shí)施例的一種用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒，用于實(shí)施上述自體nk細(xì)胞制備方法，如圖8、圖9所示，包括盒體1、盒蓋2、基座3、細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管，其中：盒體1為頂面開口的不封閉盒體1；盒蓋2可扣合在盒體1上，用于封閉盒體1；基座3固定設(shè)置在盒體1內(nèi)；細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管可移除的插入在基座3上。

具體的，盒體1的形狀可以為長方形、正方形、正多邊形、或者圓形，具有完全敞開的頂面，盒體1可以采用硬質(zhì)塑料制作；盒蓋2與盒體1相匹配，盒蓋2可以完全扣合在盒體1上，封閉盒體1，保證盒體1的完全密封，防塵、防水，盒體1與盒蓋2扣合接觸的位置還可以設(shè)置各種卡扣結(jié)構(gòu)，或者盒體1與盒蓋2旋轉(zhuǎn)連接，從而避免盒體1移動(dòng)過程中盒蓋2的脫落，盒蓋2優(yōu)選的與盒體1采用相同的材質(zhì)制作，本發(fā)明不做具體限定；基座3可以可拆卸的卡設(shè)固定在盒體1內(nèi)，便于清洗，也可以與盒體1一體成型，免除后續(xù)的安裝固定程序，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇；細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管均采用玻璃材質(zhì)制作，各試劑管還可以包括用于封閉試劑管的封蓋，封蓋可以采用塑料、橡膠、植物纖維等材料制作。

進(jìn)一步的，細(xì)胞激活劑包被液試劑管包括pbs試劑管以及4-1bb抗體細(xì)胞激活劑試劑管；nk細(xì)胞刺激液試劑管包括細(xì)胞擴(kuò)增添加劑試劑管、l-谷氨酰胺試劑管、ok-432試劑管；nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管包括細(xì)胞擴(kuò)增添加劑試劑管、l-谷氨酰胺試劑管、il-12試劑管；nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管包括il-2試劑管以及il-15試劑管，各試劑管的型號(hào)本發(fā)明不做具體限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際需要選擇。

進(jìn)一步的，細(xì)胞激活劑包被液試劑管盛放有細(xì)胞激活劑包被液，細(xì)胞激活劑包被液含有8～12ug/ml的4-1bb抗體細(xì)胞激活劑；nk細(xì)胞刺激液試劑管盛放有nk細(xì)胞刺激液，nk細(xì)胞刺激液含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的ok-432；nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管盛放有nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基，nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為20～30％的細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、體積分?jǐn)?shù)為15～25％的l-谷氨酰胺、以及終濃度為80～120u/ml的il-12；nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管盛放有nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基含有終濃度為650～750u/ml的il-2、以及終濃度為20～30ng/ml的il-15，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際的需要調(diào)整各成分的含量，以上數(shù)據(jù)范圍只是一個(gè)優(yōu)選數(shù)值范圍。

本發(fā)明的用于制備自體nk細(xì)胞的試劑盒可以盛放配備好的細(xì)胞激活劑包被液、nk細(xì)胞刺激液、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，也可以根據(jù)需要盛放用于配備細(xì)胞激活劑包被液、nk細(xì)胞刺激液、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的pbs、4-1bb抗體細(xì)胞激活劑試、細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、l-谷氨酰胺、ok-432、il-12、il-15等，且各個(gè)試劑管根據(jù)盛放試劑的不同可以分區(qū)設(shè)置，使用更為便捷。

進(jìn)一步的，盒體1的兩側(cè)還設(shè)置有防滑紋、或盒體1的兩側(cè)還設(shè)置有便于盒體1移動(dòng)的把柄/凹槽、或盒體1的兩側(cè)還粘貼有防滑橡膠片；盒體1的底部與承載物接觸的部位還可以設(shè)置防滑墊，防止承載物(如實(shí)驗(yàn)桌等)晃動(dòng)時(shí)盒體1跌落。

進(jìn)一步的，基座3上還設(shè)置有插孔，插孔的孔壁粘接有環(huán)狀防滑橡膠套4，細(xì)胞激活劑包被液試劑管、nk細(xì)胞刺激液試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基試劑管、nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基試劑管、以及自體血漿試劑管插入插孔內(nèi)并與防滑橡膠套4擠壓接觸。具體的，插孔為通孔，插孔的深度決定于基座3的厚度，即插孔的深度等于基座3的厚度；插孔的個(gè)數(shù)及孔徑應(yīng)根據(jù)各試劑管直徑等確定，應(yīng)保證試劑管插入孔徑后，試劑管的垂直度，以及試劑管與盒體1底面的不接觸，基座3的設(shè)置高度及厚度本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行確定，本發(fā)明不做具體限定；防滑橡膠套4可以通過粘接劑等直接粘接于插孔的側(cè)壁上，當(dāng)各試劑管插入時(shí)與試劑管管壁擠壓接觸，從而可以很好的固定各試劑管又可以起到緩沖減震的作用。

綜上所述為本發(fā)明的具體實(shí)施方式,本發(fā)明可以用于試劑盒上進(jìn)行nk細(xì)胞大量增殖。應(yīng)用本發(fā)明方法但本發(fā)明保護(hù)范圍并不僅僅局限于此,任何熟悉本技術(shù)操作人員在本發(fā)明涵蓋技術(shù)范圍內(nèi),可以改變或替換內(nèi)容,都應(yīng)包括在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。