本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種飼養(yǎng)層細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多能干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞（es）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips)，具有自我更新和多向分化的能力，從而在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)需要有飼養(yǎng)層細(xì)胞作為基質(zhì)，來提供營養(yǎng)。evans和kaufman在1981年從小鼠的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到小鼠胚胎干細(xì)胞時(shí)，參照體內(nèi)微環(huán)境，在培養(yǎng)皿里鋪一層經(jīng)過絲裂霉素c處理的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，經(jīng)過處理的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞失去了分裂增殖能力，可以為胚胎干細(xì)胞的貼壁、增殖和信號(hào)傳導(dǎo)等提供多方面的支持，維持多能干細(xì)胞自我更新能力。所以，目前，包括人胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，都是沿用處理過的飼養(yǎng)層培養(yǎng)細(xì)胞。

目前，飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備以絲裂霉素c或者射線照射處理為主，是將分離培養(yǎng)的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（mef），經(jīng)過絲裂霉素c或者射線照射處理，胰酶消化，計(jì)數(shù)，重新將mef接種到預(yù)先鋪有明膠的培養(yǎng)皿里，經(jīng)過至少12小時(shí)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁展開后，才能得到飼養(yǎng)層細(xì)胞，得到的飼養(yǎng)層細(xì)胞在室溫下無法保存，必須立即使用或者儲(chǔ)存于液氮中，儲(chǔ)存條件嚴(yán)格；而且多能干細(xì)胞在傳代時(shí)經(jīng)胰酶消化，飼養(yǎng)層細(xì)胞也會(huì)被消化，所以做好的飼養(yǎng)層只能用一次。傳統(tǒng)的飼養(yǎng)層制作方法，要經(jīng)過合攏小鼠、分離12.5天的孕鼠的mef細(xì)胞、將mef細(xì)胞傳代培養(yǎng)、絲裂霉素c處理2-3h，整個(gè)流程需要2-3周時(shí)間。絲裂霉素c價(jià)格昂貴，整個(gè)制作過程復(fù)雜，廢工耗時(shí)，還存在細(xì)胞交叉污染的問題。射線照射處理雖然可以大批量處理細(xì)胞，但是一般實(shí)驗(yàn)室不具備實(shí)驗(yàn)條件，具有局限性。

雖然，近年來建立了許多無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系來培養(yǎng)多能干細(xì)胞，但是這些體系中細(xì)胞基質(zhì)價(jià)格較昂貴，而且有些多能干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞分化和凋亡等現(xiàn)象，不能很好的維持干細(xì)胞的自我更新，因此，還無法完全替代傳統(tǒng)的飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種飼養(yǎng)層細(xì)胞及其制備方法，采用甲醇處理培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，該方法具有簡單、省時(shí)、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，制備得到的飼養(yǎng)層細(xì)胞可重復(fù)利用。本發(fā)明還提供將該飼養(yǎng)層細(xì)胞在培養(yǎng)多能干細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，該方法包括以下步驟：

（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將小鼠成纖維細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液，在37℃、5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)，停止培養(yǎng)，得到培養(yǎng)的細(xì)胞；

（2）采用甲醇處理：取出培養(yǎng)皿，去掉培養(yǎng)液，將步驟（1）得到的分離培養(yǎng)的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗，然后去掉磷酸鹽緩沖液，加入甲醇，室溫下放置5min后去掉甲醇，在超凈工作臺(tái)上靜置3-6min，使甲醇揮發(fā)，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，即得到飼養(yǎng)層細(xì)胞，備用。

優(yōu)選地，步驟（2）中加入的甲醇為4℃的甲醇。

優(yōu)選地，步驟（2）中加入甲醇的體積與步驟（1）中培養(yǎng)液的體積比為1:2。

優(yōu)選地，步驟（1）中細(xì)胞接種量為每個(gè)35mm培養(yǎng)皿接種5×10⁴個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞，對(duì)應(yīng)加入2ml的培養(yǎng)液。

優(yōu)選地，步驟（1）中的小鼠成纖維細(xì)胞為原代分離的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，所述培養(yǎng)液由高糖型dmem和胎牛血清組成，高糖型dmem和胎牛血清的體積比為：17:3。

優(yōu)選地，步驟（1）中的小鼠成纖維細(xì)胞為建系的小鼠成纖維細(xì)胞，所述培養(yǎng)液由高糖型dmem和小牛血清組成，高糖型dmem和小牛血清的體積比為：9:1。

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞，是采用上述制備方法制備得到的。

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用，是采用上述飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行多能干細(xì)胞的培養(yǎng)。

經(jīng)過甲醇處理，細(xì)胞死亡，形態(tài)收縮，加入相應(yīng)的多能干細(xì)胞培養(yǎng)液，又可恢復(fù)到正常形態(tài)。

采用上述飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行多能干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，具體步驟為：將上述制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的封口膜去掉，加入相應(yīng)的多能干細(xì)胞培養(yǎng)液，然后接種多能干細(xì)胞，每兩天換一次培養(yǎng)液，按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)即可。由于飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)過甲醇處理后已經(jīng)死亡，所以在用來培養(yǎng)多能干細(xì)胞時(shí)不額外消耗多能干細(xì)胞的培養(yǎng)液，相對(duì)于傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞要節(jié)省一半的培養(yǎng)液，而且在多能干細(xì)胞消化傳代時(shí)，胰酶等消化酶不會(huì)破壞該飼養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)，所以可以重復(fù)利用2-3次。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明提供的方法操作簡單，成本低，用時(shí)短。本發(fā)明采用成本低廉的甲醇，將生長在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞處理5min即可，避免了采用絲裂霉素c處理時(shí)鋪板、重新消化計(jì)數(shù)等步驟，操作簡單，效率提高。

（2）本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以重復(fù)利用。細(xì)胞經(jīng)甲醇處理之后被固定在培養(yǎng)皿的底部，所以，在多能干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，即使用胰酶處理將多能干細(xì)胞消化后，被固定的飼養(yǎng)層細(xì)胞仍能保持完整的形態(tài)不被破壞，所以可以重復(fù)利用2-3次。

（3）將本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞用于多能干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，節(jié)省培養(yǎng)液。傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，用于多能干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，飼養(yǎng)層細(xì)胞和多能干細(xì)胞都需要消耗培養(yǎng)液，需每天換培養(yǎng)液。本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在用于多能干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，只有多能干細(xì)胞需要培養(yǎng)液，因?yàn)轱曫B(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)甲醇處理已經(jīng)殺死，不需要消耗培養(yǎng)液，每兩天換一次培養(yǎng)液。

（4）儲(chǔ)存方便，在室溫下即可儲(chǔ)存，節(jié)約成本。本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以直接利用，也可在室溫下保存，無需在液氮環(huán)境中儲(chǔ)存。

（5）可以防止交叉污染。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)甲醇處理后，無污染源，在用于多能干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以避免交叉污染。

附圖說明

圖1小鼠多能干細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。其中，a、b、c分別為小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)，d、e、f分別為小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

圖2人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。其中，a、b、c分別為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)，d、e、f分別為豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

圖3飼養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)，其中，其中，a、b、c分別表示實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞、實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞被利用1次之后的形態(tài)、實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞被利用2次之后的形態(tài)；d、e、f分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞在a、b、c的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

圖4飼養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)，其中，a、b分別表示對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞、對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在被利用1次經(jīng)過胰酶消化之后的形態(tài)；c、d分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞分別在a、b的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

圖5小鼠胚胎干細(xì)胞在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)后的堿性磷酸酶（ap）染色圖，其中，a、b、c分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)后的堿性磷酸酶（ap）染色圖。

圖6用q-pcr方法檢測多能干細(xì)胞標(biāo)志基因的結(jié)果圖。

圖7小鼠胚胎干細(xì)胞特異表面標(biāo)志ssea-1的表達(dá)結(jié)果，其中，a、b、c分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2、對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)傳代第30代時(shí)，多能干細(xì)胞特異表面標(biāo)志ssea-1的表達(dá)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞，其制備方法如下：

（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將5×10⁴個(gè)原代分離的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（簡稱mef）接種在35mm的培養(yǎng)皿中，加入2ml培養(yǎng)液，在37℃、5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過36小時(shí)，待細(xì)胞密度達(dá)到80-90%，停止培養(yǎng)；其中，培養(yǎng)液的配方為：由高糖型dmem（品牌為：hyclone，批號(hào)為ab10134659）和胎牛血清（品牌為gibco，批號(hào)548979）組成，高糖型dmem和胎牛血清的體積比為：17:3，其中胎牛血清簡稱fbs；

（2）采用甲醇處理：從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，去掉培養(yǎng)液，將步驟（1）培養(yǎng)得到的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（簡稱pbs）清洗一遍，然后去掉pbs，用移液槍吸取1ml4℃的甲醇（甲醇提前在4℃的冰箱中預(yù)冷），貼壁加入培養(yǎng)皿中，室溫下放置5min，去掉甲醇，然后在超凈工作臺(tái)上靜置3-6min，使甲醇揮發(fā)干凈，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，備用。

使用該實(shí)施例提供的方法，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞共需約36h，不到2天。

實(shí)施例2

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞，其制備方法如下：

（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將5×10⁴個(gè)建系的小鼠成纖維細(xì)胞（簡稱nih3t3）接種在35mm的培養(yǎng)皿中，加入2ml培養(yǎng)液，在37℃、5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過24小時(shí)，待細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)，停止培養(yǎng)；其中，培養(yǎng)液的配方為：由高糖型dmem和小牛血清組成，高糖型dmem和小牛血清的體積比為：9:1；

（2）采用甲醇處理：從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，去掉培養(yǎng)液，將步驟（1）培養(yǎng)得到的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（簡稱pbs）清洗一遍，然后去掉pbs，用移液槍吸取1ml4℃的甲醇（甲醇提前在4℃的冰箱中預(yù)冷），貼壁加入培養(yǎng)皿中，室溫下放置5min，去掉甲醇，然后在超凈工作臺(tái)上靜置3-6min，使甲醇揮發(fā)干凈后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，備用。

使用該實(shí)施例提供的方法，制備得到飼養(yǎng)層細(xì)胞共需24h。

對(duì)比例1（傳統(tǒng)制備方法）

一種飼養(yǎng)層細(xì)胞，其制備方法如下：

（1）細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將5×10⁴個(gè)原代分離的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞接種在35mm的培養(yǎng)皿中，加入2ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)液與實(shí)施例1中的培養(yǎng)液相同，在37℃、5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36小時(shí)后，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，停止培養(yǎng)。

（2）絲裂霉素c處理：從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液1ml，加入絲裂霉素c10ug，放入37℃，5%co2培養(yǎng)箱中處理2-4小時(shí)，然后去掉培養(yǎng)液，pbs洗3遍，立即使用或者消化、計(jì)數(shù)、分裝、凍存在液氮中，用的時(shí)候再復(fù)蘇。

采用絲裂霉素c處理，過程復(fù)雜，要經(jīng)過重新消化、計(jì)數(shù)等步驟，操作繁瑣。

采用建系的小鼠成纖維細(xì)胞，還可以避免小鼠成纖維細(xì)胞的原代分離，而小鼠成纖維細(xì)胞的原代分離需要2-3周，采用建系的小鼠成纖維細(xì)胞，更能簡化操作流程，節(jié)省時(shí)間?？梢姳景l(fā)明實(shí)施例制備飼養(yǎng)層細(xì)胞耗時(shí)更短，步驟更簡單。

一.檢測本發(fā)明實(shí)施例制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果。

1.將實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，分別用于小鼠多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，小鼠多能干細(xì)胞分別為小鼠胚胎干細(xì)胞和小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，具體培養(yǎng)方法如下：

采用35mm培養(yǎng)皿，分別接種1×10⁵個(gè)小鼠多能干細(xì)胞到實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，培養(yǎng)皿中分別加入2ml小鼠多能干細(xì)胞培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)3天，在采用實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，需要每2天換一次培養(yǎng)液；在采用對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液需要每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。其中，小鼠多能干細(xì)胞培養(yǎng)液由以下成分組成（以100ml培養(yǎng)液為例）：高糖型dmem83ml、胎牛血清15ml、非必需氨基酸1ml(100x)、l-谷氨酰胺1ml（100x）、β-巰基乙醇0.1mm、小鼠白血病抑制因子10ul（10000x）。

小鼠多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)比較，見圖1。其中，a、b、c分別為小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)，d、e、f分別為小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。由圖1中a、b、c和d、e、f可知，小鼠多能干細(xì)胞在本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)后，細(xì)胞邊緣更加整齊，更有立體感，更符合標(biāo)準(zhǔn)的多能干細(xì)胞。實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在應(yīng)用于多能干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，其細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)效果要優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層。

2.將實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，分別用于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法如下：

采用35mm培養(yǎng)皿，分別接種1×10⁵個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞到實(shí)施例1和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，培養(yǎng)皿中加入2ml多能干細(xì)胞培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)4天。在采用實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，需要每2天換一次培養(yǎng)液；在采用對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液需要每天更換培養(yǎng)液，其中，

人多能干細(xì)胞培養(yǎng)液配方（以100ml培養(yǎng)液的組成為例）：dmem/f1278ml、血清替代物ksr20ml、非必需氨基酸1ml、l-谷氨酰胺1ml（100x）、β-巰基乙醇0.1mm、1ug人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，其中dmem/f12是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)液配方（以100ml培養(yǎng)液的組成為例）：高糖型dmem83ml、胎牛血清15ml、l-谷胺酰胺1ml、非必需氨基酸1ml、β-巰基乙醇0.1mm、小鼠白血病抑制因子10ul（10000x）、2umsb031542、3umchir99021、1ug人堿性成纖維細(xì)胞生長因子。其中，sb031542和chir99021是小分子抑制劑。

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)比較，見圖2，a、b、c分別為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)，d、e、f分別為豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。由圖2可知，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)后，細(xì)胞邊緣更加整齊，更有立體感。實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在應(yīng)用于多能干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，其細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)效果要優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層。

二.本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞的重復(fù)利用效果

1.將實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在室溫下保存60天，進(jìn)行重復(fù)利用，培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。其培養(yǎng)方法同上述（一.檢測本發(fā)明實(shí)施例制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用效果中的第1部分）。飼養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)如圖3所示，其中，其中，a、b、c分別表示，實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞、實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞被利用1次之后的形態(tài)、實(shí)施例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞被利用2次之后的形態(tài)；d、e、f分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞在a、b、c的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

由圖3可知，b顯示飼養(yǎng)層細(xì)胞被利用1次后，仍可以保持完整的形態(tài)；e顯示將小鼠胚胎干細(xì)胞重新接種到已經(jīng)用過1次的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，小鼠胚胎干細(xì)胞依然可以正常生長；c顯示經(jīng)過2次利用的飼養(yǎng)層細(xì)胞，其形態(tài)仍然完整；f顯示采用被利用2次的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞時(shí)，小鼠胚胎干細(xì)胞仍然能正常生長，說明本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以重復(fù)利用。

2.將對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，重復(fù)1次利用，用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞，飼養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)見圖4，其中，a、b分別表示對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞、對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在被利用1次經(jīng)過胰酶消化之后的形態(tài)；c、d分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞分別在a、b的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)。

由圖4可知，a顯示采用對(duì)比例1（傳統(tǒng)方法）制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)，其細(xì)胞形態(tài)基本完整，c顯示小鼠胚胎干細(xì)胞接種到傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)的形態(tài)；b顯示傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞在利用一次經(jīng)過胰酶消化之后的形態(tài)，傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，細(xì)胞全部漂起來，基本沒有正常形態(tài)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，由d可知小鼠胚胎干細(xì)胞在利用過一次的傳統(tǒng)飼養(yǎng)層細(xì)胞上面培養(yǎng)的形態(tài)，可以看出因?yàn)轱曫B(yǎng)層細(xì)胞漂浮起來，沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞存在，所以小鼠胚胎干細(xì)胞邊緣不整齊，分化嚴(yán)重，無法維持正常的多能干細(xì)胞形態(tài)，可見，傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞并不能重復(fù)利用。

三.小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上多次傳代后的多能性檢測，檢測結(jié)果分別見圖5、圖6、圖7。

其中，圖5中a、b、c分別表示小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)后的堿性磷酸酶（ap）染色圖；

圖6表示用q-pcr方法檢測小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2、對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)傳代第20代時(shí)，多能干細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測結(jié)果，以采用對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞作為對(duì)照；

圖7中a、b、c分別表示用流式方法檢測小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2、對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)傳代第30代時(shí)，多能干細(xì)胞特異表面標(biāo)志ssea-1的表達(dá)結(jié)果,以采用對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞作為對(duì)照。

堿性磷酸酶染色作為鑒別多能干細(xì)胞多能性的指標(biāo)之一，可以用來初步判斷多能干細(xì)胞的多能性。由圖5可知，小鼠胚胎干細(xì)胞在傳統(tǒng)飼養(yǎng)層和本發(fā)明制備的飼養(yǎng)層生培養(yǎng)后，ap染色都為紅色，說明實(shí)施例1和實(shí)施例2和對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，都可以維持多能干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。

由圖6可知，小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)培養(yǎng)至20代時(shí)，跟傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，多能相關(guān)基因（oct4、nanog、sox2）有升高的趨勢，說明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層跟對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層相比，能更好的維持多能干細(xì)胞的多能性。

由圖7可知，小鼠胚胎干細(xì)胞在實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上連續(xù)傳代至第30代時(shí)，流式檢測小鼠多能干細(xì)胞特異表面標(biāo)志ssea-1，跟對(duì)比例1（傳統(tǒng)方法）相比，ssea-1的百分比更高，說明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層跟對(duì)比例1制備的飼養(yǎng)層相比，有利于更好的維持多能干細(xì)胞的多能性。

由此可知，實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞時(shí)，能很好的維持多能干細(xì)胞的多能性，其多能性優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)出來的細(xì)胞，實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)更加完整，可見，本發(fā)明提供的飼養(yǎng)層細(xì)胞優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞。