技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物質(zhì)新能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用木質(zhì)素降解菌強化廢棄生物質(zhì)酸法預(yù)處理的方法。

背景技術(shù)：
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近年來，為了降低對化石燃料的依賴，各國政府和科研機構(gòu)大力開展對可再生能源的開發(fā)和研究。廢棄生物質(zhì)中的木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，蘊藏著巨量的碳資源，成為第二代生物質(zhì)能源，是當前生物乙醇、生物塑料、生物柴油等綠色產(chǎn)品生物發(fā)酵最重要的碳源。木質(zhì)纖維素中的半纖維素和木質(zhì)素緊密鑲嵌在纖維素的周圍，如不進行任何處理，其糖化發(fā)酵效率極低。因此，預(yù)處理成為了木質(zhì)纖維素開發(fā)利用的首要環(huán)節(jié)，即疏松或破壞纖維素的致密結(jié)構(gòu)以及木質(zhì)素和半纖維素的包裹，使纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分離，從而提高酶對纖維素的可及度和作用效率。

目前的預(yù)處理工藝主要分為物理法、化學(xué)法和生物法。酸法預(yù)處理是最常見的化學(xué)預(yù)處理方法之一，主要是指采用硫酸、鹽酸或二氧化硫等酸性物質(zhì)作用于木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素和半纖維素，從而達到暴露內(nèi)部纖維素、提高酶解效率的目的，具有操作簡單、效率高等優(yōu)勢。然而，由于木質(zhì)素具有天然異質(zhì)性、多變性和極強的穩(wěn)定性，當酸性條件較溫和時，木質(zhì)素難以高效去除，這不僅降低了糖純度，也給纖維素的后續(xù)酶解和生物轉(zhuǎn)化造成阻礙。但若改用較強的酸處理條件(如酸濃度高、溫度高、作用時間長等)，又提高了技術(shù)的藥耗和能耗，甚至易造成溶解木質(zhì)素的重新凝聚，沉積在纖維素的表面。此外，較高濃度的酸的體系中還會產(chǎn)生大量的酶抑制產(chǎn)物。這都不利于后續(xù)的酶解過程。因此，溫和的稀酸預(yù)處理是優(yōu)選方案，但還需對這一方法進行改進，以深度去除預(yù)處理渣中殘留木質(zhì)素，從而提高木質(zhì)纖維素中碳源利用和資源化產(chǎn)率。

目前，已有人采用真菌法或真菌-化學(xué)聯(lián)合預(yù)處理實現(xiàn)了木質(zhì)素的深度去除。但真菌生長所需時間過長(10天～50天)，不利于工藝擴大化和商業(yè)化。與真菌相比，木質(zhì)素降解細菌的數(shù)量雖然較少，但可大大縮短生物處理接種時間(<7天)，因此采用細菌替代真菌進行木質(zhì)纖維素預(yù)處理具有重要意義。但當前國內(nèi)外尚無酸法-細菌聯(lián)合預(yù)處理的相關(guān)報道。此外，廢棄生物質(zhì)也就是原生木質(zhì)纖維素，不僅包括木質(zhì)素，還包括纖維素和半纖維素，三者緊密結(jié)合連接；其中的原生木質(zhì)素高度聚合，木質(zhì)素降解細菌作用原生木質(zhì)纖維素時比純的堿木質(zhì)素要更加復(fù)雜，作用難度更大，因此，找尋合適的培養(yǎng)基成分以及條件，最大程度的去除酸法預(yù)處理渣中殘留木質(zhì)素也是亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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為了解決現(xiàn)有廢棄生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用木質(zhì)素降解菌強化廢棄生物質(zhì)酸法預(yù)處理的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種利用木質(zhì)素降解菌強化廢棄生物質(zhì)酸法預(yù)處理的方法，包括以下步驟：

(1)酸法預(yù)處理：將粉碎的廢棄生物質(zhì)加入硫酸溶液中，加熱反應(yīng)，過濾分離，所得固體清洗至ph呈中性，烘干，得到酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)；

(2)木質(zhì)素降解菌強化預(yù)處理：將保藏編號為cgmccno.4240的木質(zhì)素降解菌cupriavidusbasilensisb-8接種于含酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)的無菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，過濾分離所得固體，清洗，烘干，得到細菌強化酸法預(yù)處理的廢棄生物質(zhì)。

步驟(1)所述的廢棄生物質(zhì)包括：水稻秸稈，玉米秸稈，小麥秸稈，甘蔗渣或柳枝稷等。

步驟(1)將廢棄生物質(zhì)粉碎后20-100目過篩，超純水清洗兩遍，于60℃烘干至恒重。

步驟(1)酸法預(yù)處理：將廢棄生物質(zhì)按固液比為1:10-1:20(g/ml)加入濃度為0.5-2.0％的硫酸溶液中，靜置于110-130℃恒溫環(huán)境反應(yīng)20～40min，過濾分離，所得固體用超純水清洗至ph呈中性，烘干至恒重，得到酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)。

步驟(2)木質(zhì)素降解菌強化預(yù)處理：將木質(zhì)素降解菌接種于含酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)的無菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1-3天后，過濾分離所得固體，用超純水清洗3次，烘干至恒重，得到細菌強化酸法預(yù)處理的廢棄生物質(zhì)。

步驟(2)所述木質(zhì)素降解菌培養(yǎng)條件為接種量5-15％(移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例)，溫度25-40℃，自然ph條件，培養(yǎng)時間1-3天。

步驟(2)所述的含酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)的無菌培養(yǎng)基為：酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)5～15g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.01g/l，feso4·7h2o0.015g/l，mnso4·h2o0.01g/l。

本發(fā)明提供的預(yù)處理方法的優(yōu)勢在于：

(1)利用木質(zhì)素降解菌預(yù)處理可實現(xiàn)酸法預(yù)處理廢棄生物質(zhì)中木質(zhì)素和半纖維素的深度去除，同時破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)變得松散多孔，大大增加了酶解糖化時的可及表面。

(2)由于木質(zhì)素具有天然異質(zhì)性、多變性和極強的穩(wěn)定性，當酸性條件較溫和時，木質(zhì)素難以高效去除，這不僅降低了糖純度，也給纖維素的后續(xù)酶解和生物轉(zhuǎn)化造成阻礙。但若改用較強的酸處理條件(如酸濃度高、溫度高、作用時間長等)，又提高了技術(shù)的藥耗和能耗，甚至易造成溶解木質(zhì)素的重新凝聚，沉積在纖維素的表面。此外，較高濃度的酸的體系中還會產(chǎn)生大量的酶抑制產(chǎn)物。這都不利于后續(xù)的酶解過程。因此，溫和的稀酸預(yù)處理是優(yōu)選方案，但還需對這一方法進行改進，本發(fā)明則很好的解決了這個問題。

(3)廢棄生物質(zhì)中的原生木質(zhì)素高度聚合，木質(zhì)素降解細菌作用時比純的堿木質(zhì)素要更加復(fù)雜，作用難度更大，本發(fā)明找尋了合適的培養(yǎng)基成分以及條件，最大程度的改善了廢棄生物質(zhì)的預(yù)處理效果。

(4)能夠大幅提高酶解糖化效率，相比于未經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素，酶解效率可比傳統(tǒng)酸法預(yù)處理提高了約60％。

(5)具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、二次污染小、處理時間短、成本低廉等優(yōu)點。

本發(fā)明所使用的木質(zhì)素降解菌(cupriavidusbasilensisb-8)，保藏編號cgmccno.4240，是由本申請人篩選的已經(jīng)做過專利保藏和專利申請的菌株。

附圖說明:

圖1：實施例中預(yù)處理后木質(zhì)纖維素糖產(chǎn)量變化；

圖2：實施例中預(yù)處理后木質(zhì)纖維素各組分變化；

圖3：實施例中預(yù)處理的木質(zhì)纖維素預(yù)處理前后掃描電鏡分析。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

(1)將水稻秸稈粉碎后60目過篩，超純水清洗兩遍，于60℃烘干至恒重。

(2)將水稻秸稈置于適當大小容器中，按固液比為1:10(g/ml)分別加入濃度為0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的硫酸溶液，并分別靜置于121℃恒溫環(huán)境中20、30和40min后，過濾分離得到濕渣a。

(3)用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的濕渣a，直至沖洗液ph呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣b。

(4)將保存在lb斜面的b-8菌體接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30℃溫度下，培養(yǎng)18h(即600nm處光密度達到0.8-1.0)，得到b-8的種子液；其中所述lb液體培養(yǎng)基各成分配比為：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1l；所述lb斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15g/l的瓊脂；

(5)將上一步所得到的b-8種子液在12000rpm條件下離心5分鐘，棄去上層清液，收集菌體；

(6)將收集的cupriavidusbasilensisb-8菌體按10％接種量(移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例)，接種于干渣b培養(yǎng)基中，于30℃溫度下，自然ph，培養(yǎng)3天，過濾分離得濕渣c；其中所述干渣b培養(yǎng)基各成分配比為：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4·7h2o0.015g，mnso4·h2o0.01g，蒸餾水1l；

(7)用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的濕渣c，置于60℃烘干至恒重得到干渣d；

(8)將干渣d按固液比1:40(g/ml)加入50mm檸檬酸緩沖液(ph＝4.8)及纖維素酶12pfu/g(水稻秸稈干重)，在50℃條件下，酶解24h，得到高純度糖。

實施例中各個反應(yīng)條件后的酶解效率如圖1所示，可以看出，木質(zhì)素降解菌cupriavidusbasilensisb-8處理后，其酶解效率普遍高于未處理(虛線)和單獨酸法預(yù)處理，最大可將單獨酸法(是指本發(fā)明的低強度酸法，而非高強度酸法)預(yù)處理的酶解效率提高62％，效果顯著。從組分測定結(jié)果來看(圖2)，cupriavidusbasilensisb-8的處理可去除廢棄生物質(zhì)中的半纖維素和木質(zhì)素。另外，cupriavidusbasilensisb-8處理后廢棄生物質(zhì)的表面形態(tài)發(fā)生了明顯變化，如圖3所示。未處理時表面光滑致密，酸法預(yù)處理后形成了大量的纖維素沉積物，這兩種形態(tài)都不利于后續(xù)的酶解，而cupriavidusbasilensisb-8處理后，原來的致密性結(jié)構(gòu)被徹底破壞，表面變得十分疏松多孔，內(nèi)部纖維素被充分暴露，這大大增加了后續(xù)酶解過程中酶的可及表面，從而顯著提高了預(yù)處理效率。

對比例1

對比例1僅采用酸法處理水稻秸稈。具體反應(yīng)條件為：

(1)將水稻秸稈粉碎后過篩，烘干至恒重。

(2)將水稻秸稈置于適當大小容器中，按固液比為2:100(g/ml)分別加入至濃度為1.0％的硫酸溶液，并靜置于120℃恒溫環(huán)境中60min后，過濾分離得到濕渣a。

(3)用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的濕渣a，直至沖洗液ph呈中性，烘干至恒重得干渣b。

(4)將干渣b按固液比1:40(g/ml)加入50mm檸檬酸緩沖液(ph＝4.8)及纖維素酶12pfu/g(水稻秸稈干重)，在50℃條件下，酶解24h，得到糖。

對比例1的酸法預(yù)處理后水稻秸稈的酶解效率是未處理的約3倍。

本發(fā)明實施例1中，當酸液濃度(1.0％)和反應(yīng)溫度(121℃)，縮短了反應(yīng)時間至20-40min，并提高了木質(zhì)纖維素和酸液的固液比(1:10g/ml)，b-8強化酸法預(yù)處理所得木質(zhì)纖維素的酶解效率是未處理的3.2-3.4倍，略高于對比例1中的效果。以上結(jié)果說明本發(fā)明不僅可降低酸法預(yù)處理的反應(yīng)強度，降低了藥耗和能耗，而且對木質(zhì)纖維素的酶解效率的提高也有一定的改善。

對比例2

對比例2采用真菌-酸法對水稻秸稈進行預(yù)處理，具體過程及反應(yīng)條件為：

(1)將水稻秸稈粉碎后過篩，烘干至恒重。

(2)按固液比為1:10(g/ml)分別加入至濃度為2.5～4.5％(體積分數(shù))的硫酸溶液，并靜置于121℃恒溫環(huán)境中60min后，過濾分離得到濕渣，用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的濕渣，直至沖洗液ph呈中性，烘干至恒重。

(3)將4株木質(zhì)素降解真菌(phanerochaetechrysosporium,pycnoporuscinnabarinus,rck-1,rck-3)在最優(yōu)生長條件下以步驟(2)得到的水稻秸稈作為碳源進行預(yù)處理，預(yù)處理時間為10d，用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的真菌處理后的水稻秸稈，并烘干至恒重得到干渣；

(4)將干渣按固液比1:40(g/ml)加入50mm檸檬酸緩沖液(ph＝4.8)及纖維素酶12pfu/g(水稻秸稈干重)，在50℃條件下，酶解24h，得到糖。

以上條件預(yù)處理后水稻秸稈的酶解效率最高僅能達到未處理水稻秸稈的約1.3倍。

本發(fā)明實施例1中采用的硫酸濃度(0.5-2.0％)低于對比例2，且酸處理時間(20-40min)和生物作用時間(3d)均縮短，cupriavidusbasilensisb-8強化酸法預(yù)處理所得木質(zhì)纖維素的酶解效率是未處理的2.7-3.4倍，遠高于對比例2的結(jié)果，說明本發(fā)明的細菌強化酸法預(yù)處理技術(shù)與當前真菌-酸法預(yù)處理技術(shù)相比，在預(yù)處理效果、預(yù)處理時間、藥耗和能耗等方面均具有較大優(yōu)勢。

對比例3

本對比例3中采用的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法，僅包括本發(fā)明細菌cupriavidusbasilensisb-8預(yù)處理過程，具體步驟如下：

(1)將水稻秸稈粉碎后60目過篩，超純水清洗兩遍，于60℃烘干至恒重得到干渣b。

(2)將保存在lb斜面的cupriavidusbasilensisb-8菌體接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30℃溫度下，培養(yǎng)18h，得到cupriavidusbasilensisb-8的種子液；其中所述lb液體培養(yǎng)基各成分配比為：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1l；所述lb斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15g/l的瓊脂；

(3)將上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8種子液在12000rpm條件下離心5分鐘，棄去上層清液，收集菌體；

(4)將收集的cupriavidusbasilensisb-8菌體按20％接種量(移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例)，接種于水稻秸稈培養(yǎng)基中，于30℃溫度下，自然ph，培養(yǎng)3天，過濾分離得濕渣；其中所述水稻秸稈培養(yǎng)基各成分配比為：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4·7h2o0.015g，mnso4·h2o0.01g，蒸餾水1l；

(5)用蒸餾水反復(fù)沖洗過濾分離得到的濕渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣c；

(6)將干渣c按固液比1:40(g/ml)加入50mm檸檬酸緩沖液(ph＝4.8)及纖維素酶12pfu/g(水稻秸稈干重)，在50℃條件下，酶解24h，得到糖。

經(jīng)本對比例預(yù)處理后的水稻秸稈的還原糖產(chǎn)量約為150mg/g，略高于未處理水稻秸稈(131mg/g)，但遠遠低于實施例1中的還原糖產(chǎn)量(352-443mg/g)。說明單獨采用cupriavidusbasilensisb-8預(yù)處理未能達到理想效果。而本發(fā)明在酸法預(yù)處理的基礎(chǔ)上，通過cupriavidusbasilensisb-8的作用產(chǎn)生了意想不到的效果。

對比例4

本對比例中采用的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法與實施例中的過程相同，僅將實施例步驟(6)中的大部分培養(yǎng)基成分改為與專利(申請?zhí)枺?01610569477.0)相同，以本發(fā)明實施例制備的干渣b10.0g/l，代替堿木質(zhì)素1-6g，其他組分為：(nh4)2so40.28g，k2hpo41g，mgso40.2g，cacl20.1g，feso40.05g，mnso40.02g，kh2po41g，蒸餾水1000ml。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用專利(申請?zhí)枺?01610569477.0)中的培養(yǎng)基條件后，細菌生物量顯著減少，預(yù)處理后的水稻秸稈的酶解效果僅約為實施例中的1/2。對比說明本發(fā)明經(jīng)過培養(yǎng)基成分和條件的篩選，得到了適合于本發(fā)明廢棄生物質(zhì)預(yù)處理的培養(yǎng)基成分和方法。