本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)乙醇的方法，特別涉及一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，屬于生物工程和能源領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

化石能源逐漸枯竭將影響世界能源供應(yīng)，解決此問(wèn)題的關(guān)鍵在于開(kāi)發(fā)可再生能源。以木質(zhì)纖維素為原料，高效地生產(chǎn)清潔燃料，如乙醇、丙醇、丁醇等，可以在一定程度上減少人類對(duì)化石能源的依賴。

過(guò)去，利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，要先將木質(zhì)纖維素糖化后，再對(duì)糖化后含單糖的水解液進(jìn)行發(fā)酵，這種方式稱為分步糖化發(fā)酵。分步糖化發(fā)酵的缺點(diǎn)是纖維素酶催化纖維素水解反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，而單糖的積累使得酶解反應(yīng)受到抑制，纖維素水解不充分。另外，發(fā)酵時(shí)，由于單糖濃度過(guò)高會(huì)使得發(fā)酵被抑制。為了防止酶解過(guò)程中糖積累抑制酶解，提高纖維素酶的催化水解效率，后來(lái)，人們提出了同步糖化發(fā)酵方式。同步糖化發(fā)酵是指木質(zhì)纖維素糖化和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇同時(shí)進(jìn)行，在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中，酶解產(chǎn)生的單糖被酵母同步轉(zhuǎn)化。在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中單糖濃度一直保持在較低水平。這樣，可以消除高濃度單糖對(duì)酶解的抑制作用。其中，李榮杰等在“一種利用秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法”的專利中，提供了一種木質(zhì)纖維素同步糖化、異構(gòu)化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。他們用稀酸或堿溶液對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理，然后將預(yù)處理秸稈放入發(fā)酵罐中，加入酶制劑，利用纖維素酶、木聚糖酶和木糖異構(gòu)酶預(yù)水解秸稈，之后，按15％接種量接種od600為6的釀酒酵母種子液，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，最終，乙醇的產(chǎn)率為53.2％(cn101705255a)；魯杰等在“利用木質(zhì)纖維素分批補(bǔ)料半同步糖化發(fā)酵制備乙醇的方法”的專利中，先將木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理木質(zhì)纖維素、纖維素酶液加入到錐形瓶，搖床振蕩預(yù)水解，之后，降溫，加入活化后的酵母液，同步糖化發(fā)酵，所得的乙醇的產(chǎn)率最高為79.1％(cn103074385a)。

同步糖化發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是一個(gè)將木質(zhì)纖維素酶解成單糖和單糖發(fā)酵成乙醇的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于提高木質(zhì)纖維素酶解效率的研究很多，主要方法是通過(guò)復(fù)配纖維素酶以及增加酶的使用量來(lái)提高酶解效率(陳朝儒，奚亞軍。甜高粱莖汁及莖渣同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化。2016，32(3)：253-258；羅鵬。蒸汽爆破麥草同步糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的研究。2007，35(12)：42-45；張偉。小麥秸稈同步糖化發(fā)酵制取燃料乙醇。2012，38(12)：50-54)，而對(duì)于酵母發(fā)酵單糖生產(chǎn)乙醇效率方面的研究則長(zhǎng)期被忽視。在傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵過(guò)程中，利用木質(zhì)纖維素作為底物同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，由于酵母量低，致使酵母利用葡萄糖生產(chǎn)乙醇速率低，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，使得生產(chǎn)成本增加。提高同步糖化發(fā)酵體系中初始酵母量，以提高單糖發(fā)酵成乙醇速率方面的研究，在國(guó)內(nèi)外尚屬空白。

另外，在傳統(tǒng)的同步糖化發(fā)酵過(guò)程中，生產(chǎn)酵母種子液和同步糖化發(fā)酵分別在兩個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行。一般地，在一個(gè)生物反應(yīng)器中生產(chǎn)酵母種子液后，將酵母接種到另外一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。而在這種方式中，由于使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，因此生產(chǎn)成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是在于解決同步糖化發(fā)酵過(guò)程中酵母量不足的問(wèn)題，提出在生物反應(yīng)器中，先在好氧條件下高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母，然后向生物反應(yīng)器中添加木質(zhì)纖維素和酶制劑，在厭氧條件下同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。采用本方法，乙醇產(chǎn)率大幅度提高，發(fā)酵時(shí)間大幅度縮短。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是針對(duì)傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵方式的不足，即生產(chǎn)酵母種子液與同步糖化發(fā)酵分別在兩個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行。使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，成本高，過(guò)程繁瑣。而采用本發(fā)明，培養(yǎng)酵母種子液和同步糖化發(fā)酵在一個(gè)生物反應(yīng)器中完成，減少了設(shè)備投資，提高了生產(chǎn)效率。

本發(fā)明提供了一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵制備乙醇的方法(見(jiàn)圖1)，所述方法包括如下步驟：

①酵母高密度發(fā)酵

向生物反應(yīng)器中加入含有10-100克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按2％-10％接種量接種酵母。通氣，28-37℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到2克/升以下后，流加50-800克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母。

②同步糖化發(fā)酵

當(dāng)發(fā)酵液中酵母濃度達(dá)到5-150克干重/升后，向發(fā)酵液中加入10-300克木質(zhì)纖維素/(升發(fā)酵液)以及酶制劑。停止通氣，進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵，發(fā)酵12-144小時(shí)，生產(chǎn)乙醇。

本發(fā)明所述通氣為通入空氣或氧氣。

本發(fā)明所述葡萄糖是商品葡萄糖或由木質(zhì)纖維素水解所得的葡萄糖水解液。

本發(fā)明所述木質(zhì)纖維素為秸稈、木片、稻草、棉花、紙漿、蘆葦、微晶纖維素或羧甲基纖維素的一種或多種。

本發(fā)明所述酶制劑含有5-100iu纖維素酶/(克纖維素)，5-300u木聚糖酶/(克纖維素)，1-300u果膠酶/(克纖維素)，1-300uβ-葡萄糖苷酶/(克纖維素)。

本發(fā)明的有益效果是采用酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論產(chǎn)率的99％以上，乙醇峰值時(shí)間從傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72小時(shí)提前到24小時(shí)，極大地縮短了發(fā)酵時(shí)間。而且，在本發(fā)明中，將生產(chǎn)酵母種子液和同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇在一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低了生產(chǎn)成本。

附圖說(shuō)明：

圖1為酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵工藝的比較圖

具體實(shí)施方式：

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

下述實(shí)施例和對(duì)比例中，所使用試劑制備方法如下：

1、本實(shí)施例所用培養(yǎng)基為每升含有：酵母粉10克，蛋白胨20克。

2、本實(shí)施例所用木質(zhì)纖維素為玉米秸稈。

3、本實(shí)施例所用酵母為哈爾濱馬利酵母有限公司生產(chǎn)的酵母。

實(shí)施例1：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應(yīng)器中加入含有10克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按5％接種量接種酵母。通氣，28℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加500克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當(dāng)發(fā)酵液中酵母濃度達(dá)到30克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶和30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時(shí)后，乙醇濃度達(dá)到最大16.81g/l，相當(dāng)于理論產(chǎn)率的99％。

實(shí)施例2：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應(yīng)器中加入含有20克/升葡萄糖的培養(yǎng)基，滅菌后，按10％接種量接種酵母。通氣，30℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加600克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當(dāng)發(fā)酵液中酵母濃度達(dá)到35克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈、25fpu/(克纖維素)的纖維素酶，50u/(克纖維素)的木聚糖酶，20u/(克纖維素)果膠酶和50u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時(shí)后，乙醇濃度達(dá)到最大16.98g/l，相當(dāng)于理論產(chǎn)率的100％。

實(shí)施例3：

一種酵母高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

1)酵母高密度發(fā)酵

向生物反應(yīng)器中加入終濃度為10克/升葡萄糖的秸稈水解液和培養(yǎng)基，滅菌后，按5％接種量接種酵母。通氣，30℃發(fā)酵培養(yǎng)酵母，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低到1克/升后，流加500克/升的葡萄糖溶液，高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母。

2)同步糖化發(fā)酵

當(dāng)發(fā)酵液中酵母濃度達(dá)到40克干重/升后，向發(fā)酵液中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶和30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶。停止通氣，進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵24小時(shí)后，乙醇濃度達(dá)到最大16.98g/l，相當(dāng)于理論產(chǎn)率的100％。

對(duì)比例1：

一種傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將酵母按5％接種量接種到生物反應(yīng)器a中，28℃培養(yǎng)酵母，生產(chǎn)酵母種子液。

(2)向生物反應(yīng)器b中加入3％纖維素含量的秸稈，15fpu/(克纖維素)的纖維素酶，10u/(克纖維素)的木聚糖酶，5u/(克纖維素)果膠酶，30u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶和ph5.0檸檬酸緩沖液。從生物反應(yīng)器a中取酵母種子液，按10％接種量接種到生物反應(yīng)器b中，酵母濃度為1克干重/升。進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵72小時(shí)后，乙醇濃度達(dá)到最大11.01g/l，相當(dāng)于理論產(chǎn)率的65％。

結(jié)論：

由實(shí)施例1和對(duì)比例1的結(jié)果可以看出，與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇相比，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵明顯地增加了乙醇的濃度，使得乙醇濃度增加了34％。此外，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵使得產(chǎn)乙醇的峰值時(shí)間由傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72h提前到24h，明顯地縮短了發(fā)酵時(shí)間。

對(duì)比例2：

一種傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將酵母按5％接種量接種到生物反應(yīng)器a中，30℃培養(yǎng)酵母，生產(chǎn)酵母種子液。

(2)向生物反應(yīng)器b中加入3％纖維素含量的秸稈、25fpu/(克纖維素)的纖維素酶，50u/(克纖維素)的木聚糖酶，20u/(克纖維素)果膠酶，50u/(克纖維素)的β-葡萄糖苷酶和ph5.0檸檬酸緩沖液。從生物反應(yīng)器a中取酵母種子液，按10％接種量接種到生物反應(yīng)器b中，酵母濃度為1克干重/升。進(jìn)行厭氧同步糖化發(fā)酵。在發(fā)酵72小時(shí)后，乙醇濃度達(dá)到最大13.12g/l，相當(dāng)于理論產(chǎn)率的77％。

由實(shí)施例2和對(duì)比例2的結(jié)果可以看出，與傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇相比，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵明顯地增加了乙醇的濃度，使得乙醇濃度增加了23％。此外，采用高密度發(fā)酵耦合同步糖化發(fā)酵使得產(chǎn)乙醇的峰值時(shí)間由傳統(tǒng)同步糖化發(fā)酵的72h提前到24h，明顯地縮短了發(fā)酵時(shí)間。