本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法及其活性制品。
背景技術(shù)：
滇橄欖又名余甘子，余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子（phyllanthusemblical）的果實，別名油柑子，橄欖子（四川），滇橄欖（云南），青果等?！短票静荨贩Q之為庵摩勒，余甘，《南方草木狀》謂“樹葉細，似合昏，花黃，食似李，青黃色，核圓作六七棱，食之先苦后甜”，《本草綱目》稱之為庵摩落迦果，載有“其味初食苦澀，良久更甘，故曰余甘”。
余甘子為一種常用藏藥，與訶子，毛訶子三者在藏藥中常被稱為“三大果”使用頻率很高，在《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》所載的290種藏藥成藥中，含余甘子的有72種，占總數(shù)的25%，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)1995年版藏藥標(biāo)準(zhǔn)所載200種成藥中，有59種含余甘子，占29%，余甘子被載入《中國藥典》1977年版一部。
余甘子果實味酸微澀，清熱涼血，消食健脾，生津止渴。主治血熱血瘀，消化不良，腹脹，咳嗽，喉痛，口干及維生素c缺乏癥。在藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等。近年研究結(jié)果表明，余甘子具有抗炎，抗氧化，抗衰老，保肝等作用。
果實(余甘子)：甘、微澀，涼。清熱利咽，潤肺止咳。用于感冒發(fā)熱，咽喉痛，咳嗽，口千煩渴，耳痛，維生素丙缺乏癥。根(油柑根)：辛，寒。有毒。消食，利水，化痰，殺蟲。用于高血壓癥，胃痛，泄瀉，瘰疬。葉(油柑葉)：辛、平。祛濕利尿。用于水腫，皮膚濕疹。樹皮(油柑木皮)：甘、酸，寒。殺菌祛腐，止血。用于口瘡，療瘡，痔瘡，陰囊濕疹，外傷出血。樹枝的蟲癭(油柑蟲節(jié))：用于胃痛，疝氣，遺精，小兒疳積，牙痛。
但是目前對滇橄欖的食用方式還只停留于直接食用或榨汁以果汁的方式飲用，食用方式比較單調(diào)，滇橄欖中多酚類物質(zhì)含量高，在滇橄欖加工領(lǐng)域內(nèi)，大多都是滇橄欖果汁和飲料，基本上都是利用新鮮滇橄欖榨汁后調(diào)制而成，從而導(dǎo)致滇橄欖渣大量浪費，利用效率不高。因此，亟待開發(fā)一種滇橄欖的高濃縮發(fā)酵方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，能夠充分利用滇橄欖資源，提供一種高效率、低成本、純度高且易于推廣的滇橄欖多酚活性物質(zhì)制備方法，并提供一種能夠改善人體免疫功能，提高免疫力的滇橄欖多酚制品。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，包括如下步驟：
（1）原料預(yù)處理：滇橄欖的新鮮果實為原料，用水清洗干凈，放入含0.1％檸檬酸的沸水中熱燙4min，冷卻，破碎去核，加1∶1的水打漿，果漿經(jīng)真空干燥，粉碎過40目篩得滇橄欖果肉粉；
（2）將步驟（1）制得滇橄欖果肉粉按料液比1:4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)3-6天，然后加入裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物以及植物內(nèi)生菌，使裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物的濃度為0.15-0.85mg/ml，植物內(nèi)生菌的濃度為1.9×106cfu/ml-4.6×107cfu/ml然后繼續(xù)培養(yǎng)1-4天，分離，得到滇橄欖果肉粉發(fā)酵液；
（3）從步驟（2）制得的發(fā)酵液中提取滇橄欖多酚；
所述步驟（2）中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法為：
取經(jīng)過清洗的裂壺藻原料，設(shè)定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應(yīng)時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結(jié)束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調(diào)節(jié)ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分?jǐn)?shù)1%的mrs培養(yǎng)基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置，進行發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)物；
所述植物內(nèi)生菌的提取方法為：采用組織塊法，取新鮮反枝莧的根、莖、葉分別洗凈至沒有明顯的雜質(zhì)，，表面消毒處理后，接種至pda（分離內(nèi)生真菌）和高氏一號培養(yǎng)基（分離內(nèi)生放線菌）上培養(yǎng)7-10d，然后分離單菌落；從活化斜面中挑取菌絲塊接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，置28℃，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d；發(fā)酵培養(yǎng)物除去菌體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，55℃減壓濃縮蒸干，即為菌液粗提物；離心和過濾得到的菌體，用適量95%乙醇冷凝回流3次，合并乙醇相，減壓濃縮蒸干，即為菌體粗提物；置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離5-10min。
進一步的，所述步驟（3）中提取滇橄欖多酚的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發(fā)酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取上清液，冷凍干燥后制得滇橄欖多酚。
本發(fā)明以滇橄欖為原料，采用非常規(guī)技術(shù)高效、快速的從中提取高品質(zhì)的多酚類物質(zhì)。本發(fā)明充分利用了滇橄欖多酚是水溶性物質(zhì)，先通過裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物和植物內(nèi)生菌對果肉成分發(fā)酵，充分釋放出滇橄欖內(nèi)部的多酚類活性物質(zhì)，在利用多酚的水溶性隨溫度的升高而增大的特性，先用沸水熱燙；采用設(shè)定濃度的乙醇溶液對多酚與其他多糖類物質(zhì)之間相互締合所形成的氫鍵和疏水鍵具有較好的阻斷作用，而且乙醇對多酚具有較高的溶解性，對蛋白質(zhì)、多糖等的溶解性較低，減少了提取物中的雜質(zhì)，同時提高了提取速度和效果。與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，具有操作簡便、提取速度快、效率高、耗能少、純度高等優(yōu)點，同時本發(fā)明加工過程中，還可減少對產(chǎn)品的污染和熱敏性物質(zhì)的分解。
一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚40-50，氯化鉀1-3，山梨糖醇5-8，檸檬酸鈉2-4，白砂糖10-30，血蛤酶解產(chǎn)物11-15，蒼術(shù)提取物9-13，碳酸氫鈉2-6，獼猴桃香精0.3-0.5，乳酸鈣3-5，水50-120。
進一步的，所述滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚43，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物13，蒼術(shù)提取物11，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。
本發(fā)明中，所述血蛤酶解產(chǎn)物的制備方法為：s1.取取血蛤全臟器，使料水比為1:3(w/v)，用2mol/l鹽酸將溶液ph值調(diào)至2.5以呈現(xiàn)胃部酸堿環(huán)境，以酶與底物濃度比為1300u/g加入胃蛋白酶，在恒溫水浴振蕩器中保持37℃、110r/min振蕩酶解2h，在此條件下獲得經(jīng)胃蛋白酶酶解的初產(chǎn)物；s2.用2mol/l的氫氧化鈉將經(jīng)胃蛋白酶酶解后的酶解液ph值調(diào)至8.5，保持37℃酶解溫度，復(fù)合酶添加量為5200u/g，所述復(fù)合酶中胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的質(zhì)量比為5:1，所述料水比1:4.5，酶解時間為3.5h，酶解結(jié)束后，在100℃沸水浴中滅酶10min；將s2中的酶解產(chǎn)物通過真空冷凍干燥，設(shè)置干燥條件為預(yù)冷溫度-30℃,預(yù)冷時間2h，加熱溫度從-10℃開始18h后緩慢升溫,達到25℃,并保持到干燥終點，得到血蛤酶解產(chǎn)物。
所述蒼術(shù)提取物的制備方法為：采用有機溶劑冷浸提取法對蒼術(shù)分別進行提取。將植物材料放在60℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至脆，置于植物粉碎機中粉碎后，過篩(0.45mm)2次。稱取100g植物干粉，倒入1000ml三角瓶中，再加入5倍量甲醇，浸泡24h，每隔12h攪拌2-3次，24h后抽濾。進行第2次浸提，抽濾，將2次得到的濾液合并，65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，得到的膏狀物即植物粗提物，稱質(zhì)量，置于4℃冰箱中密封保存，備用。
特別的，實際生產(chǎn)過程中，本發(fā)明的血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物可等量放大進行生產(chǎn)制備。
本發(fā)明原材料易于采購，制作簡單；并富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素與礦物質(zhì)；便于攜帶，方便食用，快速消除饑餓感，口感柔和，味道獨特；適宜各個年齡段人群食用。本發(fā)明經(jīng)驗證，長久食用可達到增強免疫力的效果，基于本發(fā)明中的活性組分采用模擬人體胃腸消化的方式制得，配合從植物體內(nèi)提取出的活性組分并結(jié)合進入腸道內(nèi)，一方面可以在腸道內(nèi)定殖，維持腸道微生物菌群的平衡；另一方面是滇橄欖多酚與血蛤酶解產(chǎn)物以及蒼術(shù)提取物共同作用于宿主的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道免疫，并刺激胸腺，脾臟等免疫器官，促進巨噬細胞活性，通過增強b、t淋巴細胞對抗原刺激的反應(yīng)性，發(fā)揮特異性免疫活性，從而增強機體的免疫功能，易于被人體吸收，條件95%人群長期服用無不適癥狀。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，包括如下步驟：
（1）原料預(yù)處理：滇橄欖的新鮮果實為原料，用水清洗干凈，放入含0.1％檸檬酸的沸水中熱燙4min，冷卻，破碎去核，加1∶1的水打漿，果漿經(jīng)真空干燥，粉碎過40目篩得滇橄欖果肉粉；
（2）將步驟（1）制得滇橄欖果肉粉按料液比1:4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)3天，然后加入裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物以及植物內(nèi)生菌，使裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物的濃度為0.15mg/ml，植物內(nèi)生菌的濃度為4.6×107cfu/ml然后繼續(xù)培養(yǎng)4天，分離，得到滇橄欖果肉粉發(fā)酵液；
（3）從步驟（2）制得的發(fā)酵液中提取滇橄欖多酚；
所述步驟（2）中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法為：
取經(jīng)過清洗的裂壺藻原料，設(shè)定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應(yīng)時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結(jié)束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調(diào)節(jié)ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分?jǐn)?shù)1%的mrs培養(yǎng)基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置，進行發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)物；
所述植物內(nèi)生菌的提取方法為：采用組織塊法，取新鮮反枝莧的根、莖、葉分別洗凈至沒有明顯的雜質(zhì)，，表面消毒處理后，接種至pda（分離內(nèi)生真菌）和高氏一號培養(yǎng)基（分離內(nèi)生放線菌）上培養(yǎng)7-10d，然后分離單菌落；從活化斜面中挑取菌絲塊接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，置28℃，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d；發(fā)酵培養(yǎng)物除去菌體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，55℃減壓濃縮蒸干，即為菌液粗提物；離心和過濾得到的菌體，用適量95%乙醇冷凝回流3次，合并乙醇相，減壓濃縮蒸干，即為菌體粗提物；置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離5-10min。
進一步的，所述步驟（3）中提取滇橄欖多酚的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發(fā)酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取上清液，冷凍干燥后制得滇橄欖多酚。
本發(fā)明以滇橄欖為原料，采用非常規(guī)技術(shù)高效、快速的從中提取高品質(zhì)的多酚類物質(zhì)。本發(fā)明充分利用了滇橄欖多酚是水溶性物質(zhì)，其水溶性隨溫度的升高而增大的特性，先用沸水熱燙；采用設(shè)定濃度的乙醇溶液對多酚與其他多糖類物質(zhì)之間相互締合所形成的氫鍵和疏水鍵具有較好的阻斷作用，而且乙醇對多酚具有較高的溶解性，對蛋白質(zhì)、多糖等的溶解性較低，減少了提取物中的雜質(zhì)，同時提高了提取速度和效果。與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，具有操作簡便、提取速度快、效率高、耗能少、純度高等優(yōu)點，同時本發(fā)明加工過程中，還可減少對產(chǎn)品的污染和熱敏性物質(zhì)的分解。
實施例2
一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）原料預(yù)處理：滇橄欖的新鮮果實為原料，用水清洗干凈，放入含0.1％檸檬酸的沸水中熱燙4min，冷卻，破碎去核，加1∶1的水打漿，果漿經(jīng)真空干燥，粉碎過40目篩得滇橄欖果肉粉；
（2）將步驟（1）制得滇橄欖果肉粉按料液比1:4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)6天，然后加入裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物以及植物內(nèi)生菌，使裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物的濃度為0.15mg/ml，植物內(nèi)生菌的濃度為1.9×106cfu/mll然后繼續(xù)培養(yǎng)1天，分離，得到滇橄欖果肉粉發(fā)酵液；
（3）從步驟（2）制得的發(fā)酵液中提取滇橄欖多酚。
實施例3
一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）原料預(yù)處理：滇橄欖的新鮮果實為原料，用水清洗干凈，放入含0.1％檸檬酸的沸水中熱燙4min，冷卻，破碎去核，加1∶1的水打漿，果漿經(jīng)真空干燥，粉碎過40目篩得滇橄欖果肉粉；
（2）將步驟（1）制得滇橄欖果肉粉按料液比1:4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)4天，然后加入裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物以及植物內(nèi)生菌，使裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物的濃度為0.3mg/ml，植物內(nèi)生菌的濃度為7.5×106cfu/ml然后繼續(xù)培養(yǎng)4天，分離，得到滇橄欖果肉粉發(fā)酵液；
（3）從步驟（2）制得的發(fā)酵液中提取滇橄欖多酚。
實施例4
一種滇橄欖多酚的高濃縮發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）原料預(yù)處理：滇橄欖的新鮮果實為原料，用水清洗干凈，放入含0.1％檸檬酸的沸水中熱燙4min，冷卻，破碎去核，加1∶1的水打漿，果漿經(jīng)真空干燥，粉碎過40目篩得滇橄欖果肉粉；
（2）將步驟（1）制得滇橄欖果肉粉按料液比1:4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)3-6天，然后加入裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物以及植物內(nèi)生菌，使裂壺藻發(fā)酵蛋白產(chǎn)物的濃度為0.15-0.85mg/ml，植物內(nèi)生菌的濃度為2.4×107cfu/ml然后繼續(xù)培養(yǎng)2天，分離，得到滇橄欖果肉粉發(fā)酵液；
（3）從步驟（2）制得的發(fā)酵液中提取滇橄欖多酚。
實施例5
一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚43，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物13，蒼術(shù)提取物11，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。
本發(fā)明中，所述血蛤酶解產(chǎn)物的制備方法為：s1.取取血蛤全臟器，使料水比為1:3(w/v)，用2mol/l鹽酸將溶液ph值調(diào)至2.5以呈現(xiàn)胃部酸堿環(huán)境，以酶與底物濃度比為1300u/g加入胃蛋白酶，在恒溫水浴振蕩器中保持37℃、110r/min振蕩酶解2h，在此條件下獲得經(jīng)胃蛋白酶酶解的初產(chǎn)物；s2.用2mol/l的氫氧化鈉將經(jīng)胃蛋白酶酶解后的酶解液ph值調(diào)至8.5，保持37℃酶解溫度，復(fù)合酶添加量為5200u/g，所述復(fù)合酶中胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的質(zhì)量比為5:1，所述料水比1:4.5，酶解時間為3.5h，酶解結(jié)束后，在100℃沸水浴中滅酶10min；將s2中的酶解產(chǎn)物通過真空冷凍干燥，設(shè)置干燥條件為預(yù)冷溫度-30℃,預(yù)冷時間2h，加熱溫度從-10℃開始18h后緩慢升溫,達到25℃,并保持到干燥終點，得到血蛤酶解產(chǎn)物。
所述蒼術(shù)提取物的制備方法為：采用有機溶劑冷浸提取法對蒼術(shù)分別進行提取。將植物材料放在60℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至脆，置于植物粉碎機中粉碎后，過篩(0.45mm)2次。稱取100g植物干粉，倒入1000ml三角瓶中，再加入5倍量甲醇，浸泡24h，每隔12h攪拌2-3次，24h后抽濾。進行第2次浸提，抽濾，將2次得到的濾液合并，65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，得到的膏狀物即植物粗提物，稱質(zhì)量，置于4℃冰箱中密封保存，備用。
特別的，實際生產(chǎn)過程中，本發(fā)明的血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物可等量放大進行生產(chǎn)制備。
本發(fā)明原材料易于采購，制作簡單；并富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素與礦物質(zhì)；便于攜帶，方便食用，快速消除饑餓感，口感柔和，味道獨特；適宜各個年齡段人群食用。本發(fā)明經(jīng)驗證，長久食用可達到增強免疫力的效果，基于本發(fā)明中的活性組分采用模擬人體胃腸消化的方式制得，配合從植物體內(nèi)提取出的活性組分并結(jié)合進入腸道內(nèi)，一方面可以在腸道內(nèi)定殖，維持腸道微生物菌群的平衡；另一方面是滇橄欖多酚與血蛤酶解產(chǎn)物以及蒼術(shù)提取物共同作用于宿主的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道免疫，并刺激胸腺，脾臟等免疫器官，促進巨噬細胞活性，通過增強b、t淋巴細胞對抗原刺激的反應(yīng)性，發(fā)揮特異性免疫活性，從而增強機體的免疫功能，易于被人體吸收，條件95%人群長期服用無不適癥狀。
實施例6
本實施例提供一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚40，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物11，蒼術(shù)提取物9，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。本實施例中滇橄欖多酚、血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物的成分及制備方式與實施例5一致。
實施例7
本實施例提供一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚50，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物15，蒼術(shù)提取物13，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。本實施例中滇橄欖多酚、血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物的成分及制備方式與實施例5一致。
實施例8
本實施例提供一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚50，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物15，蒼術(shù)提取物9，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。
本實施例中滇橄欖多酚、血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物的成分及制備方式與實施例5一致。
實施例9
本實施例提供一種滇橄欖多酚活性制品，由以下重量份計組分組成：滇橄欖多酚40，氯化鉀2，山梨糖醇6，檸檬酸鈉3，白砂糖14，血蛤酶解產(chǎn)物11，蒼術(shù)提取物13，碳酸氫鈉4，獼猴桃香精0.4，乳酸鈣4，水78。
本實施例中滇橄欖多酚、血蛤酶解產(chǎn)物、蒼術(shù)提取物的成分及制備方式與實施例5一致。
效果實施例
1.增強免疫力效果實驗
將通過實施例5制得的活性制品濃縮脫水干燥，制備成粉末狀，作為測試樣品。
對照品：天美健牌大豆肽蛋白粉；來源：北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司；成人臨床推薦用量：0.167g.kg-1.d-1。
受試動物品系和級別：balb/c小鼠，hartley豚鼠，spf級；數(shù)量及性別：balb/c小鼠60只，雄性；hartley豚鼠6只，均可。購入體重balb/c小鼠17-19g，hartley豚鼠250-350g。由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：syxk（粵）2013-0002。實驗期間，小鼠自由進食飲水，每天觀察小鼠狀態(tài)。
根據(jù)樣品的基本情況進行劑量設(shè)計，樣品低、中、高按成人臨床用量的5倍、10倍、20倍設(shè)計劑量，分別為0.15g.kg-1.d-1、0.30g.kg-1.d-1、0.60g.kg-1.d-1；陽性對照組劑量按成人推薦劑量的5倍設(shè)計，為0.835g.kg-1.d-1。將60只雄性小鼠隨機各分為5組（陰性對照組、陽性對照組、受試樣品低、中、高劑量組），每組12只，其中2只作為備用動物。各組小鼠每天按0.1ml/10g體重灌胃相應(yīng)樣品液，陰性對照組給予等量純凈水，每天1次，連續(xù)給藥30天。試驗開始、試驗結(jié)束均稱量體重1次，試驗期間每周稱量體重1次。
1.1小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗
末次給藥1h，無菌取脾置于盛有rpmi-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，并放置200目篩網(wǎng)，用注射器活塞在其上方研磨制成脾細胞懸液，分裝脾細胞懸液至加有淋巴細胞分離液的離心管中。400g，20℃下離心20min，離心完畢，取出離心管中淋巴細胞層離心管，加入rpmi-1640培養(yǎng)液洗滌數(shù)次，250g，4℃下離心10min。洗滌完畢后，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻，用臺盼蘭染色計數(shù)保證95%以上活細胞率，將細胞濃度調(diào)整為3×106個/ml。
將每份脾細胞懸液分兩孔加入48孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml，一孔加25ulcona液（相當(dāng)于5ug/ml），另一孔作為對照，置于5%co2,37℃co2孵箱中培養(yǎng)48h后每孔輕輕吸去上清液0.3ml，加入0.3mlrpmi-1640培養(yǎng)液，同時加入cck8試劑50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2h。結(jié)束培養(yǎng)后，吹打均勻，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔作3個平行實驗，用酶標(biāo)儀測450nm波長下的光密度值。淋巴細胞的增殖能力由加cona孔的光密度值與不加cona孔的光密度值的差值表示。
1.2小鼠體液免疫功能（血清溶血素）影響
給藥25天，用生理鹽水洗滌(2000r/min，10min)已脫纖維的羊血3次，在壓積srbc中加入生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只小鼠腹腔注射0.2ml，第30天時，給藥1h后，稱重，所有小鼠摘除眼球取血0.8ml于離心管，靜置1h，離心2000r/min，10min，收集血清。頸椎脫臼處死小鼠。用sa緩沖液稀釋300倍的血清取1ml置試管內(nèi)，再一次加入10%（v/v）srbc0.5ml、用sa緩沖液稀釋9倍的補體1ml，設(shè)置對照管（用sa代替血清），37℃恒溫水浴20min，再冰浴，然后離心2000r/min，10min。取上清液1ml于新試管，加3.75ml都氏試劑、0.25ml10%（v/v）srbc，充分混勻，靜置10min，以對照管為空白，540nm處分別測定各管光密度值，溶血素的量以半數(shù)溶血值（hc50）表示。
1.3小鼠體液免疫（抗體生成細胞）的影響
給藥25天，用生理鹽水洗滌已脫纖維的羊血3次，每次離心2000r/min，10min，在壓積srbc中加入生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只小鼠腹腔注射0.2ml，第30天時，給藥1h后，稱重。頸椎脫臼處死小鼠后，取出脾臟，置于放有hank’s液平皿中，經(jīng)過200目篩網(wǎng)過濾后，再用hank’s液洗滌兩次，加入到5mlrpmi-1640培養(yǎng)液中將細胞懸浮，計數(shù)細胞，且調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml。
將1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml形成的表層培養(yǎng)基加熱溶解后，40-45℃水浴保溫.與ph7.2-7.4、2倍hank’s液等體積混合，搖勻，每管0.5ml分裝不同的試管，繼續(xù)向每管加入用sa緩沖液配制成的10％srbc(v/v）50ul和脾細胞懸液20ul，快速混勻，傾倒于涂有一層薄薄的瓊脂糖的薄片上，做平行片，等到瓊脂糖凝固后，將薄片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-1.5h后，將用sa緩沖液稀釋了9倍的補體加到玻片架的凹槽內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)1-1.5h，然后計數(shù)溶血空斑數(shù)。
1.4小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能及免疫器官影響的測定
末次給藥1h，按體重從尾靜脈注射用生理鹽水1:3稀釋的印度墨汁（10ml/kg），待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10min，分別從眼眶靜脈叢采血20μl，并立即加到2ml0.1％na2co3溶液中，以na2co3溶液作空白對照，用分光光度計在600nm波長處測定光密度值（od），計算吞噬指數(shù)a。
小鼠采血后脫臼處死，解剖取肝臟、脾臟和胸腺，濾紙吸干臟器周圍血液后，精密稱重，計算臟器/體重比值。
1.5nk細胞活性測定
末次給藥1h，無菌取脾，無菌取脾置于盛有rpmi-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，并放置200目篩網(wǎng)，用注射器活塞在其上方研磨制成脾細胞懸液，分裝脾細胞懸液至加有淋巴細胞分離液的離心管中。400g，20℃下離心20min，離心完畢，取出離心管中淋巴細胞層離心管，加入rpmi-1640培養(yǎng)液洗滌數(shù)次，250g，4℃下離心10min。洗滌完畢后，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻，用臺盼蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），最后用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×107個/ml。
按比例將效應(yīng)細胞和靶細胞（50:1）各100ul加入u型96孔板；靶細胞和培養(yǎng)液各100ul加入靶細胞自然釋放孔；靶細胞和0.25%triton各100ul加入靶細胞最大釋放孔。每組均設(shè)3個平行孔，37℃,5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，離心1500rpm,5min。每孔吸取上清液100ul于平底96孔板，加入ldh基質(zhì)液100ul/孔，反應(yīng)3-10min，加入1mol/mlhcl30ul/孔，酶標(biāo)490nm測定光密度值。
所有數(shù)據(jù)采用spss16.0軟件進行統(tǒng)計分析，測試結(jié)果如下表所示。
表1實施例樣品與對照組對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響
注：采用方差分析方法進行統(tǒng)計分析，與陰性對照組比較，”a”:p<0.05;與陽性對照組比較,“b”:p<0.01
表2實施例樣品與對照組對小鼠抗體水平（血清溶血素）的影響
注：采用方差分析方法進行統(tǒng)計分析，與陰性對照組比較，”a”:p<0.05;與陽性對照組比較,“b”:p<0.01表3實施例樣品與對照組對小鼠溶血空斑數(shù)的影響
注：采用方差分析方法進行統(tǒng)計分析，與陰性對照組比較，”a”:p<0.05;與陽性對照組比較,“b”:p<0.01。
表4實施例樣品與對照組對小鼠吞噬指數(shù)的影響
注：采用方差分析方法進行統(tǒng)計分析，與陰性對照組比較，”a”:p<0.05;與陽性對照組比較,“b”:p<0.01。
表6實施例樣品與對照組對小鼠nk細胞活性的影響
注：采用方差分析方法進行統(tǒng)計分析，與陰性對照組比較，”a”:p<0.05;與陽性對照組比較,“b”:p<0.01。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。本發(fā)明中所未詳細描述的技術(shù)細節(jié)，均可通過本領(lǐng)域中的任一現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)。特別的，本發(fā)明中所有未詳細描述的技術(shù)特點均可通過任一現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)。