專利名稱：一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，屬于生物醫(yī)藥和食品應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
國際微生物學(xué)會(IAMS)研究提出，優(yōu)良的食品用防腐劑具有以下特性:①不僅僅抑制微生物生長和繁殖，最好能將其殺滅。如果添加后防腐劑能分解更佳具有抑制微生物的作用，若能殘存而延續(xù)其作用至食品被消費之前或第二次加工之前亦可用與加熱處理同時使用者，應(yīng)具有對熱的抵抗性；④其適應(yīng)條件與在同樣條件下食品可生長的微生物一致。目前很少有在PH5 7范圍有效的防腐劑；⑤在其適用條件下，應(yīng)同時對食物中毒病原性細(xì)菌及腐敗性細(xì)菌均具有抑制效果；⑥為取代熱處理的全部或一部分而使用的防腐劑應(yīng)有如一般熱處理一樣的防制肉毒桿菌的安全措施；⑦不與食品產(chǎn)生反應(yīng)以致消失，不因食品中相反作用的藥劑而失去活性，在實際濃度下，不會被可能增殖到一定數(shù)量的微生物或其代謝物所破壞；⑧食品用防腐劑不應(yīng)促進抗藥性微生物的生長，能促進的應(yīng)限用于這些抗藥性微生物無法侵入的食品中。這兩種情形應(yīng)考慮互抗性用于藥品中或飼料添加物中的防腐劑，應(yīng)排除其使用于食品中。我國對防腐劑的使用有著嚴(yán)格的規(guī)定，明確防腐劑應(yīng)該符合以下要求:①限量內(nèi)合理使用對人體健康無害；②不影響消化道菌群在消化道內(nèi)可降解為食物的正常成分；④不影響藥物抗菌素的使用對食品熱處理時不產(chǎn)生有害成分。目前有不少天然防腐劑開發(fā)利用并投放市場，但目前使用的大部分都是粗制品，其有效成分含量常隨季節(jié)和地理環(huán)境而改變，有些天然防腐劑中到底是何種物質(zhì)起作用還不甚清楚，更不用說分離出純品進行毒理學(xué)評價。另外，各種防腐劑的作用機理、抗菌譜和可應(yīng)用的范圍等研究得也不夠深刻。而且，天然防腐劑在實際應(yīng)用中也存在很多問題，某些天然防腐劑用量少時達不到防腐效果，用量大時可能影響食品的風(fēng)味和品質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒副作用，例如黃酮類作為防腐劑使用時，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高會使人感到苦澀味，還會由于氧化而使食品變色。部分現(xiàn)已開發(fā)的天然防腐劑普遍存在抗菌譜較窄的缺點，僅使用某一種不能完全抑制所有病菌的生長，同時使用多種，也可能對人體產(chǎn)生毒害等等，以上都是制約天然防腐劑開發(fā)利用進程的主要因素?，F(xiàn)在市場上的防腐劑大多是合成的防腐劑而天然防腐劑越來越受到大眾的歡迎。橄欖葉中主要含有裂環(huán)烯醚萜及其苷、黃酮及其苷、低分子單寧等多酚類化合物，具有很好的防腐殺菌能力，是理想的天然防腐劑及食品添加劑。橄欖多酚能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合，與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用，具有還原性和捕捉自由基活性等，具有抗氧化、抗高血壓、降血糖、加強免疫系統(tǒng)以及抑菌等作用。本專利從油橄欖葉中提取分離多酚類抑菌物質(zhì)，經(jīng)過改善其溶解性、耐熱耐酸性、增效劑配伍、色澤與風(fēng)味，從而成為廣泛應(yīng)用于食品及其它工業(yè)的廉價天然防腐劑，取代部分目前常用的合成防腐劑。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明了一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，由以下步驟組成:第一步,原料預(yù)處理篩選新鮮油橄欖葉低溫干燥，破碎成0.5cm以下的粉末；第二步，不同油橄欖提取物制備A水提取物:油橄欖干葉與去離子水質(zhì)量比為1: 15 30，90 100°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；B醇提取物:油橄欖干葉與醇溶劑質(zhì)量比為1: 6 20，70 80°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于 10% ；C堿水提取物:油橄欖干葉與pH9 12堿水溶液質(zhì)量比為1: 15 30，90 100°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；D堿性醇提取物:pH8 10醇-水質(zhì)量百分濃度為30 80%，油橄欖干葉與pH8 10醇-水溶液質(zhì)量比為1:1: 6 20，提取溫度為50 85°C，提取真空度300 740mmHg，沸騰時間為10 60min，浸提次數(shù)I 3次，過濾，合并堿性醇提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；第三步，樹脂精制用堿調(diào)節(jié)第二步中不同油橄欖提取液至pH8 9，在5000轉(zhuǎn)/分以上離心機離心過濾，濾液經(jīng)過樹脂吸附，用30 80%醇溶液解附，收集橄欖多酚洗脫部位，低溫真空濃縮，回收醇溶劑，得到橄欖多酚濃縮液；第四步，溶劑萃取用乙酸乙酸等體積萃取橄欖多酚濃縮液I 4次，合并有機層，低溫真空濃縮，回收有機溶劑，得到橄欖多酚萃取液；第五步，水溶性油橄欖多酚粉E未制備在第四步油橄欖多酚萃取液中加入I 5%水溶性β -環(huán)糊精，真空干燥，制備60% 90%油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40%油橄欖葉中含有大量多酚、黃酮等抗氧化多酚化合物。本發(fā)明首先用不同提取溶液，如水、乙醇和ΡΗ9 11堿水，熱回流提取，固液比1: 10 30，提取溫度75°C 100°C，時間2 4小時，提取2次，水提取物中黃酮含量的平均值為1.5761mg.g—1，多酚含量平均值為0.1584mg.g-1 ;醇提取物中黃酮含量的平均值為4.7181mg.g_S多酚含量平均值為0.1257mg.g—1 ;堿水提取物中黃酮含量的平均值為1.395mg.g_S多酚含量平均值為
0.2703mg.g'結(jié)果表明，不同提取液中黃酮和多酚含量存在差異，主要含有大量的雜質(zhì)，黃酮和多酚的提取率10% 30%。為了提高油橄欖葉黃酮和多酚的提取率，本發(fā)明采用減壓沸騰堿性提取方式，提取方式為熱提取、超聲波提取和微波提取中任一種。熱回流提取溫度50°C 95°C，優(yōu)選50°C 85°C，超聲波提取功率300W 3KW，溫度40V 70°C，優(yōu)選50°C 65°C，微波提取功率200 1000 ，提取劑為醇-水質(zhì)量百分濃度為30 80%提取溶液，所選用的醇為甲醇、乙醇中任一種，也可以用30 80%丙酮提取溶液，提取溫度50 60°C，提取真空度300 700mmHg,沸騰時間為10 60min，提取2 3次，在減壓沸騰狀態(tài)下制備堿性醇提取物中黃酮含量的平均值為12.5724mg.g_S多酚含量平均值為32.3388mg.g—1 ;多酚和黃酮提取率大于90%。與A、B和C提取方式相比，D提取方式黃酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。為了制備60% 90%油橄欖多酚粉未，本專利采用樹脂精制和溶劑萃取工藝，由于油橄欖葉含有大量的有機酸和酚酸類成分，本發(fā)明創(chuàng)新性用堿調(diào)節(jié)提取液PH8 9，所用的堿為為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水中任一種。但提取液中含有大量水溶性蛋白、多糖、單寧等雜質(zhì)，用堿調(diào)節(jié)提取液PH8 9，產(chǎn)生大量絮狀沉淀物，用大于5000r/min離心機離心，分離沉淀，得到清液。本專利采用樹脂吸附多酚，樹脂為氧化鋁、大孔吸附樹脂、聚酰胺等中任一種。大孔吸附樹脂優(yōu)選D101、D201、D730、D130、AB-8、XAD-7等中任一種。解附所用的洗脫液用脂肪族低級醇和水的混合溶劑，醇與水的比例為10% 80%，優(yōu)選乙醇。解附后的溶液進行濃縮，其中固溶物為10% 40%，5000轉(zhuǎn)/分以上離心機離心，得到橄欖多酚水溶液；用乙酸乙酸等體積萃取橄欖多酚水溶液I 4次，合并有機層，低溫真空濃縮，回收有機溶劑，濃縮液為水溶性油橄欖多酚。目前國際市場上油橄欖多酚提取物含量低于60%，尤其是水溶性不好。為了提高多酚的純度和改善油橄欖多酚提取物中水中的溶解度，本專利在油橄欖多酚濃縮液中加入I 5%水溶性β-環(huán)糊精，真空干燥，制備60% 90%油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40%。油橄欖多酚具有很好的抗菌防腐功能，本發(fā)明專利比較不同油橄欖提取物(A-D)及高純度水溶性油橄欖多酚(E)對于金黃色葡萄球菌(Sa.)和大腸桿菌(Ec.)抑制作用，培養(yǎng)結(jié)束后，觀察抑菌圈情況，用刻度尺測量抑菌圈直徑。直徑< IOmm為較弱活性，直徑>15mm為較強活性，IOmm 15mm之間為中等活性,大于25mm為超強活性。水提取物A、醇提取物B、堿水提取物C、堿性醇提取物D和水溶性油橄欖多酚粉末E中任一種提取物在I % 20%濃度下對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均值為1.5cm 3.50cm,對大腸桿菌的抑菌圈平均值為1.20cm 3.20cm，抑菌作用大小依次為E>D>B>C> A，其中水溶性油橄欖多酚E對于金黃色葡萄球菌(Sa.)和大腸桿菌(Ec.)抑制作用最強，在1% 20%濃度下對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均值為2.2cm 3.50cm,對大腸桿菌的抑菌圈平均值為
2.60cm 3.20cm,并且隨著油橄欖多酚濃度越高，抑菌的效果更好。本發(fā)明制備油橄欖葉水提取物A、醇提取物B、堿水提取物C、堿性醇提取物D和水溶性油橄欖多酚粉末E中任一種提取物在1% 20%濃度下處理生鮮肉和鹵肉，油橄欖提取物與肉制品質(zhì)量比為0.1 % 5 %，生鮮肉和鹵肉在空氣中保鮮的貨架期在O 15°C下延長3 5天，在真空包裝下保鮮的貨架期在O 15°C下延長10 30天。本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:1.首次采用堿性醇溶液減壓沸騰提取，與傳統(tǒng)常規(guī)熱回流提取比較，提取溫度降低了 30 50°C，提取時間 縮短3 5倍，黃酮和多酚提取率高于90%，與傳統(tǒng)提取方式相t匕，D提取方式黃酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。2.采用堿性條件下樹脂吸附多酚，有效除去雜質(zhì)，采用乙酸乙酯再萃取多酚，加入I 5 %水溶性β -環(huán)糊精，制備60 % 90 %油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40 %，產(chǎn)品水溶性好。本工藝簡單，生產(chǎn)易行。3.制備油橄欖葉水提取物、醇提取物、堿水提取物、堿性醇提取物和水溶性油橄欖多酚，對金黃色葡萄球菌(Sa.)和大腸桿菌(Ec.)具有抑制作用，對生鮮肉和鹵肉在空氣中保鮮的貨架期在O 15°C下延長3 5天，在真空包裝下保鮮的貨架期在O 15°C下延長10 30天。
四

圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3橄欖葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖4橄欖葉提取物對大腸桿菌的抑菌效果圖5水溶性油橄欖葉多酚對生鮮肉的防腐效果圖6水溶性油橄欖葉多酚(10% )對對鹵肉的防腐效果
五具體實施例方式以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。實施例1對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備第一步，原料預(yù)處理篩選新鮮油橄欖葉低溫干燥，破碎成0.5cm以下的粉末，,如200nm, 300nm, 500nm,IOOOnm, 10mm, 50mm, 100mm, 200mm, 300mm, 500mm,優(yōu)選 500nm, IOOOnm, 10mm, 50mm, 100mm ;第二步，不同油橄欖提取物制備A水提取物:油橄欖干葉與去離子水質(zhì)量比為1: 15 30，90 100°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；B醇提取物:油橄欖干葉與醇溶劑質(zhì)量比為1: 6 20，70 80°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于 10% ；C堿水提取物:油橄欖干葉與pH9 12堿水溶液質(zhì)量比為1: 15 30，90 100°C提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；D堿性醇提取物:pH8 10醇 水質(zhì)量百分濃度為30 80%，油橄欖干葉與pH8 10醇-水溶液質(zhì)量比為1:1: 6 20，提取溫度為50 85°C，提取真空度300 740mmHg,沸騰時間為10 60min,浸提次數(shù)I 3次,過濾,合并堿性醇提取液,減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ；本實施例首先用不同提取溶液，如水、乙醇和pH9 11堿水，熱回流提取，固液比I: 10 30，提取溫度75°C 100°C，時間2 4小時，提取2次，水提取物中黃酮含量的平均值為1.5761mg.g_\多酚含量平均值為0.1584mg.g-1 ;醇提取物中黃酮含量的平均值為4.7181mg.g_S多酚含量平均值為0.1257mg.g—1 ;堿水提取物中黃酮含量的平均值為1.395mg.g_\多酚含量平均值為0.2703mg.g'結(jié)果表明，不同提取液中黃酮和多酚含量存在差異，主要含有大量的雜質(zhì)，黃酮和多酚的提取率10% 30%。為了提高油橄欖葉黃酮和多酚的提取率，本實施例采用減壓沸騰堿性提取方式，提取方式為熱提取、超聲波提取和微波提取中任一種。熱回流提取溫度50°C 95°C，優(yōu)選50°C 85°C，超聲波提取功率300W 3KW，溫度40V 70°C，優(yōu)選50°C 65°C，微波提取功率200 1000 ，提取劑為醇-水質(zhì)量百分濃度為30 80%提取溶液，所選用的醇為甲醇、乙醇中任一種，也可以用30 80%丙酮提取溶液，提取溫度50 60°C，提取真空度300 700mmHg，沸騰時間為10 60min，提取2 3次，在減壓沸騰狀態(tài)下制備堿性醇提取物中黃酮含量的平均值為12.5724mg.g_S多酚含量平均值為32.3388mg.g—1 ;多酚和黃酮提取率大于90%。與A、B和C提取方式相比，D提取方式黃酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。第三步，樹脂精制用堿調(diào)節(jié)第二步中不同油橄欖提取液至pH8 9，在5000轉(zhuǎn)/分以上離心機離心過濾，濾液經(jīng)過樹脂吸附，用30 80%醇溶液解附，收集橄欖多酚洗脫部位，低溫真空濃縮，回收醇溶劑，得到橄欖多酚濃縮液；第四步，溶劑萃取用乙酸乙酸等體積萃取橄欖多酚濃縮液I 4次，合并有機層，低溫真空濃縮，回收有機溶劑，得到橄欖多酚萃取液；第五步，水溶性油橄欖多酚粉未制備在第四步油橄欖多酚萃取液中加入I 5%水溶性β -環(huán)糊精，真空干燥，制備60% 90%油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40%本實施例中用堿調(diào)節(jié)提取液ΡΗ8 9，所用的堿為為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水中任一種。提取液中含有大量水溶性蛋白、多糖、單寧等雜質(zhì)，用堿調(diào)節(jié)提取液ΡΗ8 9，產(chǎn)生大量絮狀沉淀物，用大于5000r/min離心機離心，分離沉淀，得到清液。本實施例采用樹脂為氧化鋁、大孔吸附樹脂、聚酰胺等中任一種，優(yōu)選大孔吸附樹月旨。大孔吸附樹脂優(yōu)選D101、D201、D730、D130、AB-8、XAD-7等中任一種。解附所用的洗脫液用脂肪族低級醇和水的混合溶劑，醇與水的比例為10% 80%，優(yōu)選乙醇。解附后的溶液進行濃縮，其中固溶物為10% 40%，優(yōu)選30 40%，5000轉(zhuǎn)/分以上離心機離心，得到橄欖多酚水溶液；用乙酸乙酸等體積萃取橄欖多酚水溶液I 4次，合并有機層，低溫真空濃縮，回收有機溶劑，濃縮液為水溶性油橄欖多酚。在油橄欖多酚濃縮液中加入I 5%水溶性環(huán)糊精，真空干燥，制備60% 90%油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40%。實施例2油橄欖提取物制備1.樣品預(yù)處理將新鮮橄欖葉用清水沖洗干凈，室溫下干燥，直到葉片表面水分完全干燥，分批放入真空干燥箱中，在真空740mmHg和溫度50°C下進行干燥，每隔Ih打開真空干燥箱，直至葉片完全干燥，再用多功能粉碎機對干燥的橄欖葉片進行粉碎，粉碎至細(xì)小的粉末，過50目篩子，油橄欖葉粉末備用。2.不同溶劑提取1)水浸提法
分別稱取20g橄欖葉粉末于8個三角瓶中，各加入400ml蒸餾水，制成1: 20的固液比，放入恒溫?fù)u床中，在振蕩頻率130r/s、90 V提取，提取時間分別于2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h各個時間段測量橄欖葉中總黃酮及多酚類物質(zhì)含量，以此確定最佳提取時間。結(jié)果表明，提取3小時，2次，提取效果最好。提取液過濾，提取液減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，得固體粉未0.52g,含水量8.5%, q總多酹含量5.6%。2)醇提法分別稱取20g橄欖葉粉末于8個三角瓶中，各加入40%乙醇溶液，制成固液比I: 6 20，70 80°C放入恒溫?fù)u床中，在振蕩頻率130r/s下進行震蕩浸提。分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h各個時間段測量橄欖葉中總黃酮及多酚類物質(zhì)含量，以此確定最佳提取時間。結(jié)果表明:固液比1: 10，80°C提取2，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量8.8%，總多酚含量7.8%。3)堿提法分別稱取20g橄欖葉粉末于8個三角瓶中，各加入pH9 12氫氧化鈉水溶液，固液比1: 15 30，提取溫度90 100°C，放入恒溫?fù)u床中，在振蕩頻率130r/s進行震蕩浸提。分別于211、411、611、811、1011、1211、1811、2411各個時間段測量橄欖葉中總黃酮及多酚類物質(zhì)含量，以此確定最佳提取時間。結(jié)果表明油橄欖干葉與PH9 12堿水溶液質(zhì)量比為1: 20，提取2 4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10%,總多酌■含量5.2%。4)減壓沸騰提取分別稱取20g橄欖葉粉末于8個三角瓶中，用氫氧化鉀或氫氧化鈉或氨水溶液加入甲醇中調(diào)節(jié)PH10，配制70%醇溶液，固液比1: 6 20，提取溫度50 100°C，優(yōu)選65°C，提取真空度300 740mmHg，沸騰時間為10 60min，放入恒溫?fù)u床中，在振蕩頻率130r/s進行震蕩浸提，每IOmin取樣分析提取液中總黃酮及多酚類物質(zhì)含量，以此確定最佳提取時間。結(jié)果表明，浸提次數(shù)2次，提取時間25min，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于8.0%,總多酹含量9.3%。實施例3油橄欖葉提取物多酚和黃酮的檢測1.樣品預(yù)處理將不同提取方式的提取液用低速離心機，在轉(zhuǎn)速3000r/s下離心分離lOmin，取上清液20ml用于黃酮及多酚含量的測定，其余上清液收集備用。2.黃酮的檢測a)黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確稱取已恒 重的蘆丁 4.8mg，用95%乙醇溶解，用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，配成濃度為0.096mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(96.Ομ g/ml)0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0ml 分別置于已校正的IOml試管中，然后加入0.3ml5% NaNO2，搖勻，靜置6min。再加入0.3mll0% Al(NO3)3,搖勻，靜置6min，加4ml4% NaOH，搖勻，靜置lOmin，加蒸餾水稀釋至IOml刻度，搖勻。以0.0ml的標(biāo)準(zhǔn)液管作空白對照，在510nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b)黃酮含量測定
準(zhǔn)確量取樣品溶液2mL，然后加入0.3mL5 % NaNO2,搖勻，靜置6min，再加入
0.3mL10% Al (NO3)3搖勻，靜置6min，加4mL4% NaOH，搖勻，靜置lOmin，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照在5IOnm處測定吸光度。c)黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Abs = 0.00971* (C)+0.00275，C為
測量物的濃度，說明吸光度與測量物濃度成正相關(guān)，由此可計算出所測量提取物中黃酮的含量。3.多酚類物質(zhì)的檢測a)多酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確稱取0.0140g的干燥沒食子酸，用蒸餾水溶解，定容至IOOml的容量瓶中，配成140mg/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0、0.5、1.0,2.0,3.0,4.0和5.0ml沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別定容于1Oml容量瓶內(nèi)，配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后從各溶液中吸取Iml加入25ml容量瓶內(nèi)，加1Oml蒸懼水，搖勻，再加1.5mlFolin_Ciocalteu試劑,充分搖勻30s后,前加入6111110%似2(1)3溶液，混勻，加水定容，搖勻，然后在30 V下避光放置反應(yīng)2h。以O(shè)ml樣品為空白，在765nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b)多酚含量的測定取1mL待測液加入25ml容量瓶內(nèi)，加IOml蒸餾/K，搖勻。再加
1.5mlFolin-Ciocalteu試劑，充分搖勻30s后，加入6mll0% Na2C03溶液，混勻，加水定容，再混勻。在30°C下避光反應(yīng)2h，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照在765nm處測定吸光值。c)沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2) Abs = 0.11872* (C) +0.00372，C為測量物的濃度，說明吸光度與測量物濃度成正相關(guān)，由此可計算出所測量提取物中多酚的含量。4.結(jié)果計算試樣中黃酮及多酚含量按下式進行計算。M =c×n×v／2×m
式中:c——分光光度計所測得濃度(mg.L-1)；η-試樣稀釋倍數(shù)；V-待測液的總體積(mL)；m待測樣品粉末的質(zhì)量(g)；計算結(jié)果保留四位有效數(shù)。實施例4油橄欖葉提取物抑菌活性作用1.橄欖葉抑菌液樣品的制備分別取油橄欖葉水提取物、乙醇提取物、堿水提取物、減壓沸騰提取醇堿提取物及水溶性油橄欖多酚粉末，置于無菌燒杯中，再分別加入IOml無菌水，配制成
的溶液，備用。2.抑菌試驗的準(zhǔn)備其中供試菌種大腸桿菌(Ec.)、金黃色葡萄球菌(Sa.)為實驗室保留菌種。生鮮肉、鹵豬肉為超市當(dāng)天購買。實驗所用試劑如表I所示，所用儀器如表2所示表I試劑規(guī)格與廠家
權(quán)利要求
1.一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于由以下步驟組成: 第一步，原料預(yù)處理 篩選新鮮油橄欖葉低溫干燥，破碎成0.5cm以下的粉末； 第二步，不同油橄欖提取物制備 A水提取物:油橄欖干葉與去離子水質(zhì)量比為1: 15-30，90-100°C提取2-4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ； B醇提取物:油橄欖干葉與醇溶劑質(zhì)量比為1: 6-20，70-80°C提取2-4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ； C堿水提取物:油橄欖干葉與PH9-12堿 水溶液質(zhì)量比為1: 15-30，90-100°C提取2-4小時，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ； D堿性醇提取物:PH8-10醇-水質(zhì)量百分濃度為30-80 %，油橄欖干葉與PH8-10醇-水溶液質(zhì)量比為1:1: 6-20，提取溫度為50-85°C，提取真空度300-740mmHg，沸騰時間為10-60min,浸提次數(shù)1_3次，過濾，合并堿性醇提取液，減壓濃縮，濃縮液進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10% ； 第三步，樹脂精制 用堿調(diào)節(jié)第二步中不同油橄欖提取液至PH8-9，在5000轉(zhuǎn)/分以上離心機離心過濾，濾液經(jīng)過樹脂吸附,用30-80%醇溶液解附，收集橄欖多酚洗脫部位，低溫真空濃縮，回收醇溶齊U，得到橄欖多酚濃縮液；第四步，溶劑萃取 用乙酸乙酸等體積萃取橄欖多酚濃縮液1-4次，合并有機層，低溫真空濃縮，回收有機溶劑，得到橄欖多酚萃取液； 第五步，水溶性油橄欖多酚粉未E制備 在第四步油橄欖多酚萃取液中加入I 5%水溶性β-環(huán)糊精，真空干燥，制備60% 90%油橄欖多酚粉未，在水中溶解度10 40%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于油橄欖葉的水提取物Α、醇提取物B、堿水提取物C、堿性醇提取物D和水溶性油橄欖多酚粉末E中任一種提取物在I % 20%濃度下對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均值為1.5cm 3.50cm,對大腸桿菌的抑菌圈平均值為1.20cm 3.20cm,抑菌作用大小依次為E>D>B>C> A，其中水溶性油橄欖多酚E對于金黃色葡萄球菌(Sa.)和大腸桿菌(Ec.)抑制作用最強,在I % 20%濃度下對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均值為2.2cm 3.50cm,對大腸桿菌的抑菌圈平均值為2.60cm 3.20cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于油橄欖葉的水提取物、醇提取物、堿水提取物、堿性醇提取物和水溶性油橄欖多酚粉末中任一種提取物在1% -20%濃度下處理生鮮肉和鹵肉，油橄欖提取物與肉制品質(zhì)量比為0.1% 5%，生鮮肉和鹵肉在空氣中保鮮的貨架期在O 15°C下延長3 5天，在真空包裝下保鮮的貨架期在O 15°C下延長10 30天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于第二步D堿性醇提取物提取方式是超聲波和微波中任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于第二步醇溶劑為甲醇和乙醇中任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于第二步和第三步中堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水中任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，其特征在于第三 步中樹脂為聚酰胺、大孔樹脂、氧化鋁中任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開一種對肉制品具有抑菌保鮮活性的水溶性油橄欖多酚制備方法，篩選新鮮油橄欖葉干燥，破碎成0.5cm以下的粉末。油橄欖干葉與不同提取溶劑固液比為1∶6～30，50～100℃，沸騰時間為10～60min，提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，再進行真空冷凍干燥，固體粉未含水量低于10％，制備不同提取物；再經(jīng)過樹脂純化和溶劑萃取，萃取物中加入1～5％水溶性β-環(huán)糊精，真空干燥，制備60％～90％油橄欖多酚粉未。本發(fā)明制備的油橄欖葉提取物在1％～20％濃度下對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均值為1.5cm～3.50cm，對大腸桿菌的抑菌圈平均值為1.20cm～3.20cm；處理生鮮肉和鹵肉，油橄欖提取物與肉制品質(zhì)量比為0.1％～5％，在空氣中保鮮的貨架期在0～15℃下延長3～5天，在真空包裝下保鮮的貨架期在0～15℃下延長10～30天。
文檔編號A23B4/20GK103120200SQ201310027940
公開日2013年5月29日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者王成章, 葉建中, 吉清 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所