專利名稱：一種利用探針熔解技術準確檢測kras基因突變的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用探針熔解技術檢測KRAS基因突變的方法。
背景技術：
基因突變是指基因組DNA分子在結構功能上發(fā)生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導致基因型疾病的重要原因之一。基因突變分析在生物醫(yī)學研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導的細胞信號轉導通路，影響細胞的增殖、生長和轉移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號傳遞給下游細胞因子后恢復非激活狀態(tài)；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號活化便始終處于激活狀態(tài)，導致細胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結合，阻斷細胞轉導通路，從而達到抑制癌細胞增殖的目的；多項研究發(fā)現，接受抗EGFR藥物治療的結直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益:具有更高的藥物客觀反應率和較長的生存時間。因此，能夠準確檢測KRAS突變狀態(tài)對指導結直腸癌患者臨床用藥有重要意義。傳統(tǒng)檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經典是雙脫氧測序技術，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結果，準確度和靈敏度受到限制。近年來，等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,ARMS)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)等方法改善了檢測的靈敏度和特異性，但仍存在假陽性現象嚴重和操作繁瑣等缺點 。分子信標探針(Molecular Beacon)是一種可以自發(fā)形成莖環(huán)結構的雙標記寡核昔酸探針，其5’末端標記有突光基團，3’末端標記有洋滅基團；當頸環(huán)結構形成后，突光基團和淬滅基團空間距離靠近，發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)，熒光基團被外界光源激發(fā)后發(fā)出的光子被淬滅基團吸收，此時探針不能被激發(fā)出熒光；若體系中存在與探針序列相匹配的模板，當分子信標探針與模板雜交后，其發(fā)夾結構被打開，使得熒光基團與淬滅基團空間距離增大，此時突光基團被激發(fā)出的突光未被淬滅，可以檢測突光信號；同時由于突光強度與體系中模板的量呈正比，故分子信標探針可以用于實時定量PCR反應。當分子信標與模板鏈雜交后，若繼續(xù)升高溫度可導致探針與模板再次分離，從而使得熒光強度隨溫度升高而降低。將熒光強度對溫度變化時間求導數便得到熔解曲線，熔解曲線的峰值為熒光信號降低速率最大時對應的溫度，即為模板與探針結合強度(Tm值)。由于序列的差別，探針與野生型模板和突變型模板的結合強度有差別，表現在熔解曲線(熔解峰)的不同。傳統(tǒng)的熔解曲線法靈敏度較低，使得檢測結果不準確。

發(fā)明內容
為了克服傳統(tǒng)探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點，本發(fā)明提出一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，檢測結果更可靠。為實現以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下基本技術方案?！N利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟:(1)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成上游引物(22nt):5， -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’延伸阻滯引物(36nt):5’ -taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’分子信標探針(34nt):FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2(2)提取被測樣本的基因組DNA ；(3)配制反應體系在反應管中加入被測樣本的基因組DNA、上游引物、延伸阻滯引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNA Polymerase),dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脫氧尿苷三磷酸)、分子信標探針、10XPCRBuffer(TIANNIUM Taq PCR Buffer)；(4) PCR 反應將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增和熔解，PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變?；谝陨匣痉桨?，為取得更佳的技術效果，本發(fā)明還可作出以下優(yōu)化限定。以單管反應體系25 μ I計，反應管中加入上游引物500ηΜ，延伸阻滯引物50ηΜ，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’ 一 3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase) 0.5U，dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)200 μ M，dUTP (脫氧尿苷三磷酸)400 μ Μ，分子信標探針 250nM，10XPCR Buffer (TIANNIUM Taq PCR Buffer) 2.5 μ 1，ddH20 補足體積 25 μ 1在反應體系的總量確定的情況下(比如25 μ 1)，以上加入物的量綱均為本領域技術人員的常規(guī)取量方式。上述PCR 反應參數設置如下:50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，1 5sec ；56°C,0 lsec ;65°C，(Tlsec ;60 70 個循環(huán)；熔解:95°C，1 5min ;50°C—72°C每秒收集熒光 15 20次，0.02、.05 °C梯度升溫。本發(fā)明與現有技術相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果:1.特異性強。在本發(fā)明中，針對KRAS突變位點設計的分子信標探針和引物組合具有很高的特異性，無交叉反應，保證了模板的特異性擴增；2.靈敏度高。在本發(fā)明中，使用的聚合酶缺少5’一 3’外切酶活性，分子信標探針和延伸阻滯引物在其基礎功能之外都起到了阻礙野生型模板擴增，富集突變的效果；同時聚合酶具有很高的酶活力，可以在極短的時間內((Γ2秒)高效擴增突變型模板；兩種效果共同保證了該發(fā)明具有很高的靈敏度。3.節(jié)省耗材和時間。基于本實驗中分子信標探針的設計，使得該方法可以很大程度上節(jié)省實驗時間和耗材，再結合設計的反應程序，也大大優(yōu)化了擴增效果，PCR反應和熔解過程總共只需要70分鐘，同時每個樣本只需要一個反應孔。4.結果分析簡單。本發(fā)明相對于傳統(tǒng)的高分辨熔解曲線法，更容易進行實驗結果分析；對每個樣本只需觀察其熔解峰Tm便可以分析其突變是否發(fā)生，無需參照標準品。5.高通量。結合當前儀器配置情況，本發(fā)明相對于傳統(tǒng)突變檢測技術，可進行高通量突變篩查，提高了檢測效率。


圖1為KRAS突變位點序列信息，分子信標探針和引物信息示意圖。圖2為該發(fā)明實驗流程和設計原理示意圖。圖3、4為本發(fā)明應用于KRAS突變檢測實驗結果圖。
具體實施例方式本發(fā)明將分子信標探針和延伸阻滯引物結合起來，并利用無5’ 一 3’外切酶活性聚合酶進行體外快速檢測KRAS突變，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，使檢測結果更可靠。延伸阻滯引物(Extension-Refractory primes)是一種可以和自身延伸產物形成“頸環(huán)”結構的引物；除了普通引物序列部分之外，延伸阻滯引物5’端額外包含的一段堿基序列，這段序列可以與自 身延伸得到的產物單鏈中包含突變位點在內的一段堿基序列互補，形成“頸環(huán)”結構；由于野生型和突變型模板間序列的不同，故形成的“頸環(huán)”結構強度(Tm值)有明顯差別。本發(fā)明針對KRAS基因第三號外顯子熱點突變區(qū)域(第61位密碼子)設計一條高特異性分子信標探針，該探針序列與野生型KRAS基因序列完全匹配；在探針的上下游設計一對高特異性引物，其中上游引物為普通引物，下游引物為延伸阻滯引物。在PCR反應體系中，上游引物濃度為延伸阻滯引物濃度的10倍；延伸阻滯引物的基礎引物部分對野生型或突變型模板沒有選擇性，但其5’端額外序列部分只與野生型模板延伸得到產物完全互補配對。在反應體系中加入引物對和分子信標探針，在PCR反應過程中，選擇合適的退火和延伸溫度，控制退火和延伸的時間，探針與野生型模板結合強度高(Tm 65°C)，可以較強方式結合，而探針與突變型模板不能完全互補配對(突變位點位置錯配)，故二者結合強度較低(Tm 59°C);同時延伸阻滯引物與野生型模板所得到的延伸產物可以形成“頸環(huán)”結構(Tm 700C )，而突變模板的延伸產物則不能；由于PCR反應所用的聚合酶缺少5’ 一 3’外切酶活性，分子信標探針與模板的結合以及延伸阻滯引物二級結構的形成分別導致上游引物和延伸阻滯引物的延伸受到阻礙，這種阻礙作用主要對野生型模板起作用，而對突變型模板擴增幾乎無影響，因此達到富集突變，提高靈敏度的作用。在PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值便可以準確判斷樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。圖1為KRAS基因部分序列(含突變位點在內131nt)信息以及本發(fā)明中用到的分子信標探針和延伸阻滯引物的示意請參閱圖1-1所示，為本發(fā)明中所涉及到KRAS序列信息及引物和探針位置示意圖。左上方黑色半箭頭指代上游引物，長度為22nt;下方折疊式半箭頭指代延伸阻滯引物，其基礎引物部分為22nt，5’端額外序列(頸環(huán)形成所需)為14nt ;箭頭指示堿基(2個A)為KRAS突變發(fā)生位點，其上方圖示為分子信標探針對應序列范圍。本發(fā)明中所用的分子信標為雙標記寡核苷酸探針，其5’末端標記熒光基團(橢圓標志)，3’末端標記淬滅基團(橢圓標志)。探針5’端有4nt不與模板互補，3’端有6nt不與模板互補，與模板互補部分序列為24nt。請參閱圖1-2所示，為本發(fā)明中分子信標探針“頸環(huán)”結構示意圖。其中“頸”為6個堿基互補配對形成，Tm ^ 53.5°C;當頸環(huán)結構形成后，探針的熒光基團和淬滅基團基團空間距離靠近，不能被激發(fā)出熒光；請參閱圖1-3所示，為本發(fā)明中延伸阻滯引物的延伸產物所形成的頸環(huán)結構示意圖。其中“頸”由其5’端額外序列與其自身延伸產物(野生型模板)包含突變位點在內的序列互補配對形成，Tm 70°C。延伸阻滯引物與突變型模板延伸得到的產物在PCR延伸時不能形成類似二級結構。圖2為該發(fā)明所涉及到的實驗流程和設計原理示意圖。請參閱圖2-1所示，為本發(fā)明中檢測KRAS基因突變的實驗原理圖。由于PCR反應體系中上游引物濃度為延伸阻滯引物(下游引物)的10倍，在PCR反應過程中，除正常的雙鏈PCR產物形成外，同時還有大量上游引物延伸產生的單鏈PCR產物；這些單鏈可以和體系中的分子信標探針互補配對，當二者結合后，探針“頸環(huán)”結構打開，被激發(fā)出熒光信號。由于PCR反應過程中，單鏈產生數量隨PCR循序呈倍數增加，所以被激發(fā)的熒光也呈現倍數增強現象。當PCR反應完成后，體系中存在的單鏈和探針結合，此時熒光強度最高。之后進一步升高溫度，結合的探針會與單鏈產物脫離，熒光強度下降。當溫度達到探針的退火溫度(Tm)時，其與單鏈產物脫離的速率最快。如果對整個升溫過程求取熒光強度和時間的導數(熒光變化速率)，便可以得到熔解曲線圖，即虛線和實線標示的熔解峰；熔解峰指示了探針熔解的Tm，反應了探針與模板的結合強度。請參閱圖2-2所示，為本發(fā)明中延伸阻滯引物對突變模板進行富集的示意圖。圖中左部分為延伸阻滯引物與突變型模板產生的延伸產物，由于其額外序列與產物序列不能完全互補(突變位點錯配)，在延伸時不能形成“頸環(huán)”結構，所以上游引物可以正常的延伸。右部分所示為延伸阻滯引物與突變型模板產生的延伸產物，其額外序列可以和產物序列完全互補，在延伸時形成了“頸環(huán)”結構，同時因聚合酶缺少5’ 一3’外切酶活性，上游引物的延伸受到阻礙，PCR不能正常進行。因此，樣本中的突變型模板可以得到富集，而野生型模板的擴增受到了抑制。請參閱圖2-3所示，為本發(fā)明中分子信標探針對突變模板進行富集的示意圖。如圖中所示，分子信標探針與野生型模板完全互補，在PCR延伸時可以與模板很好的結合，由于聚合酶缺少5’ 一 3’外切酶活性，下游引物的延伸受到了阻礙，PCR不能正常進行。而分子信標探針與突變型模板不能完全互補(突變位點錯配)，在PCR延伸時不能與模板良好結合，引物的延伸可以正常進行。所以 ，樣本中的突變型模板可以得到富集，而野生型模板的擴增受到了抑制。綜合上述兩種作用，在PCR反應過程中突變型模板可以得到很好的富集。
針對被測樣本，本發(fā)明的快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟:(I)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成上游引物(22nt):5’ -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’延伸阻滯引物(36nt):5’ -taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’分子信標探針(34nt): FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2(2)提取被測樣本的基因組DNA ；(3)配制反應體系在反應管中加入被測樣本的基因組DNA、上游引物、延伸阻滯引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNA Polymerase),dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脫氧尿苷三磷酸)、分子信標探針、10XPCRBuffer(TIANNIUM Taq PCR Buffer)；以單管反應體系25 μ I計，上游引物600ηΜ，延伸阻滯引物60nM，UNG酶0.2U，5，一 3，外切酶活性缺失聚合酶0.5U, dNTPs200 μ M, dUTP400 μ M,分子信標探針250ηΜ,10XPCR Buffer2.5 μ 1，ddH2 0 補足體積 25 μ I ；(4) PCR 反應將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增和熔解，反應參數設置如下:50°C，2 5min ;95 O，12 15min ;95°C，I 5sec ;56°C,(Tlsec ;65°C,(Tlsec ;60 70 個循環(huán)；熔解:95°C，1 5min ;50°C— 72°C每秒收集熒光15 20次，0.02 0.05°C梯度升溫。PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。以下是采用本發(fā)明所提出的方法對KRAS Q61H(c.A183T)突變進行檢測的示例，以進一步體現本發(fā)明的技術效果。將培養(yǎng)的H460細胞系(KRAS Q61H突變型)與293細胞系(KRAS野生型)基因組DNA進行提取，使用Nanodrop核酸定量儀定量；取部分Q61H突變型基因組DNA與野生型基因組DNA按1:9，1:19，1:99以及1:199比例混合，制備Q61H突變型基因組DNA比例為10%，5%，1%和0.5%的混合型模板。同時將Q61H突變型基因組DNA，野生型基因組DNA和4種混合型DNA作為模板。實時熒光PCR的擴增體系為25μ I,共六個反應管，每管中均加入上游引物600ηΜ，延伸阻滯引物60nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNA Polymerase) 0.5U, dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)200 μ M，dUTP (脫氧尿苷三磷酸)40(^] ，分子信標探針25011]\1，10\ 0 Buffer (TIANNIUM Taq PCRBuffer) 2.5 μ 1，ddH20補足體積25 μ I。每管分別加入野生型DNA模板，Q61H突變型模板或混合型模板。將配制好的體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增和熔解。反應參數設置如下:50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，I 5sec，56°C，(Tlsec，65°C 0 lsec，6(T70 個循環(huán)；熔解:95°C，l 5min，50°C— 72°C每秒收集熒光15 20次，0.02 0.05°C梯度升溫。觀察樣品的熔解曲線。結果如圖3所示。
請參閱圖3所示，Q61H突變型模板對應熔解峰Tm為59°C左右，野生型模板對應熔解峰Tm為65 °C左右，而各混合型模板則呈現出“雙熔解峰”形式，且0.5%突變型模板也呈現出非常明顯突變型熔解峰(Tm59°C )，與理論預測結果完全符合。對于典型的其他突變類型的樣本檢測，同樣符合本發(fā)明的檢測理論；經實驗,也均可以達到預期效果。請參閱圖4所示，使用本發(fā)明對8例結直腸癌患者腫瘤樣本DNA進行檢測，證實樣本7為突變型，其余I例樣本為突變型。需要說明的是，對KRAS基因突變的檢測結果并非臨床上確診的直接依據。以上實施例不應視為對本發(fā)明保護范圍的限制，本發(fā)明在模板的準備和實時熒光PCR的環(huán)節(jié)確定了最佳的實施方式和參數，但本領域技術人員基于本發(fā)明技術思想和設計的引物體系，按照常規(guī)的操作方式(如試劑配比、擴增過程參數等)足以快速檢測KRAS突變，較之于現有技術有顯著進步。序列表〈110〉陜西北美基因股份有限公司〈120〉一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法<160>3<210>1<211>22<212>DNA〈213〉人類(Homo sapiens)〈400〉Icagactgtgtttctcccttc tc22<210>2<211>36<212>DNA〈213〉人類(Homo sapiens)<400>2taaggtcaag aggactcatg tactggtccc tcattg36<210>3<211>34<212>DNA〈213〉人類(Homo sapiens)〈400>3acgcattgtactcctcttgacctgctgtatgcgt34 。
權利要求
1.一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟: (O分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成 上游引物(22nt):5’ -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’ 延伸阻滯引物(36nt):5，-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3， 分子信標探針(34nt):FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2 (2)提取被測樣本的基因組DNA； (3)配制反應體系 在反應管中加入被測樣本的基因組DNA、上游引物、延伸阻滯引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’ 一3’外 切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNA Polymerase),dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脫氧尿苷三磷酸)、分子信標探針、IOXPCRBuffer(TIANNIUM Taq PCR Buffer)； (4)PCR反應 將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增和熔解，PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發(fā)生了 KRAS突變。
2.根據權利要求1所述的利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于: 以單管反應體系25 μ I計，反應管中加入上游引物600ηΜ，延伸阻滯引物60nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase) 0.5U，dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)200 μ M，dUTP (脫氧尿苷三磷酸)400 μ Μ，分子信標探針 250nM，10XPCR Buffer (TIANNIUM Taq PCR Buffer) 2.5 μ 1，ddH20 補足體積 25 μ 1
3.根據權利要求2所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于: PCR 反應參數設置如下:50°C，2 5min ;95 °C，12 15min ;95°C，I 5sec ;56°C，(Tlsec ；.65 °C, O^lsec ;60 70個循環(huán)；熔解:95°C，l 5min ;50°C— 72 °C每秒收集熒光15 20次，.0.02 0.05 °C梯度升溫。
全文摘要
本發(fā)明提出一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，檢測結果更可靠。該方法包括以下步驟(1)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成，其中設計的上游引物(22nt)為5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’，延伸阻滯引物(36nt)為5’-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’，分子信標探針(34nt)為FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2；(2)提取被測樣本的基因組DNA；(3)配制反應體系；(4)PCR反應。
文檔編號C12Q1/68GK103088137SQ20131002793
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權日2013年1月18日
發(fā)明者陳超, 戴鵬高, 劉金輝, 宿志瑞, 鄒暉 申請人:陜西北美基因股份有限公司