本發(fā)明屬泛素領(lǐng)域，尤其涉及一種用于二泛素合成的新型輔基連接臂及其合成方法。

背景技術(shù)：

泛素(ub,ubiquitin)除了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解外，還參與了細(xì)胞的分裂、生長、細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的運(yùn)動及凋亡等關(guān)鍵過程。基于泛素的重要性，對泛素鏈的合成研究也很重要。在泛素鏈中一個泛素單體通過其主鏈羧基與另一個泛素單體的主鏈氨基或七個賴氨酸殘基(lys6、lys11、lys27、lys29、lys33、lys48、lys63)之一的側(cè)鏈氨基形成酰胺鍵相連。不同類型的泛素鏈修飾具有不同的功能，保證了泛素化修飾功能的多樣性和特異性。

為了研究不同位點(diǎn)的二泛素在生化和結(jié)構(gòu)上的差異，發(fā)展一種高效合成二泛素的方法是必要的。strieter課題組成功地將基于巰基-烯烴的自由基偶聯(lián)(thiol-enecoupling，tec)運(yùn)用于泛素鏈的合成中，以鋰?；鶃喠姿猁}(lap)為自由基引發(fā)劑獲取了幾類不同賴氨酸位點(diǎn)連接的多聚泛素鏈(j.am.chem.soc.2012,134,6916-6919)。然而，該方法的不足在于大分子間的tec偶聯(lián)效率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種克服了前人所用的大分子與大分子之間通過tec偶聯(lián)反應(yīng)效率低的缺點(diǎn)，通過小分子與大分子進(jìn)行高效反應(yīng)用于二泛素合成的新型輔基連接臂及其合成方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于，所述的新型輔基連接臂結(jié)構(gòu)式如下式所示：

所述的一種用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于，該方法分為四步反應(yīng)，第一步反應(yīng)是將化合物i與三苯甲基硫醇(trtsh)在含有堿的有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系下反應(yīng)2h，生成化合物ii；第二步反應(yīng)是將生成的化合物與甘氨酸在加入還原劑的有機(jī)溶劑回流反應(yīng)72h，獲得化合物iii；第三步反應(yīng)是將生成的化合物用切割液反應(yīng)1h脫去三苯甲基(trt)基團(tuán),再與甲醛在堿性的條件下反應(yīng)2h，生成化合物iv；第四步反應(yīng)是將生成的化合物與丙烯胺在含有縮合劑的有機(jī)溶劑中反應(yīng)2h得到目標(biāo)產(chǎn)物。如下式所示：

第一步反應(yīng)中三苯甲基硫醇trtsh的摩爾量是化合物i摩爾量的1-1.2倍，堿的摩爾量是化合物i摩爾量的1-1.2倍；

第二步反應(yīng)中甘氨酸的摩爾量是化合物ii摩爾量的19-21倍，還原劑的摩爾量是化合物ii的1.4-1.6倍；

第三步反應(yīng)中切割液的體積是反應(yīng)體系的0.1-0.3倍，甲醛的摩爾量是化合物iii摩爾量的1-1.2倍；

第四步反應(yīng)中縮合劑的摩爾量是化合物iv摩爾量的0.9-1倍，丙烯胺的摩爾量是化合物iv摩爾量的1.5-2倍，堿的摩爾量是化合物iv摩爾量的2.8-3.2倍。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：

第一步反應(yīng)中所述的堿為n,n-二異丙基乙胺；

第一步反應(yīng)中所述的有機(jī)溶劑為n，n-二甲基甲酰胺溶液。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第二步反應(yīng)中所述的加入的還原劑為氰基硼氫化鈉。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第二步反應(yīng)中所述的有機(jī)溶劑為甲醇溶液。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第三步反應(yīng)中所述的切割液為三氟乙酸與三異丙基硅烷按體積比1:0.8-1.2組成的混合溶液。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第三步反應(yīng)中所述的堿性條件為ph8。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第四步反應(yīng)中所述的縮合劑為2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羥基苯并三唑中的一種或幾種。

所述的用于二泛素合成的新型輔基連接臂的合成方法，其特征在于：第四步反應(yīng)中所述的堿為n,n-二異丙基乙胺；第四步反應(yīng)中所述的有機(jī)溶劑為n，n-二甲基甲酰胺溶液。

本發(fā)明的原理為：

本發(fā)明提供了一種用于二泛素合成的新型輔基連接臂及其合成方法，該輔基連接臂通過tec反應(yīng)裝載到蛋白上后再通過ncl與第一段泛素偶聯(lián)，最后脫除輔基即可獲得基于表達(dá)泛素單元的泛素鏈。該方法克服了前人所用的大分子與大分子之間通過tec偶聯(lián)反應(yīng)效率低的缺點(diǎn)，通過小分子與大分子進(jìn)行高效反應(yīng)；并且形成的酰胺鍵和天然異肽鍵最接近，以便于后續(xù)的生化機(jī)理研究。

附圖說明

圖1是化合物i的核磁共振氫譜圖；

圖2是化合物ii的核磁共振氫譜圖；

圖3是化合物iii的核磁共振氫譜圖；

圖4是化合物iv的核磁共振氫譜圖；

圖5是新型輔基連接臂的核磁共振氫譜圖；

圖6是新型輔基連接臂的核磁共振碳譜圖；

圖7是新型輔基連接臂的高分辨質(zhì)譜圖；

圖8是新型輔基連接臂裝載到泛素k48c的質(zhì)譜圖；

圖9是新型輔基連接臂裝載到泛素k48c脫除thz基團(tuán)的質(zhì)譜圖；

圖10是運(yùn)用新型輔基連接臂得到二泛素k48c脫除輔基前的質(zhì)譜圖；

圖11是運(yùn)用新型輔基連接臂得到二泛素k48c脫除輔基后的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明實(shí)施過程作進(jìn)一步說明，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。

實(shí)施例1：輔基連接臂的合成

反應(yīng)式如下所示：

具體步驟為：

化合物ii：取1.0g化合物i(3.86mmol)、1.28gtrtsh(4.63mmol)于100ml裝有磁子的圓底燒瓶中，加入25mln，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，緩慢滴加808uln,n-二異丙基乙胺(diea，4.64mmol)，于室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)2h，向燒瓶中加入大量水稀釋，用乙酸乙酯(ea)萃取3次，再用水洗3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，將干燥后的有機(jī)相過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，得到產(chǎn)物白色固體1.55g，產(chǎn)率88.35％。

化合物iii：取0.9g化合物ii(2.0mmol)于150ml裝有磁子的圓底燒瓶中，加入15ml無水甲醇溶解，加入1.5g甘氨酸(20mmol)、90mg氰基硼氫化鈉(nabh3cn，1.43mmol)，將燒瓶放入70攝氏度的油浴鍋中加熱回流，反應(yīng)72h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，加入乙酸乙酯溶解，粗硅膠(100-200目)拌樣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑。柱層析分離法(硅膠柱)分離目的產(chǎn)物，得到產(chǎn)物0.7g，產(chǎn)率68.25％。

化合物iv：取0.54g化合物iii(1.05mmol)于150ml裝有圓底燒瓶中，加入15mln，n-二甲基甲酰胺溶解，加入1.5ml三氟乙酸(tfa)，反應(yīng)15min，加入1.5ml三異丙基硅烷(tips)，反應(yīng)20min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，冷凍干燥機(jī)抽干溶劑；接著加入15ml混合溶劑(無水乙醇：水＝3:1)溶解，加入83ul的37％甲醛水溶液，調(diào)ph為8，室溫下反應(yīng)2h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，加入ea溶解，粗硅膠(100-200目)拌樣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑。柱層析分離法(硅膠柱)分離目的產(chǎn)物，得到產(chǎn)物0.23g，產(chǎn)率77％。

輔基連接臂：取212mg化合物iv(0.75mmol)、256.65mg2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu，0.675mmol)、101.34mg1-羥基苯并三唑(hobt，0.75mmol)于裝有磁子的100ml圓底燒瓶中，加入5mldmf溶解，加入112.2ul烯丙胺(1.5mmol)，攪拌反應(yīng)2h，加過量dcm稀釋，再用水洗3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，將干燥后的有機(jī)相過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，加入dcm溶解，粗硅膠(100-200目)拌樣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑。柱層析分離法(硅膠柱)分離目的產(chǎn)物，得到產(chǎn)物136.5mg，產(chǎn)率86.4％。

實(shí)施例2：二泛素k48c的合成

反應(yīng)式如下所示：

具體步驟為：

裝載小分子：在裝有磁子的50ml反應(yīng)管中，加入蛋白u(yù)b(1-76)k48c(3umol,26mg)、輔基連接臂(240ul的500mmol儲液)、引發(fā)劑2,2-二羥甲基丁酸(dmpa，150ul的200mmol儲液)、叔丁基硫醇(27ul)，用混合溶劑(水:n-甲基吡咯烷酮＝1:1)補(bǔ)至3ml。在365nm的光波長下攪拌反應(yīng)2h，透析過夜，半制備柱分離，分離產(chǎn)物凍干得18mg,產(chǎn)率67.7％。

脫保護(hù)：在裝有磁子的50ml反應(yīng)管中，加入上述步驟的裝有輔基連接臂的泛素18mg(2umol)，用2ml的buffer(6m鹽酸胍、0.2mnah2po4、0.2m甲氧胺、ph4)溶解，室溫下攪拌反應(yīng)5h，透析過夜，半制備柱分離，分離產(chǎn)物凍干得12.5mg，產(chǎn)率70.6％。

ncl連接：在裝有磁子的50ml反應(yīng)管中，加入上述步驟的裝有輔基連接臂的泛素并脫除thz保護(hù)基12.5mg(1.4umol)，ub(1-75)-mesna(2umol,1.7mg)，三(2-羧乙基)膦(tcep，10mg,35umol)，4-巰基苯基乙酸(mpaa，5.89mg,35umol)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline，pbs)1.5ml，調(diào)ph為7.0，室溫下攪拌反應(yīng)2h，半制備柱分離，分離產(chǎn)物凍干得8mg，產(chǎn)率33％。

輔基移除：取3mg(1.7umol)上述步驟未脫除輔基的二泛素于反應(yīng)管中，加入切割液tfa/tis/h2o(95/2.5/2.5)500ul，放于冰上反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束。色譜分離獲得終產(chǎn)物2.4mg(1.4umol)，產(chǎn)率82％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，也不因各實(shí)施例之間的前后次序?qū)Ρ景l(fā)明造成任何局限，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。