本發(fā)明屬于核酸提取純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤尿液dna提取試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

二氧化硅能在鹽和特定ph值條件下可逆的結(jié)合dna，這也是硅珠法、磁珠法、硅膠膜法提取dna的理論基礎(chǔ)；在高濃度離液鹽和低ph值條件下，二氧化硅能通過氫鍵與dna結(jié)合，而蛋白質(zhì)、脂類、糖類等雜質(zhì)因不能被結(jié)合從而被去除，去除離液鹽、提高ph值之后，dna與二氧化硅之間的相互作用力減弱，dna從二氧化硅表面釋放，從而獲得純化的dna；土壤中含有大量的二氧化硅成分，因此，對土壤樣品進(jìn)行dna提取時(shí)，需要考慮樣品來源的二氧化硅對dna的結(jié)合，一旦dna與樣品來源的二氧化硅發(fā)生結(jié)合，dna就會隨著土壤固體顆粒物質(zhì)一起被去除。

尿液中含有一定量的dna，可以通過多種方法提取dna，并用于pcr檢測、str分型檢測、二代測序分析；但是，尿液中dna含量較低，尿液浸潤土壤后，被土壤吸附的dna含量更低，要針對土壤尿液進(jìn)行dna提取，具有一定難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決上述存在的問題，提供了一種土壤尿液dna提取試劑盒及方法，其解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是：

土壤尿液dna提取試劑盒，包括以下試劑：

（a）土壤裂解液，其組成成分包括表面活性劑、螯合劑、ph緩沖劑；

所述表面活性劑為：十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、月桂?；“彼徕c、聚乙二醇辛基苯基醚、tween20、tween40、tween60、tween80、np40、十六烷基三甲基溴化銨中的一種或兩種及以上的混合，所述表面活性劑的質(zhì)量濃度為1-100g/l，優(yōu)選的表面活性劑成分是十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種的混合，優(yōu)選的表面活性劑質(zhì)量濃度為1-10g/l；

所述螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鉀中的一種或兩種，所述離液鹽的濃度為1-100mmol/l；

所述ph緩沖劑為tris-hcl、tris-醋酸、nah2po4-na2hpo4、kh2po4-k2hpo4、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉，所述ph緩沖劑的ph值為7.0-11，優(yōu)選的ph緩沖劑為tris-hcl，優(yōu)選的ph緩沖劑的ph值為7.5-8.5；

（b）結(jié)合液，其組成成分包括表面活性劑、離液鹽、ph緩沖劑；

所述表面活性劑為：聚乙二醇辛基苯基醚、tween20、tween40、tween60、tween80、np40中的一種或兩種及以上的混合，所述表面活性劑的質(zhì)量濃度為1-100g/l；

所述離液鹽為異硫氰酸胍、鹽酸胍、硫氰酸鉀、高氯酸鈉、碘化鉀、碘化鈉中的一種或兩種及以上的混合，所述離液鹽的濃度為3-5mol/l；

所述ph緩沖劑為tris-hcl、tris-醋酸、nah2po4-na2hpo4、kh2po4-k2hpo4、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉，所述ph緩沖劑的ph值為4.5-7.0；

（c）漂洗液，所述漂洗液為70-80%乙醇；

（d）洗脫液，其組分為：10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/l乙二胺四乙酸二鈉，ph8.0；

（e）硅基dna吸附材料，所述硅基dna吸附材料為二氧化硅納米顆粒、硅膠膜、玻璃纖維膜、石英膜、二氧化硅包裹的磁性納米顆粒中的任意一種。

使用本發(fā)明的試劑盒，用以提取土壤尿液dna的方法，包括以下步驟：

1）dna提取

用土壤裂解液和蛋白酶k裂解含有尿液的土壤樣品，離心分離土壤和上清液，上清液加入結(jié)合液，混合后加入硅基dna吸附材料，分離硅基dna吸附材料和液體，漂洗硅基dna吸附材料，洗脫dna；具體包括以下步驟：

a.刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；

b.最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；

c.將上一步的混合液轉(zhuǎn)移至硅基dna吸附材料，分離液體和硅基dna吸附材料；

d.用漂洗液漂洗硅基dna吸附材料；

e.用洗脫液洗脫硅基吸附材料中的dna；

2）pcr擴(kuò)增及電泳

將上步純化的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在電泳儀中檢測dna。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的土壤尿液dna提取試劑盒及方法，配制好土壤裂解液、結(jié)合液、漂洗液、洗脫液，利用特殊成分的土壤裂解液，在加入結(jié)合液之前，樣品土壤來源的二氧化硅不與dna結(jié)合，離心分離固體顆粒和溶解了dna的上清液，上清液中加入結(jié)合液，混合后轉(zhuǎn)入含有硅基dna吸附材料中，分離液體和硅基dna吸附材料，漂洗硅基dna吸附材料，洗脫獲得純化dna；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)克服了樣品土壤來源的二氧化硅對dna的吸附，從而減少了不必要的dna損失，可達(dá)到獲取高質(zhì)量、高產(chǎn)量土壤尿液dna目的。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中提取的dna的復(fù)合str擴(kuò)增圖譜。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中提取的dna的復(fù)合str擴(kuò)增圖譜。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中提取的dna的復(fù)合str擴(kuò)增圖譜。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例4中提取的dna的復(fù)合str擴(kuò)增圖譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

實(shí)施例1以二氧化硅納米顆粒提取土壤尿液dna。

1）dna提取

刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；混合液轉(zhuǎn)移至裝有15ul二氧化硅納米顆粒的離心管中，混勻后靜止15分鐘；8000rpm離心1分鐘去除上清液；加入500ul漂洗液，混勻，8000rpm離心1分鐘去除上清液；加入500ul漂洗液，混勻，8000rpm離心1分鐘去除上清液；70℃加熱3分鐘；加入20ul洗脫液，震蕩混勻，70℃加熱3分鐘；8000rpm離心1分鐘，上清dna溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

2）pcr擴(kuò)增及電泳

pcr擴(kuò)增使用identifilerplus試劑盒，10μl擴(kuò)增體系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，11分鐘；94℃，20秒，59℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；60℃，10分鐘；4℃保存；電泳在abi3500xl儀器中進(jìn)行；電泳上樣體系為，1μlpcr產(chǎn)物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

實(shí)施例2以硅膠膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；混合液轉(zhuǎn)移至裝有硅膠膜的離心柱中，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，12000rpm離心3分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，70℃加熱3分鐘；加入20ul洗脫液，70℃加熱3分鐘；12000rpm離心1分鐘，丟棄離心柱，離心管中液體即為dna溶液。

2）pcr擴(kuò)增及電泳

pcr擴(kuò)增使用identifilerplus試劑盒，10μl擴(kuò)增體系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，11分鐘；94℃，20秒，59℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；60℃，10分鐘；4℃保存；電泳在abi3500xl儀器中進(jìn)行；電泳上樣體系為，1μlpcr產(chǎn)物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

實(shí)施例3以玻璃纖維膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；混合液轉(zhuǎn)移至裝有玻璃纖維的離心柱中，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，12000rpm離心3分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，70℃加熱3分鐘；加入20ul洗脫液，70℃加熱3分鐘；12000rpm離心1分鐘，丟棄離心柱，離心管中液體即為dna溶液。

2）pcr擴(kuò)增及電泳

pcr擴(kuò)增使用identifilerplus試劑盒，10μl擴(kuò)增體系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，11分鐘；94℃，20秒，59℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；60℃，10分鐘；4℃保存；電泳在abi3500xl儀器中進(jìn)行；電泳上樣體系為，1μlpcr產(chǎn)物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

實(shí)施例4以石英膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；混合液轉(zhuǎn)移至裝有石英膜的離心柱中，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，加入500ul漂洗液，12000rpm離心1分鐘；倒棄收集管中廢液，12000rpm離心3分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，70℃加熱3分鐘；加入20ul洗脫液，70℃加熱3分鐘；12000rpm離心1分鐘，丟棄離心柱，離心管中液體即為dna溶液。

2）pcr擴(kuò)增及電泳

pcr擴(kuò)增使用identifilerplus試劑盒，10μl擴(kuò)增體系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，11分鐘；94℃，20秒，59℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；60℃，10分鐘；4℃保存；電泳在abi3500xl儀器中進(jìn)行；電泳上樣體系為，1μlpcr產(chǎn)物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

實(shí)施例5以二氧化硅包裹的磁性納米顆粒提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表層土壤，烘干，取100-200mg土壤樣品，加入樣品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震蕩混勻后，75℃加熱裂解15分鐘；最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的樣品管中，加入800ul結(jié)合液，混勻；混合液轉(zhuǎn)移至裝有15ul二氧化硅包裹的磁性納米顆粒的離心管中，混勻后靜止15分鐘；上磁力架吸附2分鐘，吸棄上清液；加入500ul漂洗液，混勻，上磁力架吸附1分鐘，吸棄上清；加入500ul漂洗液，混勻，上磁力架吸附1分鐘，吸棄上清；70℃加熱3分鐘；加入20ul洗脫液，震蕩混勻，70℃加熱3分鐘；上磁力架吸附1分鐘，上清dna溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

2）pcr擴(kuò)增及電泳

pcr擴(kuò)增使用identifilerplus試劑盒，10μl擴(kuò)增體系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，11分鐘；94℃，20秒，59℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；60℃，10分鐘；4℃保存；電泳在abi3500xl儀器中進(jìn)行；電泳上樣體系為，1μlpcr產(chǎn)物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。