本發(fā)明涉及rna的擴增技術(shù)領(lǐng)域，具體指一種mrna的正義鏈的整體擴增方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，信使核糖核酸(messengerrna，mrna)是從脫氧核糖核酸(dna)轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈核糖核酸(rna)，它在核糖體上作為蛋白質(zhì)合成的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，決定肽鏈的氨基酸排列順序，是承載生物遺傳信息的重要載體，是參與生命活動多重要分子。但是，當(dāng)科學(xué)研究過程中需要獲得非常大量的mrna時，或可用于提取mrna的標(biāo)本量極少時，常規(guī)的mrna提取方法不足以滿足實驗所需用量，這種情況下，為了獲得足夠量的mrna，需要對從標(biāo)本中提取獲得的mrna進行整體擴增。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種整體擴增mrna的正義鏈的方法，在保證mrna分子完整性的同時解決了常規(guī)的mrna提取方法不足以滿足實驗所需用量的問題。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種整體擴增mrna的正義鏈的方法，包括如下步驟：

a.分別合成以下寡核苷酸：

12種寡核苷酸oligo-1～oligo-12，其每種寡核苷酸的序列分為4個部分，從5’端開始，第1部分為一段通用模板序列，可以作為后續(xù)擴增反應(yīng)時引物結(jié)合的模板，第2部分為a、c兩個堿基，第3部分為重復(fù)t寡核苷酸，第4部分2個堿基為g或a或c與g或a或c或t的隨機組合；

寡核苷酸cap，其寡核苷酸的序列分為3個部分，從5’端開始，第1部分為rna聚合酶的啟動子序列，第2部分為c，第3部分為ggg；

寡核苷酸p1，其寡核苷酸的序列分為3個部分，從5’端開始，第1部分為一段通用模板序列，第2部分為rna聚合酶的啟動子序列，第3部分為c；

寡核苷酸p2；其寡核苷酸的序列，從5’端開始，為rna聚合酶的啟動子序列；

b.將步驟a制備的12種寡核苷酸oligo-1～oligo-12分別取相同摩爾量混合，制得每種寡核苷酸濃度含量相同的寡核苷酸混合液；

c.將從標(biāo)本中提取的總rna與步驟b制得的寡核苷酸混合液、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄緩沖液混合，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并在反應(yīng)過程中間階段加入步驟a制備的寡核苷酸cap，繼續(xù)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；

d.以步驟c獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以步驟a中制備的寡核苷酸p1、p2為引物進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)dna純化后回收。

進一步的，步驟c中的標(biāo)本中提取的總rna的反應(yīng)體系為0.1～2.0μg/20μl反應(yīng)體系，優(yōu)選1.0μg/20μl反應(yīng)體系。根據(jù)實施例1-4，分別選用0.1ug(實施例1-2)、1ug(實施例3)、2ug(實施例4)進行了試驗，結(jié)果表明，0.1ug時產(chǎn)物含量較少、1ug時產(chǎn)物含量相對增多、2ug時產(chǎn)物含量并未比1ug時顯著增加。

進一步的，步驟c中的獲得的寡核苷酸混合液反應(yīng)體系為0.1～2μl/20μl，優(yōu)選1.0μl/20μl反應(yīng)體系。寡核苷酸用量過少會導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄不充分、用量過多會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加或引物二聚體生成。

進一步的，步驟a中獲得的寡核苷酸cap配制為終濃度為120μm的溶液，在步驟c中獲得的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中間階段加入寡核苷酸cap反應(yīng)體系為0.1～2μl/20μ，優(yōu)選1.0μl/20μl反應(yīng)體系，其用量與寡核苷酸混合液用量相對應(yīng)。

進一步的，所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)，主要為m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶或amv逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。

進一步的，所述的整體擴增反應(yīng)通過dna聚合酶實現(xiàn)，主要為taqdna聚合酶、tthdna聚合酶、ventdna聚合酶或pfudna聚合酶，優(yōu)選taqdna聚合酶。

進一步的，所述的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過t7rna聚合酶實現(xiàn)。

進一步的，所述的dna純化反應(yīng)通過無水乙醇/醋酸鈉沉淀法實現(xiàn)。

進一步的，所述的rna純化反應(yīng)通過酚/氯仿/異戊醇萃取法實現(xiàn)。

本發(fā)明方法具有以下優(yōu)越性：

1、保證mrna分子完整性。2、通過擴增獲得大量的mrna。

附圖說明

圖1是實施例2、實施例3、實施例4中起始總rna量和整體擴增獲得dna產(chǎn)物量對比圖。

圖2是實施例5、實施例6中起始整體擴增產(chǎn)物量和體外轉(zhuǎn)錄獲得rna產(chǎn)物量對比圖。

具體實施方式

以下借助實施例，對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不限于此。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不超出本發(fā)明的范圍內(nèi)，可進行各種變更、修正及改變。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：按照要求設(shè)計并合成所需寡核苷酸

按照要求設(shè)計并合成所需寡核苷酸，具體序列見表1。

表1寡核苷酸序列

將寡核苷酸oligo-1～oligo-12按等摩爾比1:1混合，使最終混合液中每種寡核苷酸終濃度均為10μm。

實施例2：逆轉(zhuǎn)錄及整體擴增反應(yīng)1

(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

反應(yīng)總體系20μl。其中，標(biāo)本中提取的總rna0.1μg，寡核苷酸混合液0.1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下：

標(biāo)本中提取的總rna0.1μg

寡核苷酸混合液(10μm)0.1μl

ddh2o補至5μl

輕柔吹打混勻，70℃水浴5min，立即置于冰上5min。

然后加入：

反應(yīng)條件如下：

25℃水浴5min，42℃水浴30min

然后加入：

寡核苷酸cap(120μm)0.1μl

42℃水浴30min，70℃水浴15min。

(2)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的整體擴增：

反應(yīng)總體系20μl。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的整體擴增反應(yīng)如下：

pcr擴增反應(yīng)過程如下：

(a)98℃預(yù)變性3min，，

(b)98℃變性20s，

(c)60℃退火20s，

(d)72℃延伸10min，

(e)重復(fù)(b)-(d)20個循環(huán)，

(f)72℃延伸10min

使用無水乙醇/醋酸鈉沉淀法純化dna。測量dna產(chǎn)物含量。

所獲得dna產(chǎn)物含量為29.7μg

實施例3：逆轉(zhuǎn)錄及整體擴增反應(yīng)2

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中標(biāo)本中提取的總rna為1.0μg，寡核苷酸混合液為1.0μl，寡核苷酸cap為1.0μl，其他條件同前。

所獲得dna產(chǎn)物含量為63.6μg

實施例4：逆轉(zhuǎn)錄及整體擴增反應(yīng)3

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中標(biāo)本中提取的總rna為2.0μg，寡核苷酸混合液為2.0μl，寡核苷酸cap為2.0μl，其他條件同前。

所獲得dna產(chǎn)物含量為67.7μg

實施例5：擴增產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄1

總反體系20μl，擴增產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下：

37℃水浴30min。

然后加入：

dna降解酶1u

37℃水浴15min。

使用酚/氯仿/異戊醇萃取法純化rna。測量rna產(chǎn)物含量。

所獲得rna產(chǎn)物含量為112.4μg

實施例6：擴增產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄2

總反體系40μl，擴增產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下：

37℃水浴30min。

然后加入：

dna降解酶2u

37℃水浴15min。

使用酚/氯仿/異戊醇萃取法純化rna。測量rna產(chǎn)物含量。

所獲得rna產(chǎn)物含量為298.3μg

以上數(shù)據(jù)表明：本方法首先將起始總rna逆轉(zhuǎn)錄為dna并將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行整體擴增，從而獲得大量整體擴增dna產(chǎn)物，然后將整體擴增的dna體外轉(zhuǎn)錄為mrna，從而獲得大量的mrna。本方法可以大量擴增mrna正義鏈，解決了常規(guī)的mrna提取方法不足以滿足實驗所需用量的問題。

sequencelisting

<110>吉林大學(xué)

<120>一種mrna的整體擴增方法

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<170>patentinversion3.5

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<213>未知

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<213>未知

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