本發(fā)明屬于核酸分析與檢測領域，具體涉及一種恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法。
背景技術：
核酸擴增技術在當今的分析檢測領域具有十分重要的意義。食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)控、醫(yī)療診斷、法醫(yī)鑒定等領域無不依賴于核酸擴增技術。最早也是最經典的核酸擴增技術是在耐熱性聚合酶的幫助下，依靠溫度的不斷循環(huán)交替而實現模板變性、引物退火及延伸從而實現目標產物的大量積累，這種技術被稱作聚合酶鏈式反應（pcr）。然而，pcr最大的缺陷也就在于，其不斷的溫度變化過程對儀器（pcr儀）提出了相對高的要求，并進而限制了其擴增速率。恒溫擴增的出現徹底擺脫了對精密溫控設備的依賴，僅僅一個熱塊、一臺水浴鍋甚至一只保溫效果良好的保溫瓶、熱水瓶等即可滿足反應需求。常見的恒溫擴增技術包括：環(huán)介導等溫擴增（lamp）、重組聚合酶擴增（rpa）、鏈置換擴增（sda）、依賴解旋酶的擴增（hda）等等。然而，這些擴增方法反應時間相對較長，或需要多種酶同時工作而造成檢測成本高，或需要特定的核苷酸參與而造成高成本、低反應速率等問題。因此，十分需要一種反應速率快、成本低、操作簡便的恒溫擴增方法。
核酸擴增的另外一個問題在于產物的快速特異性檢測。基于凝膠電泳的方法雖然能夠根據目標產物的分子量大小而對擴增產物進行較為直觀的分析。但是其對專用凝膠成像設備的依賴及操作的費時費力使其不利于現場快速檢測?；诳梢暬@色的鈣黃綠素法、濁度法雖然操作簡便，但無法鑒別非特異性擴增。而實時熒光定量的方法要求反應儀器具有相對精密的光學設備。試紙條檢測方法具有操作簡便、結果易于讀取、特異性強等優(yōu)點而廣受青睞。但是試紙條檢測的缺點是針對某個特殊的分析目標必須對引物實現抗原-抗體修飾或者對目標核酸分子進行探針捕獲。對于某些反應過程中引物會被切斷的反應，針對引物進行抗原抗體修飾顯然并不可取，因此更好的方法是實現探針捕獲。但是探針捕獲的核酸分子往往是單鏈，對于雙鏈核酸分子，探針捕獲顯然并不方便。因此，本發(fā)明的目的是針對恒溫擴增體系提供一種單鏈dna產物的生成方法。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種有助于恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法。
所述單鏈產物生成方法如下：
1）所述恒溫擴增體系包含有兩對引物，f1、r1和bf、br，在某些條件下，f1、r1包含三個部分：靠近引物5’端的固定區(qū)，靠近3’端的能夠與模板進行特異性結合的識別區(qū)及固定區(qū)和識別區(qū)中間的切口酶區(qū)域。
2）所述恒溫擴增體系需要至少兩種酶的參與：其一為具有鏈取代活性的聚合酶，能夠在引物與模板結合之后在引物的3’端加成核苷酸，使得引物的3’不斷延伸，并取代原來模板鏈的互補鏈。其二為具有能夠特異性識別某些特定核苷酸序列位點，并在具有此特異性核苷酸序列位點的雙鏈dna中的其中一條單鏈上產生切口的切口酶。
3）所述恒溫擴增體系至少包含一條核酸阻遏物，能夠與所述恒溫擴增體系的其中一條產物進行很強的互補配對，防止在核酸阻遏物的上游的帶有切口酶位點的引物與所述產物結合后被聚合酶延伸為長的產物鏈。
4）所述單鏈產物的生成方法其具體原理（圖1）為：
（?。┰谀承┓磻獪囟认拢飂1和bf與同一條模板鏈結合，引物bf在引物f1的上游。
（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物f1的3’末端被聚合酶延伸。
（ⅲ）在相同的反應溫度下，引物bf的3’末端被延伸，并取代f1延伸所得的產物s1。
（ⅳ）引物r1和br與產物s1結合，引物br在引物r1的上游。
（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物r1的3’末端被聚合酶延伸。
（ⅵ）在相同的反應溫度下，引物br的3’末端被延伸，并取代r1延伸所得的產物p1。
（ⅶ）在相同的反應條件下，引物f1與產物p1結合，并在聚合酶的作用下延伸引物f1的3’末端，形成雙鏈產物。
（ⅷ）切口酶特異性識別雙鏈dna產物的切口位點，并在雙鏈區(qū)的特異性位點的其中一條dna鏈上產生一缺口。
（ⅸ）在聚合酶的幫助下，具有缺口的dna鏈3’末端繼續(xù)被延伸，并取代原來的切口位點下游的dna鏈。當切口酶濃度較低時，生成產物a1。當切口酶濃度相對過量時，生成產物e1。
（ⅹ）引物r1的識別區(qū)域與產物a1或產物e1結合，并在引物r1的3’末端沿著產物a1或e1進行延伸。同時，核酸阻遏物與a1或e1結合。
（xi）當延伸至核酸阻遏物的位置時，聚合酶的鏈取代作用不足以取代下強堿基互補配對的核酸阻遏物，引物延伸終止。
（xii）切口酶特異性切割出短的延伸產物，單鏈擴增產物生成。
14）所述生成的單鏈dna產物優(yōu)選為30-60nt。
15）所述恒溫核酸擴增的溫度可以為35-65°c。
16）所述核酸阻遏物的3’端與所述反應的中間產物a1或者e1的5’端的距離優(yōu)選為15-22nt。
17）所述核酸阻遏物的濃度優(yōu)選為0.05-0.2um。
18）所述核酸阻遏物的長度優(yōu)選為14-18nt。
19）所述核酸阻遏物的組成可以為不帶修飾的核苷酸，也可以為帶有修飾的核苷酸；可以為肽核酸（pna）、鎖核酸（lna）或其特殊核苷酸。
20）所述核酸阻遏物的gc含量優(yōu)選為30%-60%。
21）所述的核酸阻遏物的3’羥基末端可以進行某些脫羥基修飾，以避免所述核酸阻遏物本身作為引物被延伸，如生物素化、c3-spacer等。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明反應速率快、成本低、操作簡便，能夠通過恒溫擴增方法生成單鏈dna擴增產物，克服背景技術中存在的技術缺陷。
附圖說明
圖1是恒溫擴增體系中利用核酸阻遏物生成單鏈dna擴增產物的方法。
具體實施例
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。
實施例1：以轉基因水稻kmd1的camv35s為模板56°c生成60nt單鏈產物的步驟。
camv35s模板序列：
cacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctc。
camv35s模板的互補序列：
gagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtg。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.bstnbi，6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，500nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。56°c溫浴10min。
針對camv35s雙鏈模板序列設計引物及核酸阻遏物序列如下：
f1：cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga。
r1：cttattgtccgagtcttatttcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：agagactggtgatttc。
核酸阻遏物序列：ccaaatgaaatgaactt-biotin。
單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
針對camv35s雙鏈模板進行擴增生成單鏈產物的具體步驟：
（ⅰ）56°c時，引物f1和bf同時與模板鏈的互補序列結合。
（ⅱ）在bst聚合酶的作用下，引物f1和bf的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物bf的延伸產物將引物f1的延伸產物取代，得到取代產物鏈s1：cttattgtccgagtcttattgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctc。
（ⅳ）引物r1和br與產物鏈s1結合，引物br在上游。
（ⅴ）在bst聚合酶的作用下，引物r1和br的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物br的延伸鏈將引物r1的延伸產物取代，并得到產物p1：
cttattgtccgagtcttatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcaataagactcggacaataag。
（ⅶ）引物f1與產物p1結合，并在bst聚合酶的作用下3’末端被延伸成為雙鏈產物，此雙鏈產物的一條鏈為p1，另一條鏈為p1的互補鏈：
cttattgtccgagtcttattgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaataagactcggacaataag。
（ⅷ）切口酶nt.bstnbi特異性識別f1和p1雙鏈復合物上的切口酶識別位點gagtcnnnn^nn，并在此切口位點處產生缺口。由于此雙鏈復合物的兩端各有一個切口酶位點，且切口酶位點分別在兩條鏈上。當切口酶nt.bstnbi濃度高時，雙鏈復合物的兩端都產生缺口，即p1與其互補鏈上同時產生缺口；當切口酶nt.bstnbi濃度低時，僅p1上產生缺口。
（ⅸ）bst聚合酶在切口位點處繼續(xù)加成dna并取代原來的延伸鏈。在切口酶nt.bstnbi濃度低的條件下，取代產物為a1：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaataagactcggacaataag。
在切口酶nt.bstnbi濃度較高的條件下，取代產物為e1：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaa。
（ⅹ）引物r1與產物a1或者產物e1結合，在bst聚合酶的作用下3’端以a1或者e1為模板進行延伸。同時，核酸阻遏物結合在產物a1或者產物e1上。
（xi）當r1被延伸至核酸阻遏物的位置時，bst聚合酶的鏈取代作用不足以取代下強堿基互補配對的核酸阻遏物，引物延伸終止。
（xii）切口酶nt.bstnbi特異性切割出短的延伸產物，生成單鏈擴增產物l1：tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例2：以轉基因大豆gts40-3-2的cp4epsps為模板65°c生成43nt單鏈產物的步驟。
cp4epsps模板序列：
tggggtttatggaaattggaattgggattaagggtttgtatcccttgtgccatgttgttaatttgtgccattcttgaaagatctgctagagtcagcttgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcct。
cp4epsps模板的互補序列：
aggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgacaagctgactctagcagatctttcaagaatggcacaaattaacaacatggcacaagggatacaaacccttaatcccaattccaatttccataaacccca。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unb.bsrdi，9.6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。65°c溫浴10min。
針對cp4epsps雙鏈模板序列設計引物及核酸阻遏物序列如下：
f1：cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcct。
r1：tttacttaccttcattgccccactatccttcg。
bf：ccattcttgaaagatct。
br：gcaagtggattgatgtg。
核酸阻遏物序列：aagttcatttcatttg-biotin，下劃線堿基修飾lna。
單鏈擴增產物：
cattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
針對cp4epsps雙鏈模板進行擴增生成單鏈產物的具體步驟：
（?。?5°c時，引物f1和bf同時與模板鏈的互補序列結合。
（ⅱ）在bst聚合酶的作用下，引物f1和bf的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物bf的延伸產物將引物f1的延伸產物取代，得到取代產物鏈s1：cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcct。
（ⅳ）引物r1和br與產物鏈s1結合，引物br在上游。
（ⅴ）在bst聚合酶的作用下，引物r1和br的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物br的延伸將引物r1的延伸產物取代，并得到產物p1：
tttacttaccttcattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgacagcaatgaacaagaacaag。
（ⅶ）引物f1與產物p1結合，并在bst聚合酶的作用下3’末端被延伸成為雙鏈產物，此雙鏈產物的一條鏈為p1，另一條鏈為p1的互補鏈：
cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatgaaggtaagtaaa。
（ⅷ）切口酶nb.bsrdi特異性識別f1和p1雙鏈復合物上的切口酶識別位點nn^cattgc，并在含此切口位點處產生缺口。由于此雙鏈復合物的兩端各有一個切口酶位點，且切口酶位點分別在兩條鏈上。當切口酶nb.bsrdi濃度高時，雙鏈復合物的兩端都產生缺口，即p1與其互補鏈上同時產生缺口；當切口酶nb.bsrdi濃度低時，僅p1上產生缺口。
（ⅸ）bst聚合酶在切口位點處繼續(xù)加成dna并取代原來的延伸鏈。在切口酶nb.bsrdi濃度低的條件下，取代產物為a1：
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatgaaggtaagtaaa。
在切口酶nb.bsrdi濃度較高的條件下，取代產物為e1：
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatg。
（ⅹ）引物r1與產物a1或者產物e1結合，在bst聚合酶的作用下3’端以a1或者e1為模板進行延伸。同時，核酸阻遏物結合在產物a1或者產物e1上。
（xi）當r1被延伸至核酸阻遏物的位置時，聚合酶的鏈取代作用不足以取代下強堿基互補配對的核酸阻遏物，引物延伸終止。
（xii）切口酶特異性切割出短的延伸產物，生成單鏈擴增產物l1：cattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例3：以柑橘黃龍病hlb的16srdna為模板35°c生成30nt單鏈產物的步驟。
16srdna模板序列：
gggttgcccccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttggtaggctcttaccctaccaactagctaatccaacgcagg。
16srdna模板的互補序列：
cctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccc。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.alwi，5uphi29dnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1，1um引物r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。35°c溫浴10min。
針對hlb的16srdna雙鏈模板序列設計引物及核酸阻遏物序列如下：
f1：ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtc。
r1：agggtaaacaggatcaataaggctacgatct。
bf：attgtccaatattcc。
br：agctagttggtagggta。
核酸阻遏物序列：cagtgtggctgatcg-biotin，下劃線堿基修飾lna。
單鏈擴增產物：aggctacgatctatagctggtctgagagga。
針對cp4epsps雙鏈模板進行擴增生成單鏈產物的具體步驟：
（?。?5°c時，引物f1和bf同時與模板鏈的互補序列結合。
（ⅱ）在bst聚合酶的作用下，引物f1和bf的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物bf的延伸產物將引物f1的延伸產物取代，得到取代產物鏈s1：ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttggtaggctcttaccctaccaactagctaatccaacgcagg。
（ⅳ）引物r1和br與產物鏈s1結合，引物br在上游。
（ⅴ）在phi29dnapolymerase的作用下，引物r1和br的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物br的延伸將引物r1的延伸產物取代，并得到產物p1：
agggtaaacaggatcaataaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcaaagatccacgaaactaa。
（ⅶ）引物f1與產物p1結合，并在phi29dnapolymerase的作用下3’末端被延伸成為雙鏈產物，此雙鏈產物的一條鏈為p1，另一條鏈為p1的互補鏈：
ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttattgatcctgtttaccct。
（ⅷ）切口酶nt.alwi特異性識別f1和p1雙鏈復合物上的切口酶識別位點ggatcnnnn^nn，并在含此切口位點處產生缺口。由于此雙鏈復合物的兩端各有一個切口酶位點，且切口酶位點分別在兩條鏈上。當切口酶nt.alwi濃度高時，雙鏈復合物的兩端都有產生缺口，即p1與其互補鏈上同時產生缺口；當切口酶nt.alwi濃度低時，僅p1上產生缺口。
（ⅸ）phi29dnapolymerase在切口位點處繼續(xù)加成dna并取代原來的延伸鏈。在切口酶nt.alwi濃度低的條件下，取代產物為a1：
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttattgatcctgtttaccct。
在切口酶nt.alwi濃度較高的條件下，取代產物為e1：
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagcct。
（ⅹ）引物r1與產物a1或者產物e1結合，在phi29dnapolymerase的作用下3’端以a1或者e1為模板進行延伸。同時，核酸阻遏物結合在產物a1或者產物e1上。
（xi）當r1被延伸至核酸阻遏物的位置時，phi29dnapolymerase的鏈取代作用不足以取代下強堿基互補配對的核酸阻遏物，引物延伸終止。
（xii）切口酶nt.alwi特異性切割出短的延伸產物，單鏈擴增產物l1生成：
aggctacgatctatagctggtctgagagga。
實施例4：以轉基因水稻kmd1的camv35s為模板65°c生成30nt單鏈產物。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unb.bsrdi，9.6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，500nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，200nm核酸阻遏物。65°c溫浴10min。
引物序列：
f1：ctgttctgtccattgcgatgcctctgcc。
r1：ctgttctgtccattgctttccacgatgc。
bf：ctcctcggattccattgcc。
br：ggattgtgcgtcatccctta。
核酸阻遏物：ctcgtgggtgggggtcc-c3spacer。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例1，但所述的中間產物及擴增產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈dna產物序列：gatgcctctgccgacagtggtcccaaagat。
實施例5：以轉基因水稻kmd1的camv35s為模板35°c生成60nt單鏈產物。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.alwi，5uphi29dnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1，1um引物r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。35°c溫浴10min。
引物序列：
f1：ggtttagtgcggatctgagtgacgtaaggga。
r1：ttgtcgtcttggatccctgttcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：agagactggtgatttc。
核酸阻遏物序列：ccaaatgaaatgaactt-biotin，下劃線堿基修飾lna。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例3，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例6：核酸阻遏物長為18nt。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.bstnbi，6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，80nm核酸阻遏物。56°c溫浴10min。
引物序列：
f1：cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga。
r1：tttgtcgtttgagtctagttgtcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：aatttgtgccattcttgaaaga。
核酸阻遏物序列：aggaagttcatttcattt-c3spacer。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例1，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatata。
實施例7：核酸阻遏物長為14nt。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.bstnbi，6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，80nm核酸阻遏物。56°c溫浴10min。
f1：cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga。
r1：tttgtcgtttgagtctagttgtcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：aatttgtgccattcttgaaaga。
核酸阻遏物序列：aggaagttcatttc-c3spacer。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例1，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatata。
實施例8：核酸阻遏物的gc含量為30%
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.bstnbi，6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，500nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。56°c溫浴10min。
f1：cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga。
r1：cttattgtccgagtcttattgtcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：aatttgtgccattcttgaaaga。
核酸阻遏物序列：aagttcatttcatttgga-c3spacer。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例1，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例9：核酸阻遏物的gc含量為60%
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unb.bsrdi，9.6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，500nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，200nm核酸阻遏物。65°c溫浴10min。
引物序列：
f1：ctgttctgtccattgcgatgcctctgcc。
r1：ctgttctgtccattgctttccacgatgc。
bf：ctcctcggattccattgcc。
br：ggattgtgcgtcatccctta。
核酸阻遏物：cggtcccaaagatgg-biotin。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例2，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈dna產物序列：tttttccacgatgctcctcgtgggtgggggt。
實施例10：核酸阻遏物采用肽核酸pna修飾
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.bstnbi，6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，500nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。56°c溫浴10min。
f1：cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga。
r1：cttattgtccgagtcttattgtcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：aatttgtgccattcttgaaaga。
核酸阻遏物序列：aagttcatttcatttgga-c3spacer，下劃線堿基修飾pna。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例1，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例11：核酸阻遏物采用鎖核酸lna修飾
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.alwi，5uphi29dnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1，1um引物r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。35°c溫浴10min。
引物序列：
f1：ggtttagtgcggatctgagtgacgtaaggga。
r1：ttgtcgtcttggatccctgttcagcgtgtcct。
bf：tcaaagcaagtggattgatgtg。
br：agagactggtgatttc。
核酸阻遏物序列：ccaaatgaaatgaactt-biotin，下劃線堿基修飾lna。
單鏈核酸產物的生成步驟同實施例3，但所述的中間產物及擴增終產物的序列根據具體實施例發(fā)生變化。
單鏈擴增產物：
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
實施例12：核酸阻遏物的3’端與中間產物a1或者e1的5’端的距離為15nt。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unt.alwi，5uphi29dnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1，1um引物r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。35°c溫浴10min。
引物序列：
f1：ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtc。
r1：agggtaaacaggatcaataaggctacgatct。
bf：attgtccaatattcc。
br：agctagttggtagggta。
核酸阻遏物序列：cgatcagccacact-biotin，下劃線為lna修飾。
取代產物為a1：
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttattgatcctgtttaccct。
取代產物為e1：
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagcct。
單鏈擴增產物：
aggctacgatctatagctggtctgagagga。
實施例13：核酸阻遏物的3’端與中間產物a1或者e1的5’端的距離為22nt。
反應前試劑的準備：在pcr管中加入50ul反應試劑：10unb.bsrdi，9.6ubstdnapolymerase，2.5ulnebuffer3，5ulthermopolreactionbuffer，300umdntp，200nm引物f1和r1，50nm引物bf和br，2.5ul模板，50nm核酸阻遏物。65°c溫浴10min。
針對cp4epsps雙鏈模板序列設計引物及核酸阻遏物序列如下：
f1：cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcct。
r1：tttacttaccttcattgccccactatccttcg。
bf：ccattcttgaaagatct。
br：gcaagtggattgatgtg。
核酸阻遏物序列：aagttcatttcatttgg-biotin。
取代產物為a1：
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatgaaggtaagtaaa。
取代產物為e1：
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatg。
單鏈擴增產物：
cattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg。
sequencelisting
<110>浙江大學
<120>一種有助于恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法
<130>
<160>106
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>165
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
cacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcaca60
atcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagag120
gacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctc165
<210>2
<211>165
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaat60
gaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatccctt120
acgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtg165
<210>3
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga31
<210>4
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
cttattgtccgagtcttatttcagcgtgtcct32
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>6
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
agagactggtgatttc16
<210>7
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
ccaaatgaaatgaactt17
<210>8
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>9
<211>145
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
cttattgtccgagtcttattgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaag60
acccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagt120
ctctctctacaaatctatctctctc145
<210>10
<211>130
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
cttattgtccgagtcttatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatata60
gaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcaataagactc120
ggacaataag130
<210>11
<211>130
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
cttattgtccgagtcttattgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaag60
acccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaataagactc120
ggacaataag130
<210>12
<211>111
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
aagttcatttcatttggagaggacacgctgaaataagactcggacaataag111
<210>13
<211>92
<212>dna
<213>人工序列
<400>13
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
aagttcatttcatttggagaggacacgctgaa92
<210>14
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>14
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>15
<211>261
<212>dna
<213>人工序列
<400>15
tggggtttatggaaattggaattgggattaagggtttgtatcccttgtgccatgttgtta60
atttgtgccattcttgaaagatctgctagagtcagcttgtcagcgtgtcctctccaaatg120
aaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatc180
ccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtc240
ttctttttccacgatgctcct261
<210>16
<211>261
<212>dna
<213>人工序列
<400>16
aggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgt60
gatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcc120
tctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgacaagctgactctagcaga180
tctttcaagaatggcacaaattaacaacatggcacaagggatacaaacccttaatcccaa240
ttccaatttccataaacccca261
<210>17
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>17
cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcct32
<210>18
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>18
tttacttaccttcattgccccactatccttcg32
<210>19
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>19
ccattcttgaaagatct17
<210>20
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>20
gcaagtggattgatgtg17
<210>21
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<400>21
aagttcatttcatttg16
<210>22
<211>43
<212>dna
<213>人工序列
<400>22
cattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg43
<210>23
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<400>23
cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatata60
gaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagata120
tcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctc180
ct182
<210>24
<211>106
<212>dna
<213>人工序列
<400>24
tttacttaccttcattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagtt60
catttcatttggagaggacacgctgacagcaatgaacaagaacaag106
<210>25
<211>106
<212>dna
<213>人工序列
<400>25
cttgttcttgttcattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatata60
gaggaagggtcttgcgaaggatagtggggcaatgaaggtaagtaaa106
<210>26
<211>94
<212>dna
<213>人工序列
<400>26
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtct60
tgcgaaggatagtggggcaatgaaggtaagtaaa94
<210>27
<211>82
<212>dna
<213>人工序列
<400>27
cattgctgtcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtct60
tgcgaaggatagtggggcaatg82
<210>28
<211>43
<212>dna
<213>人工序列
<400>28
cattgccccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg43
<210>29
<211>154
<212>dna
<213>人工序列
<400>29
gggttgcccccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgt60
ctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagccttggtagg120
ctcttaccctaccaactagctaatccaacgcagg154
<210>30
<211>154
<212>dna
<213>人工序列
<400>30
cctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctatagctg60
gtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc120
agcagtggggaatattggacaatgggggcaaccc154
<210>31
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>31
ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtc32
<210>32
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>32
agggtaaacaggatcaataaggctacgatct31
<210>33
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<400>33
attgtccaatattcc15
<210>34
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>34
agctagttggtagggta17
<210>35
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<400>35
cagtgtggctgatcg15
<210>36
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>36
aggctacgatctatagctggtctgagagga30
<210>37
<211>119
<212>dna
<213>人工序列
<400>37
ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagacc60
agctatagatcgtagccttggtaggctcttaccctaccaactagctaatccaacgcagg119
<210>38
<211>97
<212>dna
<213>人工序列
<400>38
agggtaaacaggatcaataaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccac60
actgggactgagacacggcaaagatccacgaaactaa97
<210>39
<211>97
<212>dna
<213>人工序列
<400>39
ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagacc60
agctatagatcgtagccttattgatcctgtttaccct97
<210>40
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>40
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagcctt60
attgatcctgtttaccct78
<210>41
<211>59
<212>dna
<213>人工序列
<400>41
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagcct59
<210>42
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>42
aggctacgatctatagctggtctgagagga30
<210>43
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>43
ctgttctgtccattgcgatgcctctgcc28
<210>44
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>44
ctgttctgtccattgctttccacgatgc28
<210>45
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>45
ctcctcggattccattgcc19
<210>46
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>46
ggattgtgcgtcatccctta20
<210>47
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>47
ctcgtgggtgggggtcc17
<210>48
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>48
gatgcctctgccgacagtggtcccaaagat30
<210>49
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>49
ggtttagtgcggatctgagtgacgtaaggga31
<210>50
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>50
ttgtcgtcttggatccctgttcagcgtgtcct32
<210>51
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>51
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>52
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<400>52
agagactggtgatttc16
<210>53
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>53
ccaaatgaaatgaactt17
<210>54
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>54
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>55
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>55
cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga31
<210>56
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>56
tttgtcgtttgagtctagttgtcagcgtgtcct33
<210>57
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>57
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>58
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>58
aatttgtgccattcttgaaaga22
<210>59
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>59
aggaagttcatttcattt18
<210>60
<211>57
<212>dna
<213>人工序列
<400>60
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatata57
<210>61
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>61
cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga31
<210>62
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>62
tttgtcgtttgagtctagttgtcagcgtgtcct33
<210>63
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>63
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>64
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>64
aatttgtgccattcttgaaaga22
<210>65
<211>14
<212>dna
<213>人工序列
<400>65
aggaagttcatttc14
<210>66
<211>57
<212>dna
<213>人工序列
<400>66
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatata57
<210>67
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>67
cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga31
<210>68
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>68
cttattgtccgagtcttattgtcagcgtgtcct33
<210>69
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>69
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>70
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>70
aatttgtgccattcttgaaaga22
<210>71
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>71
aagttcatttcatttgga18
<210>72
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>72
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>73
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>73
ctgttctgtccattgcgatgcctctgcc28
<210>74
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>74
ctgttctgtccattgctttccacgatgc28
<210>75
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>75
ctcctcggattccattgcc19
<210>76
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>76
ggattgtgcgtcatccctta20
<210>77
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<400>77
cggtcccaaagatgg15
<210>78
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>78
tttttccacgatgctcctcgtgggtgggggt31
<210>79
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>79
cttattgtccgagtcttattgacgtaaggga31
<210>80
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>80
cttattgtccgagtcttattgtcagcgtgtcct33
<210>81
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>81
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>82
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>82
aatttgtgccattcttgaaaga22
<210>83
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>83
aagttcatttcatttgga18
<210>84
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>84
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>85
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>85
ggtttagtgcggatctgagtgacgtaaggga31
<210>86
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>86
ttgtcgtcttggatccctgttcagcgtgtcct32
<210>87
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>87
tcaaagcaagtggattgatgtg22
<210>88
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<400>88
agagactggtgatttc16
<210>89
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>89
ccaaatgaaatgaactt17
<210>90
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<400>90
tgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataagg60
<210>91
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>91
ttagtttcgtggatctttgccgtgtctcagtc32
<210>92
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>92
agggtaaacaggatcaataaggctacgatct31
<210>93
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<400>93
attgtccaatattcc15
<210>94
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<400>94
agctagttggtagggta17
<210>95
<211>14
<212>dna
<213>人工序列
<400>95
cgatcagccacact14
<210>96
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>96
ccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcgtcctctcagaccagctatagatcgtagcctt60
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