本發(fā)明涉及生物技術領域，主要涉及一種大豆蛋白的應用及其表達載體和制備方法。

背景技術：

牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，現有技術多使用添加bsa(牛血清白蛋白)來保護蛋白類生物制品。例如在westernblot中作為blockingagent；在酶切反應緩沖液中加入bsa，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，能減輕有些不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性。但是bsa來源于動物，存在一定的使用風險，在堿性環(huán)境下很容易被被蛋白酶水解，同時因為具有多個酶切位點，所以很容易形成多種不同大小的多肽片段，可能導致目的蛋白純度下降，并且具有潛在的血源性病原體污染，應用中并不安全。

因此，現有技術還有待于改進和發(fā)展。

技術實現要素：

鑒于上述現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大豆蛋白的應用及其表達載體和制備方法，旨在解決現有bsa用于保護蛋白類生物制品存在風險的問題。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種大豆蛋白的應用，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，將所述大豆蛋白用于制備凍存蛋白類生物制品的保護劑。

所述的大豆蛋白的應用，其中，所述凍存蛋白類生物制品為酶制劑。

一種大豆蛋白的制備方法，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，其制備方法包括以下步驟：

擴增目的基因：以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如seqidno.4所示；

構建重組質粒：將目的基因片段與經ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產物，構建pet-28a重組質粒；

轉化感受態(tài)細胞：將pet-28a重組質粒轉化大腸桿菌bl21star感受態(tài)細胞；

誘導表達：將含有pet-28a重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)，加入1‰iptg貯存液過夜誘導，將誘導后的菌體離心收集，重懸，破碎菌體，離心，取上清液，得總可溶性蛋白；

蛋白分離純化：對所得的總可溶性蛋白進行親和層析，分離純化目的蛋白。

所述的大豆蛋白的制備方法，其中，構建重組質粒過程中，包括以下步驟：

將目的基因片段和經過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

所述的大豆蛋白的制備方法，其中，誘導表達過程中，包括以下步驟：

將含有pet-28a重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)，加入1‰iptg貯存液，在16℃下150rmp過夜誘導，將誘導后的菌體離心收集，用balancebuffer重懸，破碎菌體，在4℃，10000rmp下離心30min，取上清液。

所述的大豆蛋白的制備方法，其中，蛋白分離純化過程中，包括以下步驟：

將總可溶性蛋白經鎳離子親和層析，利用蛋白脫鹽柱去除蛋白溶液中的咪唑，將脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥，用pbs緩沖液復溶，用分子篩分離純化凝血酶酶切產物。

一種用于制備大豆蛋白的引物，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

一種用于制備大豆蛋白的表達載體，其中，所述表達載體為攜帶有seqidno.4所示的大豆蛋白基因，用于表達基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白。

所述的用于制備大豆蛋白的表達載體，其中，所述表達載體用pet-28a蛋白表達載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點ndei和xhoi連接在表達載體上。

有益效果：大豆熱穩(wěn)定蛋白有許多生物學功能特性，近來的研究發(fā)現，在脅迫條件(如干旱、高溫、冷凍等)下，其可以提高蛋白抵抗逆境能，能夠對生物膜和蛋白質等生物大分子發(fā)揮良好的保護作用。大豆蛋白屬于植物，安全性較高，如果投入到生產應用中，能夠較好解決蛋白類產品在運輸過程中經冷凍脅迫活性降低的問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中利用pcr擴增大豆基因片段的電泳結果圖(m為dl2000marker)。

圖2為本發(fā)明實施例1中利用菌落pcr驗證重組菌的電泳結果圖(m為dl2000marker)。

圖3為本發(fā)明實施例5中17號蛋白的誘導表達的電泳結果圖。

圖4為本發(fā)明實施例7中17號蛋白的表達純化的電泳結果圖。

圖5為本發(fā)明實施例7中western-blotting結果圖。

圖6為本發(fā)明實施例8中不同溶液下蛋白二級結構的數據示意圖。

圖7為本發(fā)明實施例9中l(wèi)dh酶的殘留酶活柱狀圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種大豆蛋白的應用及其表達載體和制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所提供的一種大豆蛋白的應用，是將所述大豆蛋白用于制備凍存蛋白類生物制品的保護劑。其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1。所述凍存蛋白類生物制品可以為酶制劑。

所述大豆蛋白的基因序列(seqidno.1)如下所示：

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtcctaactctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaacaccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacacataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcctggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttagatctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaataacaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacagacgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaatcatatatgtaaggaagtgatcctatata。

本發(fā)明中，以r0期和r15期大豆胚根作為實驗材料，采用100℃熱處理10min后離心獲得上清，富集得到的可溶性蛋白即為熱穩(wěn)定蛋白。根據蛋白組學和結構預測結果，在r0期高表達蛋白中挑選了1個蛋白進行結構和功能分析，該蛋白即本發(fā)明所述大豆蛋白。本發(fā)明中還提供用于擴增該大豆蛋白基因序列的引物，根據pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’(seqidno.2)；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’(seqidno.3)。

本發(fā)明中還提供一種用于制備該大豆蛋白的表達載體，所述表達載體用pet-28a蛋白表達載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點ndei和xhoi連接在表達載體上。

本發(fā)明中還提供一種上述大豆蛋白的制備方法，其制備方法包括以下步驟：

擴增目的基因：根據pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內切酶(ndei)和(xhoi)，以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增，得到目的基因片段；目的基因片段的基因序列(seqidno.4)如下所示：

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctga。

構建重組質粒：將目的基因片段與經ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產物，構建pet-28a重組質粒。pet-28a重組質粒的基因序列(seqidno.5)如下所示：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttatctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttcaaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgttttgtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgtctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctcagttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattggatttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacgagtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaaccttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgcttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatcttttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcactgattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgggcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcctgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaactgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgccaccctccttctccactgcgctcgccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgca601ccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctg651cttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccag1051cgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaa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轉化感受態(tài)細胞：將pet-28a重組質粒轉化大腸桿菌bl21star感受態(tài)細胞；

誘導表達：將含有pet-28a重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)，加入1‰iptg貯存液過夜誘導，將誘導后的菌體離心收集，重懸，破碎菌體，離心，取上清液，得總可溶性蛋白；

蛋白分離純化：對所得的總可溶性蛋白進行親和層析，分離純化目的蛋白。

構建重組質粒過程中，可以包括以下步驟：

將目的基因片段和經過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

誘導表達過程中，可以包括以下步驟：

將含有pet-28a重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)，加入1‰iptg貯存液，在16℃下150rmp過夜誘導，將誘導后的菌體離心收集，用balancebuffer重懸，破碎菌體，在4℃，10000rmp下離心30min，取上清液。

蛋白分離純化過程中，可以包括以下步驟：

將總可溶性蛋白經鎳離子親和層析，利用蛋白脫鹽柱去除蛋白溶液中的咪唑，將脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥，用pbs緩沖液復溶，用分子篩分離純化凝血酶酶切產物。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：基因的克隆

根據pmd19-t載體和基因的序列特點引入相應酶切位點的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。

引物：f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

以基因的f和r作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進行pcr擴增。反應體系為5×phusionhfbuffer4μl，2.5mmdntp1.6μl，上下游引物各10mm，cdna模板1μl，dmso0.6μl，用水補齊至20μl。在pcr儀上98℃預反應30s，98℃反應5s，退火溫度依據引物tm值而定，72℃延伸反應時間依據基因長度而定，72℃10min，將反應產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離pcr產物，用紫外燈檢測，并按照核酸回收試劑盒的說明書操作收集特異性擴增產物。將擴增回收產物與takara的pmd19-tsimple載體按照摩爾比10:1的比例混合，加入等體積的solutionⅰ反應緩沖液，混勻后，輕微離心，置于16℃下水浴連接過夜。

本實施例中，是根據ncbi數據庫中的核酸序列設計引物，以大豆胚根總cdna為模板，利用pcr方法擴增挑選出來的基因的序列，pcr產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，擬擴增基因得到有效擴增，基因的分子量大小與預期分子量大小相近(如圖1所示)，連接t載后進行測序。將測序成功的克隆載體與蛋白表達載體pet-28a經雙酶切后，通過t4連接酶連接酶切產物，構建pet-28a/重組質粒，然后將重組質粒轉化大腸桿菌bl21star，利用菌落pcr法對重組菌進行驗證(如圖2所示)。結果顯示構建成功的重組菌能擴增到目的片段，表明成功構建含目的基因的原核表達載體。

實施例2：超級感受態(tài)的制備及轉化

按照上海生工提供的超級感受態(tài)試劑盒提供的方法制備大腸桿菌top10和bl21star感受態(tài)，在超凈工作臺中挑取劃線培養(yǎng)的大腸桿菌單克隆菌株于5ml的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃，180rmp恒溫搖床中培養(yǎng)12h后，按照1:50比例接種到50ml新鮮配制的lb培養(yǎng)基中，至od600值約為0.6。將用50ml離心管收集菌體，8,000g離心3min。棄上清后將菌體冰上放置10min，4℃，5,000rmp離心5min，用試劑盒提供的buffera將菌體重懸后于冰上放置30min，4℃，

5,000rmp離心5min，棄上清液，用試劑盒提供的bufferb(用前-20℃預冷)重懸菌體，用滅菌的1.5mlep管分裝，每管100μl。在-80℃冰箱中備用。

將10μl連接產物加入到含有100μl大腸桿菌感受態(tài)中，輕微混勻。將大腸桿菌感受態(tài)細胞放置于冰上30min，42℃熱激90s，冰上5min，加入900μl新鮮配制的lb液體培養(yǎng)基。在37℃，180rmp恒溫搖床中培養(yǎng)1h，取300μl菌液涂布于含有相應抗生素的lb固體培養(yǎng)基中，37℃下倒置培養(yǎng)15h。

實施例3：質粒提取

利用omega公司提供的質粒提取試劑盒操作，取1ml菌液于1.5ml的ep管中，8,000rmp，離心1min，重復3次，棄上清。向裝有菌體的ep管中加入bufferi200μl，用移液器充分吹打混勻后加入200μlbufferii，輕微顛倒混勻2次，室溫靜置1min，加入bufferiii300μl，顛倒混勻3次，整個過程不要超過5min。室溫，12,000rmp離心15min，吸取上清500μl，加入平衡好的核酸收集柱中，室溫，12,000rmp離心1min，棄廢液后向核酸收集柱中加入500μlhbbuffer，室溫12,000rmp離心1min，棄廢液，加入試劑盒中的600μlwbbuffer(預先加入800ml無水乙醇)，室溫12,000rmp離心1min重復2次，將核酸收集柱空轉，15,000rmp離心2min除去殘留的wbbuffer。向核酸收集柱內加入30μl無菌水，用一個新ep管收集質粒，室溫12,000rmp離心2min。

實施例4：蛋白表達載體的構建

將含目的基因的pmd19-t載體按照基因引物設計的酶切位點做雙酶切反應，反應體系為限制性內切酶各1μl，質粒1μg，反應buffer2μl，用水補齊至10μl，反應5h，將反應產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切產物，在紫外燈下檢測?；厥漳康幕蚱?，將目的基因片段和經過雙酶切的pet-28a蛋白表達載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補齊至10μl，16℃連接過夜。

實施例5：重組子的菌落pcr驗證

將連接產物轉化大腸桿菌bl21star感受態(tài)細胞，挑取少量長有轉化子的菌斑為模板，以引物來驗證重組子，pcr反應體系與過程同基因克隆。

在本實施例中，將構建成功的pet-28a/蛋白重組菌擴大培養(yǎng)，加入0.1mmiptg在16℃下誘導12小時，離心收集菌并用balancebuffer重懸菌體，通過超聲破碎重組菌的細胞膜離心取上清液即為重組菌的總可溶性蛋白，以pet-28a空載體誘導前后為對照，如圖3所示，其中，1-4分別為bl21誘導前，bl21誘導后，17號蛋白誘導前，17號蛋白誘導后(理論分子量為12.3kda)。從結果可以看出經過sds-page電泳檢測重組菌得到表達。

實施例6：蛋白的誘導表達

將含有重組質粒的菌株擴大培養(yǎng)至含有1‰kana貯存液的500mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600約0.6，加入1‰iptg貯存液，在16℃下150rmp過夜誘導，將誘導后的菌體離心收集用balancebuffer重懸，經超聲破碎菌體后，在4℃，10,000rmp下離心30min，取上清液進行后續(xù)的分離純化。

實施例7：蛋白的分離純化

利用親和層析純化蛋白，設置a泵流速3ml/min。用約50ml去離子水洗去與sepharose吸附的乙醇。用約30ml0.5m氫氧化鈉洗去柱子上的殘留的蛋白。用約80ml去離子水洗去氫氧化鈉。上樣約30ml硫酸鎳，使鎳離子與sepharose結合。用約70ml去離子水，洗去未結合的鎳離子。用約50mlbalancebuffer平衡純化柱。上樣蛋白溶液。用約50mlbalancebuffer洗去與鎳離子未結合的蛋白。調節(jié)b泵流量至10％(b泵中為500mm咪唑)洗去與鎳離子弱結合蛋白；依次遞增b泵流量梯度洗脫并收集蛋白。蛋白收集后清洗純化柱，設置b泵流量為零，用去離子水洗純化柱，至電導率為零。用60mledta洗去鎳離子。用去離子水清洗洗純化柱，直至電導率為零。用60ml0.5m氫氧化鈉洗去純化柱中殘留的蛋白。用去離子水清洗純化柱，直至電導率為零。用20％乙醇封柱以防止細菌滋生，純化柱于4℃保存。

利用蛋白脫鹽柱去除蛋白溶液中的咪唑。設置a泵流速4ml/min，用去離子水約50ml洗去脫鹽柱中的乙醇。蛋白上體積樣小于10ml，體積過大會影響分離效果。用去離子水洗脫出目的蛋白。蛋白脫鹽后清洗脫鹽柱，用0.2m氫氧化鈉洗去殘留的蛋白并活化脫鹽柱。用約50ml去離子水，洗去氫氧化鈉；用20％乙醇封柱以防止細菌滋生，脫鹽柱于4℃保存。

將脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥，用pbs緩沖液復溶，按照定量結果以1u凝血酶與1mg融合蛋白混合，4℃，酶切過夜。

用分子篩分離純化凝血酶酶切產物。設置a泵流速1ml/min，用去離子水洗1個柱體積。上樣蛋白2ml，用去離子水洗脫出目的蛋白。收集目的蛋白后清洗分子篩，用0.2m氫氧化鈉洗脫約2個柱體積。用去離子水洗至電導率峰為零。用含有0.2m醋酸鈉的20％乙醇封柱以防止細菌滋生。

本實施中為了獲得功能驗證的蛋白，將在大腸桿菌表達的重組菌中的總可溶性蛋白經鎳離子親和層析，分離純化目的蛋白，所用層析柱參數如下：柱長：20cm；直徑：16mm，填料：chelatingsepharosefastflow4btm，填料體積：10ml；廠家：amershambiosciences流速為3ml/min。

理論分子量為33.8kda，結果如圖4所示，其中，1為純化后，2為切標簽后。

為了避免his標簽對蛋白結構的測定與功能的驗證，純化后，用凝血酶切除his標簽，獲得實驗所需蛋白。his標簽是由6個組氨酸組成的短肽，專門設計用于重組蛋白質的吸附純化，是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種。利用his抗體可以檢測帶有his標簽的融合蛋白。通過western-blotting檢測凝血酶酶切前后的蛋白，如圖5所示。

實施例8：圓二色譜法測定蛋白的二級結構

用去離子水溶解蛋白，根據定量結果將蛋白配制成100μm的母液。將母液稀釋成500μl，終濃度為10μm，用于二級結構的測定。將待測的蛋白樣品加入比色皿中，分別以去離子水、不同濃度tfe以及sds緩沖液的吸收值為背景，設定檢測掃描范圍250nm-190nm，掃描頻率為1nm。將測得數據利用在線圓二數據分析軟件dichroweb計算蛋白的二級結構，結果如圖6所示。

圓二色譜常用來測定蛋白的二級結構。一個典型的α-螺旋在208nm和222nm附近有一個負峰，在192nm處有一個正峰；β-折疊在190nm左右有一個正峰，在215nm處有一個負峰；無規(guī)則卷曲在198nm左右有一個負峰。本實驗測定了經過大腸桿菌原核表達純化后的蛋白在水溶液以及不同濃度的tfe和sds溶液中的二級結構(圖6)。通過在線軟件計算了每個蛋白二級結構的α-螺旋和無序結構的比例，并與預測結果比較，cd實際測得蛋白無規(guī)則卷曲的含量與預測結果趨勢基本相同。

實施例9：反復凍融條件下ldh酶的殘留酶活測定

ldh酶是糖酵解代謝途徑中的一種關鍵酶，能在含游離氫離子條件下催化丙酮酸和還原型輔酶ⅰ(nadh)反應生成乳酸和氧化態(tài)的輔酶ⅰ。鑒于還原型輔酶ⅰ在340nm處有最大吸收峰，因此可以通過檢測在340nm處的吸收峰的減少值來檢測反應進程。本實驗在含有底物丙酮酸和還原型輔酶ⅰ的反應體系中加入ldh酶，通過檢測反應過程中340nm處光吸收值的改變來測定ldh酶的活力。

ldh酶溶液的配制：將蛋白與ldh酶按照摩爾比(蛋白：ldh酶)為1:1、5:1和10:1的比例配制成70μl的酶溶液，將酶溶液各自分成6分，每份10ul，3份進行凍融脅迫，另外3份不進行凍融脅迫。將酶溶液放入液氮速度1min，然后置于25℃溫控板下融化5min，反復進行6次。取5μl反復凍融后的酶液加入到含有2ml的的反應底物(10mmol/l磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀，ph＝7.5,7.5mmol/l丙酮酸，0.1mmol/還原型輔酶ⅰ)，通過紫外分光光度計檢測在反應2min中內在a340的減少值，每個反應3次，重復3次，計算9次反應的平均值和標準差。根據在反應2min內凍融后a340差值占凍融前a340差值的百分比來計算殘留酶活，以殘留酶活的值為縱坐標，以蛋白與ldh酶的摩爾比為橫坐標，繪制ldh酶的殘留酶活柱狀圖，如圖7所示，可反應純化后的蛋白在凍融條件下對ldh酶的保護作用。

本實施例中將溶菌酶或純化后的目的蛋白與ldh酶按照摩爾比(1:1、5:1、10:1)比例混合，反復凍融6次后測定ldh酶的殘留酶活。在凍融脅迫條件下，溶菌酶對ldh幾乎沒有保護作用。但是加入純化后的蛋白均具有對ldh酶的保護能力。

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。

sequencelisting

<110>深圳大學

<120>一種大豆蛋白的應用及其制備方法和表達載體、引物

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>大豆（glycinemax(linn.)merr.）

<223>基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白基因序列

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<223>目的基因片段的基因序列

<400>4

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