本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法其及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中成藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上具有重要地位。利用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖進(jìn)而發(fā)酵獲得生物乙醇，可以避免對糧食作物的大量損耗，引起了各國政府和研究機(jī)構(gòu)的重視。
纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、軟體動物、原生動物、細(xì)菌、放線菌、真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶，目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌，研究得較多的有木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中絲狀真菌中的木霉屬(包括里氏木霉、康氏木霉及綠色木霉等)是目前發(fā)現(xiàn)的對纖維素降解最有效的種屬之一。目前用于產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物主要有微晶纖維素、濾紙、羧甲基纖維素鈉、玉米芯等，但是利用這些產(chǎn)纖維素酶誘導(dǎo)物制備出的纖維素酶的活性低，對天然木質(zhì)素的分解能力弱、生產(chǎn)周期長以及價格昂貴，嚴(yán)重的制約了其工業(yè)化應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)纖維素酶誘導(dǎo)物制備出的纖維素酶的活性低，對天然木質(zhì)素的分解能力弱、生產(chǎn)周期長以及價格昂貴，嚴(yán)重的制約其工業(yè)化應(yīng)用的問題。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法，包括以下步驟：
步驟1，將玉米芯粉碎后過篩，得到玉米芯粉；
步驟2，將步驟1中得到的玉米芯粉與稀h2so4溶液按照1g：10～15ml的比例混合，然后以250～300r/min的速度攪拌15～30min，攪拌完畢后靜置10～30min，得到玉米芯粉的酸處理混合物，將玉米芯粉的酸處理混合物在85～95℃下保溫2h，保溫結(jié)束后采用濾膜過濾，得到的濾餅用水洗至中性，得到酸處理玉米芯粉；
步驟3，將步驟2中得到的酸處理玉米芯粉與naoh溶液按照1g：10～15ml的比例混合后置于55～65℃的水浴中保溫3～5h，保溫結(jié)束后趁熱采用濾膜過濾，得到的濾餅先用質(zhì)量百分比濃度為0.3～0.6％的naoh溶液洗至洗脫液為無色，再用水洗至中性，得到堿處理玉米芯粉，將堿處理玉米芯粉烘干至含水率≤10％，即得到所述用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物。
優(yōu)選的，所述步驟1中玉米芯粉碎后過40目篩。
優(yōu)選的，所述步驟2中所用稀h2so4的體積百分比濃度為0.3～0.6％。
優(yōu)選的，所述步驟2、所述步驟3中所用濾膜孔徑均為0.45μm。
優(yōu)選的，所述步驟3中所用naoh溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.3～0.6％。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物在木霉生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物以玉米芯為原料，分別采用酸處理和堿處理后將其應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，能夠誘導(dǎo)木霉產(chǎn)生大量的纖維素酶，尤其是能夠提高濾紙酶的量，從而提高木霉的產(chǎn)纖維素酶能力，降低了生產(chǎn)成本，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施方式
為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實施，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明中所用里氏木霉菌購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，下述各實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用試劑如無特殊說明，均為常規(guī)試劑。
實施例1
一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法，包括以下步驟：
步驟1，將玉米芯粉碎后過40目篩，得到玉米芯粉；
步驟2，將步驟1中得到的玉米芯粉與體積百分比濃度為0.5％的稀h2so4溶液按照1g：10ml的比例混合，然后以250r/min的速度攪拌15min，攪拌完畢后靜置30min，得到玉米芯粉的酸處理混合物，將玉米芯粉的酸處理混合物在90℃下保溫2h，保溫結(jié)束后過0.45μm濾膜，得到的濾餅用水洗至中性，得到酸處理玉米芯粉；
步驟3，將步驟2中得到的酸處理玉米芯粉與質(zhì)量百分比濃度為0.5％的naoh溶液按照1g：10ml的比例混合后置于60℃的水浴中保溫3h，保溫結(jié)束后趁熱過0.45μm濾膜，得到的濾餅首先用質(zhì)量百分比濃度為0.5％的naoh溶液洗至洗脫液為無色，再用水洗至中性，得到堿處理玉米芯粉，將堿處理玉米芯粉烘干至含水率為3％，即得到用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物。
實施例2
一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法,包括以下步驟：
步驟1，將玉米芯粉碎后過40目篩，得到玉米芯粉；
步驟2，將步驟1中得到的玉米芯粉與體積百分比濃度為0.3％的稀h2so4溶液按照1g：12ml的比例混合，然后以280r/min的速度攪拌20min，攪拌完畢后靜置20min，得到玉米芯粉的酸處理混合物，將玉米芯粉的酸處理混合物在85℃下保溫2h，保溫結(jié)束后過0.45μm濾膜，得到的濾餅用水洗至中性，得到酸處理玉米芯粉；
步驟3，將步驟2中得到的酸處理玉米芯粉與質(zhì)量百分比濃度為0.3％的naoh溶液按照1g：12ml的比例混合后置于55℃的水浴中保溫4h，保溫結(jié)束后趁熱過0.45μm濾膜，得到的濾餅首先用質(zhì)量百分比濃度為0.3％的naoh溶液洗至洗脫液為無色，再用水洗至中性，得到堿處理玉米芯粉，將堿處理玉米芯粉烘干至含水率為5％，即得到用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物。
實施例3
一種用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的制備方法,包括以下步驟：
步驟1，將玉米芯粉碎后過40目篩，得到玉米芯粉；
步驟2，將步驟1中得到的玉米芯粉與體積百分比濃度為0.6％的稀h2so4溶液按照1g：15ml的比例混合，然后以300r/min的速度攪拌30min，攪拌完畢后靜置10min，得到玉米芯粉的酸處理混合物，將玉米芯粉的酸處理混合物在95℃下保溫2h，保溫結(jié)束后過0.45μm濾膜，得到的濾餅用水洗至中性，得到酸處理玉米芯粉；
步驟3，將步驟2中得到的酸處理玉米芯粉與質(zhì)量百分比濃度為0.6％的naoh溶液按照1g：15ml的比例混合后置于65℃的水浴中保溫5h，保溫結(jié)束后趁熱過0.45μm濾膜，得到的濾餅首先用質(zhì)量百分比濃度為0.6％的naoh溶液洗至洗脫液為無色，再用水洗至中性，得到堿處理玉米芯粉，將堿處理玉米芯粉烘干至含水率為8％，即得到用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物。
實施例1～3均制備出了性能良好的用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物，為了說明實施例1～3制備出的用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物的效果，下面僅以實施例1制備出的用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物在木霉生產(chǎn)纖維素酶中的使用效果進(jìn)行說明，具體試驗步驟如下：
1、活化菌種：配制pda培養(yǎng)基，采用中間點種的方式在pda培養(yǎng)基中接種里氏木霉菌，然后于28℃斜面接種培養(yǎng)48h，得到新鮮種子斜面；
2、用滅菌后的接種環(huán)將新鮮種子斜面上的孢子洗下來，制成濃度為1×107個/ml的孢子懸液，按照5％的接種量將孢子接種至含有45ml液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在轉(zhuǎn)動速度為180r/min、溫度為28℃的條件下培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束后收集發(fā)酵濾液，并將發(fā)酵濾液以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液作為待測酶液，然后測定待測酶液中纖維素酶的酶活力大?。?/p>
其中，每升液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基由下述組分組成：8g麩皮、2g實施例1制備出的用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物、2g的kh2po4、1.6mg的mnso4、4.9g蛋白胨、0.3g的cacl2、5mg的feso4·7h2o、1.7mg的zncl2、0.3g的mgso4、2.0mg的cocl2，余量為去離子水，ph為5.5；
3、羧甲基纖維素酶(cmc)活力的測定
取4支潔凈干燥的20ml的酶解管，按照0、1、2、3的順序?qū)⑵錁?biāo)號，往每支酶解管中均加入1.5mlph為5.0的羧甲基纖維素鈉醋酸緩沖液，將0號酶解管作為空白對照，向其中加入0.5m待測酶液，煮沸10min，使其失活后再往其中加入1.5ml的dns溶液，然后于50℃水浴中同時預(yù)熱四支酶解管5min，再將除空白對照之外的三只酶解管均加入0.5ml待測酶液，將四只酶解管均置于50℃的水浴鍋里加熱30min，取出后趁熱向四支酶解管中分別加入1.5ml的dns溶液來阻止酶的繼續(xù)反應(yīng)，加入dns溶液后將四支酶解管充分搖勻后沸水浴5min，取出后在冰上使溫度降至室溫后用蒸餾水定容至20ml，然后將空白對照作為對照調(diào)節(jié)零點，用分光光度計在540nm波長下測定各酶解管中液體的od值，記錄實驗結(jié)果；
4、纖維素濾紙酶活力(fpa)的測定
取4支潔凈干燥的20ml的酶解管，按照0、1、2、3的順序?qū)⑵錁?biāo)號后均加入1.5ml的ph為4.6的醋酸緩沖液，將0號酶解管作為空白對照，向其中加入0.5ml的離心后的待測酶液，煮沸10min使其失活后加入1.5ml的dns溶液；在50℃水浴中同時預(yù)熱四支酶解管5min，將除對照之外的三只管均加入離心后的待測酶液0.5ml后，再分別加入大小為1×6cm的烘干的濾紙條，將四只酶解管都放在50℃的水浴鍋里水浴60min，取出后趁熱向除空白對照之外的3只酶解管中分別加入dns溶液1.5ml來阻止酶的繼續(xù)反應(yīng)，加入dns溶液后將四支酶解管充分搖勻后沸水浴10min，取出后在冰上降低溫度至室溫后用蒸餾水定容至20ml，然后將空白對照作為對照調(diào)節(jié)零點，用分光光度計在540nm波長下測定各酶解管中液體的od值，記錄實驗結(jié)果。
通過檢測得出，羧甲基纖維素酶活力最大可達(dá)到118.06u/ml，濾紙酶活力最大可達(dá)到152.72u/ml，而使用未經(jīng)處理的玉米芯作為木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物時，得到的羧甲基纖維素酶活力最大僅為98.08u/ml，濾紙酶活力最大僅為110.54u/ml，由此可見，利用本發(fā)明的制備方法處理過的玉米芯作為誘導(dǎo)物時，得到的羧甲基纖維素酶的活力提高了20.37％，濾紙酶的活力提高了38.2％；濾紙酶酶活占總酶活比例由原來52.99％增加到56.40％，說明本發(fā)明制備出的用作木霉生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物具備優(yōu)異的誘導(dǎo)效果，不僅提高總酶活，也提高了濾紙酶活的比例。
纖維素酶是濾紙酶、羧甲基纖維素酶和β-糖苷酶等幾種酶的總稱，這幾種酶共同酶解纖維素原料，它們的比例分配是評價酶制劑最關(guān)鍵的因素，適宜的比例是酶制劑能夠發(fā)揮最佳效率的關(guān)鍵，也是生產(chǎn)酶制劑的最佳經(jīng)濟(jì)效益的基礎(chǔ)，其中濾紙酶是較難提高產(chǎn)量的一種酶，獲得產(chǎn)酶微生物產(chǎn)生更多的濾紙酶，是纖維素酶制劑的關(guān)鍵。本發(fā)明獲得的產(chǎn)酶誘導(dǎo)物能夠誘導(dǎo)更高的濾紙酶和更適宜的酶比例。
本發(fā)明制備的誘導(dǎo)物本質(zhì)上是一種玉米芯纖維素，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基里碳源缺乏時，它作為唯一碳源能夠誘導(dǎo)木霉產(chǎn)生大量的纖維素酶，尤其是能夠提高濾紙酶的量。市售的結(jié)晶纖維素常用作木霉纖維素酶誘導(dǎo)物，其價格十分昂貴，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)物可以替代結(jié)晶纖維素，且價格僅為結(jié)晶纖維素價格的30％，這使工業(yè)化大規(guī)模降低纖維素酶生產(chǎn)成本成為可能。
需要說明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應(yīng)理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與實施例1-3相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。