【技術領域】

本發(fā)明屬于蛋白質表達純化技術領域，具體涉及一種基于血紅素結合域的可視化蛋白表達融合標簽的應用。

背景技術：

重組蛋白表達技術現已廣泛應用于生物學各個領域。將外源基因轉入大腸桿菌、酵母菌等宿主細胞中進行表達以獲得目的蛋白，是科學研究以及生產過程中獲取所需蛋白質的重要方法。然而，許多外源蛋白的可溶性表達量很低或者形成不具有活性包涵體。目前，有許多方法可以提高重組蛋白的可溶性表達，其中將目的蛋白和標簽蛋白融合表達是提高目的蛋白可溶性的有效手段。標簽蛋白是指利用dna體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。隨著技術的不斷發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標簽。大量實踐證明，合理使用標簽蛋白可增加目標蛋白的表達量，促進目標蛋白的正確折疊。而一些親和標簽，如谷胱甘肽s-轉移酶(gsttag)、組氨酸標簽(histag)、麥芽糖結合蛋白(mbp)等，還可用于蛋白的純化(curropinbiotechnol.2006,17(4):353-358)。但是目前使用的融合標簽種類還不足，由于蛋白質結構和性質的多樣性，沒有一種通用的融合標簽能解決提高所有的異源蛋白的表達可溶性問題，也沒有一種融合標簽可以用于純化所有的蛋白，因此開發(fā)新型的標簽蛋白對異源蛋白的可溶性表達及純化具有重要意義。

除了重組蛋白的可溶性表達問題，另一個制約重組蛋白表達技術的是蛋白質的純化。盡管目前組氨酸標簽(histag)、谷胱甘肽s-轉移酶(gsttag)和麥芽糖結合蛋白(mbp)等多種標簽已經廣泛用于重組蛋白的親和層析純化。但是這些標簽蛋白在可見光下均為無色，無法實現重組蛋白在表達及純化過程中的持續(xù)可視化跟蹤。如果借助融合蛋白標簽能實現重組蛋白表達過程及其純化過程的肉眼可視化，不僅能夠提高蛋白表達條件優(yōu)化的效率，而且在后續(xù)純化中能實時監(jiān)測蛋白純化效率及純度。例如，可以通過肉眼觀察菌體和菌體破碎液的顏色判定重組蛋白的可溶性表達量；通過測定特定可見光波長下重組蛋白的吸光度就可以獲得重組蛋白的濃度。近年來，來源于細胞色素p450還原酶的黃素單核苷酸結合域(～21kda)以及來源于細胞色素b5的血紅素結合域(～13kda)被用于融合蛋白標簽，在可見光下這兩個標簽的顏色分別為黃色和紅色(biotechniques.2005,38(3):387-392；proteinsci.2010,19(10):1830-1839)。然而由于這兩種蛋白標簽在大腸桿菌中的可溶性表達較低，并沒有得到廣泛應用。因此，開發(fā)能增加重組蛋白可溶性表達并且實現可視化的融合標簽具有重要的應用價值。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種包含血紅素結合域的可視化融合標簽在蛋白質表達純化中的應用，可以解決通過肉眼觀察重組蛋白在表達及純化過程中變化的問題。

本發(fā)明所要解決的問題是針對現有的肉眼可視化融合標簽的種類很少，提供更多的可視化融合標簽用于目標蛋白的表達，具體是提供一種包含來源于人胱硫醚β-合酶的血紅素結合域片段基因的氨基酸序列，其序列如序列表中seqidno:1所示；

seqidno:1

metglyserserhishishishishishisserserglymetprosergluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargserglyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasplysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserargcysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishisthralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslysileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslyspheglyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproargglyser；

還包括一種將上述氨基酸序列作為可視化蛋白表達融合標簽的用途；

還包括用于上述用途的融合表達載體，該載體是將六個組氨酸、包含人胱硫醚β-合酶的血紅素結合域片段基因的氨基酸序列和凝血酶酶切位點基因克隆至大腸桿菌表達載體pet-28a(+)而獲得，即獲得包含可視化蛋白標簽的融合表達載體pet-hm14；

還包括一種可視化融合蛋白表達系統，其至少包括上述的融合表達載體。

上述的可視化蛋白表達融合標簽包括來源于人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端的血紅素(heme)結合域(第1-110位氨基酸殘基)，它具有較強的水溶性，融合蛋白表達量更高，表現為肉眼可見的鮮紅色。因此，在表達和純化過程中可以實現目的蛋白的肉眼可視化跟蹤，根據融合標簽在420nm的特征吸收可以實現目的蛋白含量實時監(jiān)測，根據重組蛋白溶液od420/od280比值可以實現目的蛋白純度的實時監(jiān)測，同時該可視化標簽也大大提高了目的蛋白的可溶性表達。

使用過程中，待表達的目的基因連接到pet-hm14載體實現可視化標簽和目的基因的融合表達。為了方便目的蛋白的純化，本發(fā)明在融合標簽的氨基端加入六個組氨酸殘基，利于使用ni-nta樹脂親和層析純化融合蛋白；同時為了獲得天然n端的目的蛋白，在融合標簽的羧基端加入凝血酶酶切位點(lvprgs)，在純化融合蛋白后能夠切除標簽。

本發(fā)明還公開了可視化蛋白表達融合標簽的編碼基因，其編碼基因可以是序列表中seqidno:2所示的dna分子，當然，由于密碼子的簡并性，其它與seqidno:2所示核苷酸序列同源且編碼相同氨基酸序列的dna分子也可用于構建本發(fā)明的融合標簽蛋白。

seqidno:2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccaggcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagcctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgatgctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccacactgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacccctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggccaagtgtgagctggtgccgcgcggcagc；

優(yōu)選應用實施例中選擇的是：

來源于灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的膽固醇酯酶基因，該基因在大腸桿菌中單獨表達時的可溶性蛋白量很少(<10％)，而與本發(fā)明的可視化蛋白標簽融合表達后，重組蛋白可溶性得到大幅度提高(>30％)。同時由于可視化標簽的存在使膽固醇酯酶的表達和純化過程可以實現肉眼可視化跟蹤，目的蛋白濃度可以根據od420的吸光度實時監(jiān)測，目的蛋白純度可以根據od420/od280比值進行實時監(jiān)測，大大簡化了膽固醇酯酶的表達和純化過程。膽固醇酯酶是催化膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸的一種酶，它是臨床檢測血清總膽固醇的重要酶之一，提高其可溶性表達量以及純化效率將使大規(guī)模膽固醇酯酶的表達和純化更加簡便和快捷。

本發(fā)明的有益效果是：(1)來自于人胱硫醚β-合酶(cbs)的血紅素結合域可以作為肉眼可視化蛋白表達融合標簽用于重組蛋白的表達，能大大提高融合蛋白的可溶性表達量；(2)由于該融合標簽具有肉眼可見的鮮紅色，因此在表達和純化過程中可以實現目的蛋白的肉眼可視化跟蹤，可以不通過紫外檢測器而僅靠肉眼判定融合蛋白純化過程，大大簡化了純化流程；(3)由于該可視化蛋白表達融合標簽的特征吸收為～420nm，根據純化過程中od420的數值變化可以實現目的蛋白含量的實時監(jiān)測，根據od420/od280比值可以實現目的蛋白純度的實時監(jiān)測。

人胱硫醚β-合酶(cbs)氨基端包含有110個氨基酸殘基的血紅素(heme)結合域，分子量約12kda，具有很強的水溶性，作為融合蛋白標簽可以提高目的蛋白的可溶性表達。并且該血紅素標簽(hemetag)在～420nm下具有特征吸收峰，表現為肉眼可見的鮮紅色，可以對重組蛋白的表達過程和純化過程進行可視化跟蹤，同時可以根據420nm的吸光度測定融合蛋白的濃度，根據重組蛋白溶液在420nm和280nm下的吸光度比值(od420/od280)判定重組蛋白的純度。

【附圖說明】

圖1為5660個堿基對的人胱硫醚β-合酶血紅素(heme)結合域片段基因作為可視化蛋白表達融合標簽的大腸桿菌表達載體pet-hm14圖譜，其中：

26-72是t7終止子序列，158-203是多克隆位點序列，204-221是凝血酶酶切位點的核苷酸序列，222-551是血紅素結合域可視化蛋白表達融合標簽的核苷酸序列，561-578是編碼6個組氨酸位點的核苷酸序列，661-677是t7啟動子序列，1064-2143是laci基因的編碼序列，3577是pbr322復制起始位點，4286-5098是卡拉霉素抗性基因kan的編碼序列；

圖2為pet-hm14空載體誘導表達的可視化標簽的sds-page圖，其中：

1.蛋白質分子量標準，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda，29.0kda，20.1kda，14.3kda，6.5kda；2.未誘導的大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液；3-4.誘導后的大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14破碎后上清液，其中箭頭標注為誘導表達的蛋白標簽；

圖3為膽固醇酯酶基因與可視化標簽融合表達蛋白的sds-page圖，其中：

1.蛋白質分子量標準，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.誘導前的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；3.誘導后2h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；4.誘導后4h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；5.誘導后6h的重組菌bl21(de3)/pet-hm14-ce破碎上清液；

圖4為融合表達膽固醇酶的重組大腸桿菌破碎后上清液的紫外-可見吸收光譜，其中：280nm是蛋白質的特征吸收峰，420nm是包含可視化標簽的融合蛋白特征吸收峰，燒杯中的紅色溶液為重組大腸桿菌裂解液；

圖5是純化的膽固醇酯融合蛋白sds-page圖，其中：1.蛋白質分子量標準，大小分別為200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda；2.表達膽固醇酯酶融合蛋白的重組大腸桿菌破碎后上清液(可溶性蛋白)；3.經ni-nta樹脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(20μg)；4.經ni-nta樹脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(20μg)；5.經ni-nta樹脂親和層析純化的膽固醇酯酶融合蛋白(50μg)；

圖6是純化后融合蛋白的紫外-可見吸收光譜，其中：280nm是蛋白質的特征吸收峰，420nm是包含血紅素可視化標簽的融合蛋白特征吸收峰，離心管中紅色蛋白溶液為純化的膽固醇酯酶融合蛋白。

【具體實施方式】

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。

在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。

實施例1：包含可視化血紅素融合標簽質粒載體的構建及其在大腸桿菌中的表達

本發(fā)明中，使用的大腸桿菌e.colidh5α以及e.colibl21(de3)均為外購，大腸桿菌質粒pet-28a(+)購自美國novagen公司。包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的大腸桿菌表達載體已在論文中公開(medchemcommun.2017,8:198-201)。質粒dna抽提試劑盒、dna膠回收試劑盒購自omega公司；t4dna連接酶、taqdna聚合酶和各種限制性內切酶、蛋白marker購自takara公司。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,5-ala)購于sigma公司，其余試劑均為國產或進口分析純。

lb培養(yǎng)基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化鈉；以上均為質量分數)，氨芐青霉素(ampicillin)終濃度均為50μg/ml。固體lb培養(yǎng)基：在液體lb培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂，即制成固體lb培養(yǎng)基(固體瓊脂平板培養(yǎng)基)。

設計引物pr1：

5′-tcaccatgggcagcagcagcagcggcatgccttctgagaccccccag-3′；

引物pr2:

5′-actggatccctcacacttggccaagagctc-3′。引入的ncoⅰ和bamhⅰ酶切位點以下劃線表示。引物pr1中包含6個組氨酸的編碼基因(雙下劃線)，引物pr2中包含凝血酶酶切位點氨基酸的編碼基因(雙下劃線)。以包含人胱硫醚β-合酶(cbs)基因序列的質粒為模板，使用引物pr1和pr2擴增得到包含血紅素結合域的融合標簽。將擴增的融合標簽基因片段用ncoⅰ和bamhⅰ雙酶切連接到載體pet-28a(+)上，構建能表達可視化標簽蛋白的融合表達載體，即重組質粒pet-hm14，質粒圖譜如圖1所示。

然后將重組質粒轉化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細胞中，獲得重組大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14。將培養(yǎng)過夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14按照1:100的比例接種到500ml含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液od600達到0.6～0.8，然后加入終濃度為0.3mmol/l的5-ala和終濃度為0.1mmol/l的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)于30℃下誘導過夜，在4℃離心收集菌體備用。將上述收獲的菌體重懸于20ml破碎緩沖液中，在冰水浴中超聲波(300w，超聲3s，間隔8s)處理1100s破碎細胞，破碎液在4℃離心30min(12000r/min)獲得上清液，然后進行sds-page分析。

實驗結果如下：成功構建能表達可視化標簽蛋白的表達載體，即重組質粒pet-hm14，如圖1所示，過夜誘導表達后的菌體為肉眼可見的微紅色，菌體破碎上清液為鮮紅色；sds-page結果表明融合蛋白標簽成功表達，表觀分子量約14kda，如圖2所示。以上結果表明包含血紅素結合域的可視化標簽成功可溶性表達，標簽蛋白為肉眼可見的血紅色，可用于融合蛋白的可視化表達和純化中。

實施例2使用包含可視化標簽載體pet-hm14在大腸桿菌中表達膽固醇酯酶。

根據灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的膽固醇酯酶基因(genbank:llzl01000117.1)設計引物

pr3：5′-tcaggatccatgggcagcagccatcatcatc-3′,

引物pr4：5′-actaagctttcagctgccgcgcggcaccag-3′，引入的bamhⅰ和hindⅲ酶切位點以下劃線表示?；疑溍咕徸灾袊⑸锞N保藏管理委員會普通微生物中心。使用真菌基因組dna提取試劑盒(購于北京索萊寶科技有限公司)提取灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的基因組dna，使用引物pr3和pr4擴增得到灰色鏈霉菌的膽固醇酯酶基因，將擴增的目的基因片段用bamhⅰ和hindⅲ雙酶切連接到載體pet-hm14上構建能表達可視化融合蛋白的融合表達載體，即重組質粒pet-hm14-ce，然后將重組質粒轉化到e.colibl21(de3)感受態(tài)細胞中，獲得重組大腸桿菌bl21(de3)/pet-hm14-ce。將培養(yǎng)過夜的e.colibl21(de3)/pet-hm14-ce按照1:100的比例接種到1l含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液od600達到0.6～0.8，然后加入終濃度為0.3mmol/l的5-ala和終濃度為0.1mmol/l的iptg于30℃下誘導過夜，在4℃離心收集菌體備用。將上述收獲的菌體重懸于50ml破碎緩沖液中，在冰水浴中超聲波(300w，超聲3s，間隔8s)處理1100s破碎細胞，破碎液在4℃離心30min(12000r/min)獲得上清液，上清液進行紫外-可見光譜分析并進行sds-page分析。同時破碎上清液經ni-nta樹脂親和層析后獲得帶有可視化標簽的融合蛋白，純化后融合蛋白進行蛋白含量測定、紫外-可見光譜分析以及sds-page分析。

實驗結果如下：來源于灰色鏈霉菌的膽固醇酯酶使用pet-28a(+)載體表達時，可溶性目的蛋白的表達量低于菌體總蛋白的10％，并且表達和純化過程無法實現肉眼可視化。而使用可視化標簽表達的可溶性蛋白表達量超過菌體總蛋白的30％，結果如圖3所示。表明融合標簽大幅度提高了膽固醇酯酶的可溶性表達。

另外，表達融合蛋白的重組大腸桿菌破碎液為肉眼可見的紅色，紫外-可見光譜分析表明破碎上清液具有～420nm的血紅素特征吸收峰以及280nm的蛋白質吸收峰，結果如圖4所示。經測定上清液蛋白濃度為6mg/ml，其中帶有可視化標簽的融合蛋白含量為1.5mg/ml，在420nm的吸光度約為od420＝1.1，在280nm的吸光強度約為od280＝3，表征融合蛋白純度的od420/od280的比值約為0.4。經過一步親和層析目的蛋白的純度達到95％，純化的帶有可視化標簽的融合蛋白為肉眼可見的鮮紅色，結果如圖5和圖6所示。將純化的融合蛋白濃度調整至1.5mg/ml(與菌體破碎上清液中融合蛋白含量一致)并進行紫外-可見光譜分析如圖6所示，結果表明純化的融合蛋白在420nm的吸光度約為od420＝1.1，與含有相同濃度融合蛋白的菌體破碎上清液在420nm的吸光度一致，表明可以通過可視化標簽在420nm的特征吸收對重組蛋白的濃度進行測定。同時純化的融合蛋白在280nm的吸光度約為od280＝1.3，純化的融合蛋白(95％純度)od420/od280的比值約為0.9，而細胞裂解液的od420/od280的比值約為0.4。因此，在使用可視化標簽進行蛋白質的表達純化過程中，可以通過蛋白溶液的od420/od280的比值判定目的蛋白的純度。

<110>西北工業(yè)大學

<120>一種基于血紅素結合域的可視化蛋白表達融合標簽的應用

<130>無

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>seqidno1

<211>129

<212>prt

<213>人工序列

<400>seqidno1

metglyserserhishishishishishisserserglymetproser

151015

gluthrproglnalagluvalglyprothrglycysprohisargser

202530

glyprohisseralalysglyserleuglulysglyserprogluasp

354045

lysglualalysgluproleutrpileargproaspalaproserarg

505560

cysthrtrpglnleuglyargproalasergluserprohishishis

65707580

thralaproalalysserprolysileleuproaspileleulyslys

859095

ileglyaspthrprometvalargileasnlysileglylyslysphe

100105110

glyleulyscysgluleuleualalyscysgluleuvalproarggly

115120125

ser

<210>seqidno2

<211>387

<212>dna

<213>人工序列

<400>seqidno2

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcatgccttctgagaccccccag60

gcagaagtggggcccacaggctgcccccaccgctcagggccacactcggcgaaggggagc120

ctggagaaggggtccccagaggataaggaagccaaggagcccctgtggattcggcccgat180

gctccgagcaggtgcacctggcagctgggccggcctgcctccgagtccccacatcaccac240

actgccccggcaaaatctccaaaaatcttgccagatattctgaagaaaatcggggacacc300

cctatggtcagaatcaacaagattgggaagaagttcggcctgaagtgtgagctcttggcc360

aagtgtgagctggtgccgcgcggcagc387