本發(fā)明涉及農(nóng)作物誘變育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用等離子體誘變靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法。

背景技術(shù)：

靈芝(ganodermalucidum)為擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、非褶菌科、靈芝屬的子實(shí)體，是比較名貴的傳統(tǒng)中草藥。其中，靈芝的有效成分如靈芝多糖、三萜等具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫，保肝，調(diào)節(jié)血糖等作用。

靈芝作為多細(xì)胞生物，具有較厚的細(xì)胞壁，常規(guī)的方法很難達(dá)到良好的誘變效果；孢子誘變雖然能夠獲得單細(xì)胞誘變效果，但其采收季節(jié)受到限制。原生質(zhì)體由于人工去除了細(xì)胞壁，受輻射后誘變效率較高，且不受采收季節(jié)等限制，在實(shí)驗(yàn)條件下隨時(shí)可以進(jìn)行，是理想的誘變方式。

等離子體被稱為除氣體、液體、固體以外物質(zhì)的第四態(tài)，不同的激發(fā)方式和發(fā)生器結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生不同熱力學(xué)狀態(tài)的等離子體。低溫常壓等離子體具有在大氣壓下放電均勻性高、溫度可控在室溫范圍，操作條件安全、溫和，可控性強(qiáng)等特點(diǎn)，適于生物誘變育種，受到了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種穩(wěn)定高效的利用等離子體誘變靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種利用等離子體誘變靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法，包括如下步驟：

(1)靈芝原生質(zhì)體的構(gòu)建

①靈芝液體培養(yǎng)菌絲體的制備；

②菌絲體勻漿制備；

③細(xì)胞壁溶解酶液的制備及細(xì)胞壁溶解；

④原生質(zhì)體的分離及收集；

⑤原生質(zhì)體濃度校正及保存；

(2)低溫等離子體誘變?cè)|(zhì)體

①原生質(zhì)體的誘變前準(zhǔn)備；

②等離子體誘變裝置通氣平衡；

③反應(yīng)體系通電，對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變；

④固體培養(yǎng)基中，原生質(zhì)體平板涂布均勻和靜置再生培養(yǎng)；

⑤誘變菌株挑選，用牙簽挑選小菌落后，接種于pda固體培養(yǎng)基上；

⑥觀察記錄菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率，光鏡下觀察菌絲形態(tài)；

⑦誘變菌株的活性物質(zhì)和穩(wěn)定性檢測(cè)；

⑧選取誘變后品質(zhì)優(yōu)良的菌株固體培養(yǎng)，保存菌種。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中靈芝液體培養(yǎng)菌絲體的制備方法為：在無(wú)菌條件下，將固體發(fā)酵靈芝種子菌絲體接種于滅菌后的pd液體培養(yǎng)基中，于27-29℃，150-200rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)，5-7d后，將菌絲體連同菌液取出，超凈臺(tái)中離心后用ddh2o清洗菌絲體。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中菌絲體勻漿的制備方法為：挑取靈芝菌絲體置于滅菌后的勻漿器中，加入0.6mol/l濃度的甘露醇；勻漿器中研磨，于超凈臺(tái)中制備菌絲體勻漿；光鏡下觀察菌絲，2000-5000rpm離心4-6min獲得菌絲體勻漿，保留沉淀。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中細(xì)胞壁溶解酶液的制備采用復(fù)合酶裂解法，為崩潰酶和溶壁酶混合酶裂解液，溶液濃度38-42mg/ml；所述步驟(1)中細(xì)胞壁溶解方法為：將菌絲體勻漿沉淀混合溶解于混合酶裂解液中，終濃度10-20mg/ml，30-35℃裂解1-3h；收集裂解液，加壓過(guò)濾法濾去殘余未裂解菌絲，保留過(guò)濾裂解液。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中原生質(zhì)體的分離及收集方法為：用離心管收集過(guò)濾后的細(xì)胞壁裂解液，離心后棄去上清，保留沉淀；所述步驟(1)中原生質(zhì)體濃度校正及保存方法為：利用0.6mol/l甘露醇溶解稀釋原生質(zhì)體，用血球板計(jì)數(shù)，光鏡下調(diào)整原生質(zhì)體濃度為1×10⁶-10⁷個(gè)/ml，4℃低溫保存，用于后續(xù)誘變。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中原生質(zhì)體的誘變前準(zhǔn)備過(guò)程為：無(wú)菌條件下吸取原生質(zhì)體溶液200-500μl，置于的石英等離子體反應(yīng)皿中，輕晃石英等離子體反應(yīng)皿，使原生質(zhì)體溶液在石英等離子體反應(yīng)皿的底部涂布均勻。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中等離子體誘變裝置通氣平衡過(guò)程為：將介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒置于原生質(zhì)體溶液表面上方，封閉反應(yīng)體系，通入反應(yīng)氣體4-6min，氣體流量1.5-2.5l/min；所述步驟(2)中反應(yīng)體系通電，電壓為10-15kv，誘變3-7min，對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述反應(yīng)氣體具體為he或ar。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中原生質(zhì)體平板涂布和靜置再生培養(yǎng)方法為：收集原生質(zhì)體反應(yīng)溶液，吸取20μl于再生培養(yǎng)基中，用滅菌后的三角涂棒沾取菌液涂布于固體培養(yǎng)基平板上；接著，將涂布完畢后的平板封閉，倒置于25-30℃溫箱靜止培養(yǎng)5-7d。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中誘變菌株挑選方法為：原生質(zhì)體再生培養(yǎng)5-7d，平板上長(zhǎng)出菌落后，選取其中菌落直徑0.5-2mm的單菌落，用滅菌后的牙簽挑取菌絲，接種于pda固體培養(yǎng)基上；所述步驟(2)中誘變菌株觀察過(guò)程為：將挑選分離后的菌落培養(yǎng)5-7d，觀察記錄菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率，光鏡下觀察菌絲形態(tài)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中誘變菌株的活性物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程為：將挑選分離的菌株接種于pd液體培養(yǎng)基中，待菌絲球長(zhǎng)滿后對(duì)菌絲中活性成分予以測(cè)定，與出發(fā)菌株活性成分及含量比較，檢測(cè)誘變效果并予以記錄；所述步驟(2)中誘變菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)過(guò)程為：對(duì)性狀優(yōu)良的菌株連續(xù)培養(yǎng)3代，進(jìn)行表觀觀察和活性物質(zhì)檢測(cè)，觀察誘變菌株的穩(wěn)定性。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中保存菌種的方法為：選取誘變后品質(zhì)優(yōu)良的菌株，挑取少量菌絲接種于pda固體培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)滿后，4℃保存菌種。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明將低溫等離子體放電技術(shù)應(yīng)用于靈芝的原生質(zhì)體誘變過(guò)程，提高了不同靈芝菌株的誘變效率，適應(yīng)范圍廣，也可以為其他蕈菌菌株的誘變提供借鑒和方法基礎(chǔ)，有利于農(nóng)業(yè)和發(fā)酵工業(yè)相關(guān)遺傳誘變育種工作的發(fā)展，具有比較廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例2中的一種利用等離子體誘變赤白黃靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法的光學(xué)顯微鏡下原生質(zhì)體狀態(tài)圖(放大40倍)；

圖2是實(shí)施例1-2中的一種利用等離子體誘變靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法的等離子體放電裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是實(shí)施例2中的一種利用等離子體誘變赤白黃靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法的低溫等離子體誘變?cè)|(zhì)體再生菌落圖；

圖4是實(shí)施例2中的一種利用等離子體誘變赤白黃靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法的經(jīng)等離子體放電誘變后靈芝菌絲體的形態(tài)發(fā)生改變圖。

圖中：1為高壓交流電源，2為電極，3為供氣鋼瓶，4為石英等離子體反應(yīng)皿，5為介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種利用等離子體誘變靈芝菌株cgmcc5.0026原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法，包括如下步驟：

(1)靈芝原生質(zhì)體的構(gòu)建

①無(wú)菌條件下，將固體發(fā)酵靈芝種子菌絲體小塊接種于滅菌后的pd液體培養(yǎng)基(1l無(wú)菌水，200g馬鈴薯，20g葡萄糖)中，于27℃，150rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)，5d后，將菌絲體連同菌液取出，超凈臺(tái)中離心后用ddh2o清洗菌絲體；

②取5ml靈芝菌絲體置于滅菌后的勻漿器中，加入適量的0.6mol/l濃度的甘露醇；勻漿器中研磨，于超凈臺(tái)中制備菌絲體勻漿；光鏡下觀察菌絲長(zhǎng)短合適，2000rpm離心6min獲得菌絲體勻漿，保留沉淀；

③采用復(fù)合酶裂解法制備細(xì)胞壁溶解酶液，具體為崩潰酶和溶壁酶混合酶裂解液，溶液濃度38mg/ml；接著，將菌絲體勻漿沉淀混合溶解于酶裂解液中，終濃度5mg/ml，30℃裂解3h；收集裂解液，加壓過(guò)濾法濾去殘余未裂解菌絲，保留過(guò)濾裂解液；

④用離心管收集過(guò)濾后的細(xì)胞壁裂解液，離心后棄去上清，保留沉淀；

⑤利用0.6mol/l甘露醇溶解稀釋原生質(zhì)體，取20μl，用血球板計(jì)數(shù)，光鏡下調(diào)整原生質(zhì)體濃度為1×10⁶個(gè)/ml，4℃低溫保存，用于后續(xù)誘變；

(2)低溫等離子體誘變?cè)|(zhì)體

采用如圖2所示的等離子體放電裝置誘變?cè)|(zhì)體，該等離子體放電裝置包括高壓交流電源1、電極2、供氣鋼瓶3、石英等離子體反應(yīng)皿4和介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒5。

①無(wú)菌條件下吸取原生質(zhì)體溶液500μl，置于的石英等離子體反應(yīng)皿4中，輕晃石英等離子體反應(yīng)皿4，使原生質(zhì)體溶液在石英等離子體反應(yīng)皿4的底部涂布均勻；

②將介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒5置于原生質(zhì)體溶液表面上方，封閉反應(yīng)體系，通入儲(chǔ)存于供氣鋼瓶3中的ar反應(yīng)氣體4min，氣體流量2.5l/min；

③利用高壓交流電源1對(duì)反應(yīng)體系通電加電壓，電壓為10kv，誘變7min，對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理；

④收集原生質(zhì)體反應(yīng)溶液，吸取20μl于再生培養(yǎng)基(蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，葡萄糖20g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po40.56g，k2hpo41g，維生素b25mg，維生素b61mg，加1l0.6mol/l無(wú)菌甘露醇溶液溶解)中，用滅菌后的三角涂棒沾取菌液涂布于固體培養(yǎng)基平板上；接著，將涂布完畢后的平板封閉，倒置于25℃溫箱靜止培養(yǎng)5d；

⑤原生質(zhì)體再生培養(yǎng)5d，平板上長(zhǎng)出菌落后，選取其中菌落直徑0.5mm的單菌落，用滅菌后的牙簽挑取菌絲，接種于pda固體培養(yǎng)基上；

⑥將挑選分離后的菌落培養(yǎng)5d，觀察記錄菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率，光鏡下觀察菌絲形態(tài)；

⑦誘變菌株的活性物質(zhì)和穩(wěn)定性檢測(cè)：

誘變菌株的活性物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程：將挑選分離的菌株接種于pd液體培養(yǎng)基中，待菌絲球長(zhǎng)滿后對(duì)菌絲中活性成分予以測(cè)定，與出發(fā)菌株活性成分及含量比較，檢測(cè)誘變效果并予以記錄；其中，活性成分具體為靈芝三萜和多糖，其相應(yīng)測(cè)定方法分別為高氯酸-香草醛法和硫酸-蒽酮法；

誘變菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)過(guò)程：對(duì)性狀優(yōu)良的菌株連續(xù)培養(yǎng)3代，進(jìn)行表觀觀察和活性物質(zhì)檢測(cè)，觀察誘變菌株的穩(wěn)定性；

⑧選取誘變后品質(zhì)優(yōu)良的菌株，挑取少量菌絲接種于pda固體培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)滿后，4℃保存菌種。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種利用等離子體誘變赤白黃靈芝原生質(zhì)體以構(gòu)建突變菌株的方法，包括如下步驟：

(1)靈芝原生質(zhì)體的構(gòu)建

①無(wú)菌條件下，將固體發(fā)酵靈芝種子菌絲體小塊接種于滅菌后的pd液體培養(yǎng)基(1l無(wú)菌水，200g馬鈴薯，20g葡萄糖)中，于29℃，200rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)，7d后，將菌絲體連同菌液取出，超凈臺(tái)中離心后用ddh2o清洗菌絲體；

②取5ml靈芝菌絲體置于滅菌后的勻漿器中，加入適量的0.6mol/l濃度的甘露醇；勻漿器中研磨，于超凈臺(tái)中制備菌絲體勻漿；光鏡下觀察菌絲長(zhǎng)短合適，5000rpm離心4min獲得菌絲體勻漿，保留沉淀；

③采用復(fù)合酶裂解法制備細(xì)胞壁溶解酶液，具體為崩潰酶和溶壁酶混合酶裂解液，溶液濃度42mg/ml；接著，將菌絲體勻漿沉淀混合溶解于酶裂解液中，終濃度20mg/ml，35℃裂解1h；收集裂解液，加壓過(guò)濾法濾去殘余未裂解菌絲，保留過(guò)濾裂解液；

④用離心管收集過(guò)濾后的細(xì)胞壁裂解液，離心后棄去上清，保留沉淀；

⑤利用0.6mol/l甘露醇溶解稀釋原生質(zhì)體，取20μl，用血球板計(jì)數(shù)，光鏡下調(diào)整原生質(zhì)體濃度為1×10⁷個(gè)/ml，光鏡下原生質(zhì)體狀態(tài)如圖1所示；4℃低溫保存，用于后續(xù)誘變；

(2)低溫等離子體誘變?cè)|(zhì)體

采用如圖2所示的等離子體放電裝置誘變?cè)|(zhì)體，該等離子體放電裝置包括高壓交流電源1、電極2、供氣鋼瓶3、石英等離子體反應(yīng)皿4和介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒5。

①無(wú)菌條件下吸取原生質(zhì)體溶液200μl，置于的石英等離子體反應(yīng)皿4中，輕晃石英等離子體反應(yīng)皿4，使原生質(zhì)體溶液在石英等離子體反應(yīng)皿4的底部涂布均勻；

②將介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒5置于原生質(zhì)體溶液表面上方，封閉反應(yīng)體系，通入儲(chǔ)存于供氣鋼瓶3中的he反應(yīng)氣體6min，氣體流量1.5l/min；

③利用高壓交流電源1對(duì)反應(yīng)體系通電加電壓，電壓為15kv，誘變3min，對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理；

④收集原生質(zhì)體反應(yīng)溶液，吸取20μl于再生培養(yǎng)基(蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，葡萄糖20g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po40.56g，k2hpo41g，維生素b25mg，維生素b61mg，加1l0.6mol/l無(wú)菌甘露醇溶液溶解)中，用滅菌后的三角涂棒沾取菌液涂布于固體培養(yǎng)基平板上；接著，將涂布完畢后的平板封閉，倒置于30℃溫箱靜止培養(yǎng)7d；

⑤原生質(zhì)體再生培養(yǎng)7d，平板上長(zhǎng)出菌落后，選取其中菌落直徑2mm的單菌落(如圖3所示)，用滅菌后的牙簽挑取菌絲，接種于pda固體培養(yǎng)基上；

⑥將挑選分離后的菌落培養(yǎng)7d，觀察記錄菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率，光鏡下觀察菌絲形態(tài)；

⑦誘變菌株的活性物質(zhì)和穩(wěn)定性檢測(cè)：

誘變菌株的活性物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程：將挑選分離的菌株接種于pd液體培養(yǎng)基中，待菌絲球長(zhǎng)滿后對(duì)菌絲中活性成分予以測(cè)定，與出發(fā)菌株活性成分及含量比較，檢測(cè)誘變效果并予以記錄；其中，活性成分具體為靈芝三萜和多糖，其相應(yīng)測(cè)定方法分別為高氯酸-香草醛法和硫酸-蒽酮法；部分誘變處理后的菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，其菌絲球生長(zhǎng)狀態(tài)及形狀如圖4中a、b、c所示；圖4表明，液體發(fā)酵條件下，經(jīng)等離子誘變處理后，液體發(fā)酵條件下，菌絲球形態(tài)發(fā)生了明顯改變；

誘變菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)過(guò)程：對(duì)性狀優(yōu)良的菌株連續(xù)培養(yǎng)3代，進(jìn)行表觀觀察和活性物質(zhì)檢測(cè)，觀察誘變菌株的穩(wěn)定性；

⑧選取誘變后品質(zhì)優(yōu)良的菌株，挑取少量菌絲接種于pda固體培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)滿后，4℃保存菌種。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。