本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提取動物基因組dna的方法，具體涉及一種用于三代測序的大量全血dna快速提取方法。

背景技術(shù)：

核酸測序技術(shù)如今已成為生物學研究領(lǐng)域的強大助手，第二代高通量測序技術(shù)的應(yīng)用已取得諸多可喜可賀的成果，但技術(shù)原理決定了二代測序存在諸多弊端，如測序讀長短、反復pcr擴增造成的擴增偏好性、難以覆蓋高gc含量和重復序列區(qū)域等。而第三代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，可以完美解決這些問題，其測序讀長10～60kb甚至更長，無pcr擴增過程無gc偏向性等，在基因組的組裝上對比二代有無與倫比的優(yōu)勢，也因為如此，三代測序?qū)ζ鹗糳na樣品的要求極高，尤其是在總量(至少8ug/cell)、純度(a260/280＝1.8～2.0；a260/230＝2.0～2.2等)和完整度(片段大小在10kb以上)上。

dna提取是分子生物學的基本實驗，涉及了基因克隆、基因序列分析、基因重組和基因治療，以及遺傳育種等技術(shù)領(lǐng)域。真核生物的dna是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，提取dna的原則是既要將dna與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持dna分子的完整。

大量血液提取流程一般是是先裂解紅細胞收集有核血細胞沉淀(主要是白細胞)，或裂解所有細胞膜收集細胞核沉淀(主要是白細胞核)用于dna提取，這一步驟可去掉血液絕大部分雜質(zhì)且提高血細胞裂解效率，從而提高血液dna的得率和純度。

但此步驟的存在，首先是人力、物力和時間成本的增加；其次血液量越大，操作越復雜；第三是增加多次清洗和離心，血液dna完整度受影響從而難以滿足三代測序要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明為了解決現(xiàn)有從血液中提取dna存在的工藝繁瑣、成本高耗時長、不適應(yīng)三代測序的問題，采用對大量全血進行高速離心處理，得到血細胞，再用特殊配制的全細胞裂解液一步裂解血細胞，得到的一種適于三代測序的從血液中快速大量提取基因組dna的方法，該方法最快可在3.5h內(nèi)拿到合格dna。

本發(fā)明提供了一種全血dna快速提取方法，步驟包括：

s1、將血液樣本在13000～16000rpm轉(zhuǎn)速下離心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混勻至澄清狀態(tài)，置于50～60℃水浴40-60min，冷卻后采用有機溶劑抽提，離心后取上清液；所述裂解液組份包括：0.8～1.2m鹽酸胍；ph8.0～8.5、30～100mmtris-cl；ph8.0～8.5、30～100mmedta，體積百分比4～8％tween-20，體積百分比0.3～1％tritonx-100，質(zhì)量體積比0.3～1％sds和0.3～1mg/ml蛋白酶k；

s2、向步驟s1所得上清液中加入異丙醇和naac，混勻后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；

s3、向步驟s2所得晾干的沉淀中加入ten緩沖液和核糖核酸酶，混勻后置于37℃溫育30min，再加入含有蛋白酶k的ten緩沖液，混勻，置于50～60℃下30min，冷卻后離心，取上清液純化得到純凈dna。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)能一次處理大量樣品，在硬件和試劑保證的情況下，單次處理的血液樣品量沒有上限，如在本發(fā)明的一個實施例中血液樣本達到7.5ml，相比于現(xiàn)有一次裂解技術(shù)的幾百微升的樣品量有明顯提升；

(2)處理工藝簡單；現(xiàn)有技術(shù)處理大量樣品都是先加紅細胞裂解液(溫和裂解液)離心去掉紅細胞，再加強裂解液裂解白細胞，或者全血加全細胞膜裂解液，得到白細胞核后再裂解細胞核來提取dna，步驟繁瑣復雜，得到的血液dna完整度低；而本發(fā)明提供的方法通過高速離心，去除絕大部分紅細胞，再將沉淀的血細胞(主要是有核白細胞等)用全細胞裂解液一次性裂解細胞膜和細胞核，再提取dna，即僅需加一次特定組份的裂解液即可將白細胞中的dna裂解出來，裂解充分且操作更加簡單，同時減少了清洗和離心步驟，從而有效保證血液dna的完整度，人力、物力和時間成本明顯降低；

(3)采用本發(fā)明提供的方法，耗時短且dna得率和品質(zhì)好，最快可在3.5h內(nèi)拿到適用于三代測序的dna。

附圖說明

圖1為實施例一中樣品的凝膠電泳檢測結(jié)果圖，采用0.7％瓊脂糖凝膠，電泳條件為150v，30min；

圖2為實施例一中樣品的凝膠電泳檢測結(jié)果圖，采用0.7％瓊脂糖凝膠，電泳條件為25v，15h；

圖3為實施例二中樣品的凝膠電泳檢測結(jié)果圖，采用0.7％瓊脂糖凝膠，電泳條件為150v，30min；

圖4為實施例二中樣品的凝膠電泳檢測結(jié)果圖，采用0.7％瓊脂糖凝膠，電泳條件為25v，14h。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種全血dna快速提取方法，步驟包括：

s1、將血液樣本在13000～16000rpm轉(zhuǎn)速下離心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混勻至澄清狀態(tài)，置于50～60℃水浴40-60min，冷卻后采用有機溶劑抽提，離心后取上清液；所述裂解液組份包括：0.8～1.2m鹽酸胍；ph8.0～8.5、30～100mmtris-cl；ph8.0～8.5、30～100mmedta，體積百分比4～8％tween-20，體積百分比0.3～1％tritonx-100，質(zhì)量體積比0.3～1％sds和0.3～1mg/ml蛋白酶k；

s2、向步驟s1所得上清液中加入異丙醇和naac，混勻后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；

s3、向步驟s2所得晾干的沉淀中加入ten緩沖液和核糖核酸酶，混勻后置于37℃溫育30min，再加入含有蛋白酶k的ten緩沖液，混勻，置于50～60℃下30min，冷卻后離心，取上清液純化得到純凈dna。

其中，所述冷卻均為自然冷卻至室溫15～35℃。

作為優(yōu)選的，在本發(fā)明的一個實施例中，步驟s1中的裂解液為：0.8m鹽酸胍，30mmtris-cl(ph8.0)，30mmedta(ph8.0)，5％tween-20，0.5％triton-100，0.5％sds和0.5mg/mlproteinsek。

因為tritonx-100和tween-20是非離子的表面活性劑，它們的頭端基團是沒有極性的親水基團，可以破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)以及脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，而紅細胞和白細胞中除了蛋白質(zhì)，另外還有氨基酸、脂肪、碳水化合物等，采用tritonx-100與tween-20可以較好地分解細胞。鹽酸胍是強電解質(zhì)，因此變性總是伴隨著高離子強度，在脲和鹽酸胍變性的條件下，大多數(shù)的蛋白被變性，形成一種非常接近于無規(guī)卷曲的狀態(tài)；sds是一種非常高效的表面活性劑，幾乎可以使所有的蛋白質(zhì)溶解，它可以破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵，從而使蛋白質(zhì)變性，并喪失天然構(gòu)象和功能。蛋白酶k在sds和edta存在下保持很高的活性。sds可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與dna分離。edta則抑制dnase的活性；而蛋白酶k可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使dna分子完整地分離出來。而tris-cl和edta形成的緩沖液利于dna的穩(wěn)定和儲存。各個組分相互配合協(xié)同，只加一次裂解液即可將白細胞中的dna裂解出來。

優(yōu)選的，步驟s3所述ten緩沖液組份為：50～100mmtris(ph8.0～8.5)、50～100mmedta(ph8.0～8.5)、1～1.5mnacl。

優(yōu)選的，步驟s1中，裂解液添加量為血液樣本體積的1.5～2.5倍，且裂解液預(yù)熱至20～40℃后再添加至沉淀中。無需裂解紅細胞步驟，直接取沉淀后加入裂解液即可，加入預(yù)熱的裂解液后需充分打散沉淀混勻，保證裂解充分。所述血液樣本需解凍完全，具體的，可將血液樣本置于室溫下解凍，或于37℃水浴解凍，37℃下僅需幾十秒鐘即可完成解凍，方便快捷。若采用新鮮血液，亦可按照此方案提取，可考慮先凍融一次，否則步驟s1離心時間和轉(zhuǎn)速應(yīng)適當增加，且務(wù)必保證血液沒有凝聚。理論上此方案一次性處理的血液并沒有上限，但是為保證dna得率，優(yōu)選每次2ml以上的血液樣本量。1ml血液樣本量可得8～10ugdna，2ml血液樣本量可得20～30ugdna，5ml血液樣本量可得至少120ugdna。

優(yōu)選的，步驟s1所述有機溶劑為氯仿異戊醇混合液，所述氯仿異戊醇體積比為23～25:1。

更加優(yōu)選的，步驟s1中，抽提次數(shù)為1次。采用最佳的有機溶劑配比，保證抽提效果，只抽提1次，最大限度保證dna的完整。

優(yōu)選的，步驟s1中，所述水浴過程中每5～10min混勻1次。混勻操作應(yīng)輕柔，上下顛倒須動作輕柔防止dna斷裂，定期混勻保證裂解更充分。

優(yōu)選的，步驟s1中，所述離心時長8～15min，溫度4～16℃。常溫離心過程離心機易發(fā)熱，不推薦使用。使用冷凍離心機保持16℃左右的低溫可有效保護dna。

優(yōu)選的，步驟s2所述異丙醇用量為上清液體積的0.7～1倍，所述naac用量為上清液體積的0.1倍。異丙醇、naac添加后dna一般會形成絲狀或絮狀沉淀，在本發(fā)明的實施例中，沉淀收集方式為挑出絮狀沉淀，沉淀收集方式還可以是4℃下6000～12000rpm離心5～10min。

優(yōu)選的，步驟s3所述含有蛋白酶k的ten緩沖液稀釋5～10倍使用，蛋白酶k的濃度為0.5～1mg/ml。

所述ten緩沖液為100mmtris，50mmedta，1.4mnacl；ph8.5；ten緩沖液可有效保護dna同時高鹽溶液可溶解如多糖等雜質(zhì)，proteinsek進一步去除殘留蛋白。

優(yōu)選的，步驟s3所述上清液純化直接采用磁珠純化，磁珠用比為0.5～1倍待純化樣品體積，快速高效。

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的一種全血dna快速提取方法予以進一步說明。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料如無特殊說明，均為市場購買得到。

實施例一

本實施例提供了一種全血dna快速提取方法，具體步驟包括：

1)取人體血液樣品7.5ml，置于室溫解凍完全；

2)15000rpm4℃離心15min，徹底去掉上清，只留下管底沉淀；

3)加入2v的37℃預(yù)熱的裂解液(0.8mguanidinehcl，30mmtris-cl(ph8.0)，30mmedta(ph8.0)，5％tween-20，0.5％triton-100，0.5％sds，0.5mg/mlproteinsek)，用移液器將沉淀徹底打散混勻至澄清狀態(tài)；

4)置于56℃水浴1h，每隔10min輕柔顛倒混勻一次；

5)冷卻至室溫后加入等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提1次；

6)13000rpm離心10min(16℃)，取上清；

7)加入0.7v冷凍異丙醇和0.1vnaac(ph5.2)，混勻；

8)挑出絮狀沉淀，用75％冷凍乙醇清洗3次；

9)晾干，加入300ulten緩沖液(100mmtris，50mmedta，1.4mnacl；ph8.5)和2ulrnase(100mg/ml)，混勻后置于37℃溫育30min；

10)再加入200ulten(含1mg/mlproteinsek)，混勻，置于56℃水浴30min；

11)冷卻至室溫后15000rpm離心8min，小心吸取上清到新的離心管，加入磁珠進行純化，得到純凈dna，整個提取過程耗時6小時以內(nèi)，進一步的對所得dna進行檢測，結(jié)果如下：

一、質(zhì)檢結(jié)果如表1：

表1實施例一所得dna質(zhì)檢結(jié)果表

二、電泳結(jié)果如附圖1、附圖2所示

其中，采用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠孔上方標注為樣品編號，m1：15kbdnamarker(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)；m2：λdna/hindiii(23130、9416、6557、4361、2322、2027、564bp)。樣品按qubit濃度上樣200ng。

實施例二

取猴子血液樣品6ml，置于37℃水浴解凍完全；

2)15000rpm4℃離心15min，徹底去掉上清，只留下管底沉淀；

3)加入2v的37℃預(yù)熱的裂解液(0.8mguanidinehcl，30mmtris-cl(ph8.0)，30mmedta(ph8.0)，5％tween-20，0.5％triton-100，0.5％sds，0.5mg/mlproteinsek)，用移液器將沉淀徹底打散混勻至澄清狀態(tài)；

4)置于56℃水浴1h，每隔10min輕柔顛倒混勻一次；

5)冷卻至室溫后加入等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提1次；

6)13000rpm離心10min(16℃)，取上清；

7)加入0.7v冷凍異丙醇和0.1vnaac(ph5.2)，混勻；

8)挑出絮狀沉淀，用75％冷凍乙醇清洗3次；

9)晾干，加入300ulten緩沖液(100mmtris，50mmedta，1.4mnacl；ph8.5)和2ulrnase(100mg/ml)，混勻后置于37℃溫育30min；

10)再加入200ulten(含1mg/mlproteinsek)，混勻，置于56℃水浴30min；

11)冷卻至室溫后15000rpm離心8min，小心吸取上清到新的離心管，加入1x磁珠進行純化，得到純凈dna并對所得dna進行檢測，結(jié)果如下：

一、質(zhì)檢結(jié)果如表2：

表2實施例二所得dna質(zhì)檢結(jié)果表

二、電泳結(jié)果如附圖3、附圖4所示

其中，采用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠孔上方標注為樣品編號，m1：15kbdnamarker(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250)；m2：λdna/hindiii(23130、9416、6557、4361、2322、2027、564)。樣品上樣約200ng。

從實施例一、二的質(zhì)檢結(jié)果表可見，260/280的值均大于1.8，說明無蛋白和酚類物質(zhì)污染；260/230的值大于2.0，表明無糖類、鹽類或有機溶劑等污染。實施例一、二的瓊脂糖凝膠電泳圖可見，樣品dna條帶清晰、明亮、無拖帶且單一，說明完整性好，與m1、m2條帶對比，樣品dna長度在20kb以上，滿足三代測序需求。

實施例三

本實施例提供了一種全血dna快速提取方法，具體步驟包括：

1)取人體血液樣品5ml，置于室溫解凍完全；

2)15000rpm4℃離心15min，徹底去掉上清，只留下管底沉淀；

3)加入2.5v的37℃預(yù)熱的裂解液(1.2mguanidinehcl，100mmtris-cl(ph8.0)，80mmedta(ph8.0)，4％tween-20，0.3％triton-100，0.3％sds，0.3mg/mlproteinsek)，用移液器將沉淀徹底打散混勻至澄清狀態(tài)；

4)置于50℃水浴50min，每隔5min輕柔顛倒混勻一次；

5)冷卻至室溫后加入等體積氯仿異戊醇(25:1)抽提1次；

6)16000rpm離心8min(10℃)，取上清；

7)加入1v冷凍異丙醇和0.1vnaac(ph5.2)，混勻；

8)挑出絮狀沉淀，用75％冷凍乙醇清洗3次；

9)晾干，加入300ulten緩沖液(100mmtris，50mmedta，1.4mnacl；ph8.5)和2ulrnase(100mg/ml)，混勻后置于37℃溫育30min；

10)再加入200ulten(含0.8mg/mlproteinsek)，混勻，置于56℃水浴30min；

11)冷卻至室溫后15000rpm離心8min，小心吸取上清到新的離心管，加入磁珠進行純化，磁珠用比為1倍待純化樣品體積，得到純凈dna，整個提取過程耗時5小時以內(nèi)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。