本發(fā)明涉及一種采用細(xì)長反應(yīng)腔體進(jìn)行全基因組擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)，是一種實現(xiàn)對全基因組信息進(jìn)行高效、高均一性擴(kuò)增的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在過去的10年中，使用多重鏈置換反應(yīng)(multipledisplacementamplification，mda)(genomeresearch,2001,11:1095-1099)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(wholegenomeamplification，wga)的方法得到了很大的關(guān)注，多重鏈置換反應(yīng)可以完成對低起始量樣本的有效擴(kuò)增，使得擴(kuò)增后的核酸質(zhì)量和濃度滿足各類應(yīng)用的需求，特別是滿足構(gòu)建高通量dna測序文庫的需要。
與另一種同樣被廣泛使用的全基因組擴(kuò)增技術(shù)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)技術(shù)不同的是，多重鏈置換反應(yīng)的主要問題是整個反應(yīng)過程中的不均勻擴(kuò)增，導(dǎo)致基因組內(nèi)的擴(kuò)增均一性較差，對基因組之間的雜合信息分辨率低。一些研究者將這兩種方法混合使用，例如malbac(science,2012,338:1627-1630)和picoplex，在擴(kuò)增的早期階段采用隨機(jī)引物和變溫預(yù)擴(kuò)增，后期采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增的方法，但限制反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。然而這種混合并沒有解決多重鏈置換反應(yīng)的不足，與單純使用pcr和mda方法比較起來，這些方法也僅僅獲得了中間效果。
盡管存在這樣的問題，由于mda具有較高的擴(kuò)增效率和保真度，依然是較為廣泛使用的基于低起始量樣本的有效擴(kuò)增方法。一些基于微流控裝置或微液滴的多重鏈置換擴(kuò)增方法隨后被開發(fā)出來，以改善傳統(tǒng)多重鏈置換擴(kuò)增方法在擴(kuò)增均一性上的不足。quake等人將傳統(tǒng)的發(fā)生在離心管內(nèi)的多重鏈置換反應(yīng)轉(zhuǎn)移到納升的微流控反應(yīng)微腔中(plosgenetics,2007,3:1702-1708)，證實可以改善擴(kuò)增反應(yīng)的偏好性(bias)；在另一些報道中，多重鏈置換反應(yīng)體系被轉(zhuǎn)移進(jìn)微液滴環(huán)境中(pnas,2015,112:11923-11928；nucleicacidsresearch,2016,44:e66)，結(jié)果表明這些擴(kuò)增偏好會在一定程度上得到抑制。
然而，反應(yīng)微腔的制備和操作較為復(fù)雜，依賴精密的設(shè)備和精巧的操作，且費(fèi)用較為高昂，從零散的材料和設(shè)備開始構(gòu)建整個系統(tǒng)費(fèi)時費(fèi)力。將多重鏈置換擴(kuò)增轉(zhuǎn)移進(jìn)油水混合的乳液環(huán)境同樣對設(shè)備和操作的依賴性極大，商業(yè)化微液滴發(fā)生器機(jī)器配件價格較高，并且制備微乳液使用的表面活性劑在一定程度上影響反應(yīng)的進(jìn)行。因此，低起始量全基因組擴(kuò)增、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增等應(yīng)用迫切需要一種高效、廉價且具有較好均一性的全基因組擴(kuò)增方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
技術(shù)問題：本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有的用于全基因組的多重鏈置換擴(kuò)增方法，對基因組不同區(qū)域的擴(kuò)增一致性較差這一現(xiàn)狀，以及基于反應(yīng)微腔和微液滴的多重鏈置換擴(kuò)增方法系統(tǒng)復(fù)雜、花費(fèi)高昂和實驗流程復(fù)雜這一問題，試圖通過對反應(yīng)腔的改造，將反應(yīng)容器轉(zhuǎn)換為細(xì)長的連續(xù)反應(yīng)腔體，提升擴(kuò)增的均一性，簡化系統(tǒng)和實驗流程，降低花費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明提出了一種基于細(xì)長反應(yīng)腔的全基因組擴(kuò)增方法。本發(fā)明采用多重鏈置換擴(kuò)增方法，完成對目標(biāo)基因組的全基因組擴(kuò)增。多重鏈置換擴(kuò)增采用φ29、bst和klenow等dna聚合酶，在恒溫的條件下，利用隨機(jī)序列引物對目的核酸片段進(jìn)行大量高效的擴(kuò)增，可以實現(xiàn)飛克(fg)量級核酸或單個細(xì)胞基因組的有效擴(kuò)增，滿足后續(xù)的核酸檢測、dna測序等應(yīng)用的要求，具有較高的擴(kuò)增效率和保真性，使用較為廣泛。本發(fā)明將多重鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)體系置于細(xì)長形的反應(yīng)腔體中，并在該腔體中完成擴(kuò)增反應(yīng)。細(xì)長形的反應(yīng)腔體將多重鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)體系相對分隔于一個細(xì)長的反應(yīng)腔中，各微觀反應(yīng)單元之間的物質(zhì)交換和相互影響大為減少，因此各微觀反應(yīng)單元以一個相對獨(dú)立的狀態(tài)發(fā)生反應(yīng)，目標(biāo)核酸各個片段之間的擴(kuò)增一致性得到很大提升。同時，連通的細(xì)長反應(yīng)腔體，允許小分子量的離子在反應(yīng)體系內(nèi)的擴(kuò)散，對局部反應(yīng)單元的離子消耗給予相對及時的補(bǔ)充，保證了反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率不受影響。
技術(shù)方案：本發(fā)明是一種基于細(xì)長反應(yīng)腔的全基因組擴(kuò)增方法，將多重鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)體系注入細(xì)長型的反應(yīng)腔中，完成對目標(biāo)基因組的全基因組擴(kuò)增。
所述的多重鏈置換擴(kuò)增，是采用具有鏈置換能力的核酸聚合酶和隨機(jī)序列引物，在恒溫的條件下，對目標(biāo)基因組核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，提高其絕對質(zhì)量。
所述的具有鏈置換能力的核酸聚合酶，包括φ29dna聚合酶，klenowdna聚合酶或bstdna聚合酶等具有鏈置換能力的聚合酶。
所述的隨機(jī)序列引物，其長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個堿基，其中包含一個或多個簡并堿基。
所述的隨機(jī)序列引物，可以為普通未修飾引物，也可以為經(jīng)過硫代修飾、硫酸化修飾或氨基修飾等的修飾引物。
所述的細(xì)長形的反應(yīng)腔，反應(yīng)腔中反應(yīng)溶液所處的區(qū)域，區(qū)域總長度和反應(yīng)腔內(nèi)部平均橫截面積的平方根之間的比值在5：1到2×106：1之間。
所述的細(xì)長形的反應(yīng)腔，反應(yīng)腔中反應(yīng)溶液所處的區(qū)域，反應(yīng)腔內(nèi)部的平均橫截面積在25平方微米到4平方毫米之間。
所述的細(xì)長形的反應(yīng)腔，細(xì)長反應(yīng)腔的橫截面可以是圓形、橢圓形、正方形或長方形等各種幾何結(jié)構(gòu)，細(xì)長反應(yīng)腔各部分的橫截面可以相同，也可以不相同。
所述的細(xì)長形的反應(yīng)腔，細(xì)長形的反應(yīng)腔可以是塑料、玻璃或金屬等材質(zhì)的微細(xì)管道，也可以是通過微加工工藝在微流控芯片中制備的細(xì)長形流道。
所述的目標(biāo)基因組，為一種或多種人類、動物、植物或微生物的基因組，目標(biāo)基因組的規(guī)模，可以為單細(xì)胞基因組或多細(xì)胞基因組。
有益效果：
1、基于細(xì)長反應(yīng)腔的多重鏈置換擴(kuò)增，因為細(xì)長的反應(yīng)腔將待擴(kuò)增的dna模板和反應(yīng)體系分散于一個細(xì)長形的空間結(jié)構(gòu)中，各個具體的擴(kuò)增反應(yīng)單元彼此相對孤立，包括聚合酶和引物在內(nèi)的大分子交換較少，以一個近乎獨(dú)立的狀態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增，緩解了部分反應(yīng)單元的擴(kuò)增過度和擴(kuò)增不足，從而極大地提高了整個多重鏈置換反應(yīng)的擴(kuò)增均一性。
2、基于細(xì)長反應(yīng)腔的多重鏈置換擴(kuò)增，不需要預(yù)先制備微液滴發(fā)生裝置或復(fù)雜反應(yīng)微腔，并且在系統(tǒng)調(diào)試和擴(kuò)增反應(yīng)的過程中，不需要對微量液體進(jìn)行精密和復(fù)雜的控制，與微液滴多重鏈置換擴(kuò)增和基于微流控反應(yīng)微腔的多重鏈置換擴(kuò)增相比，極大地簡化了反應(yīng)系統(tǒng)，降低了操作復(fù)雜度。
3、基于細(xì)長反應(yīng)腔的多重鏈置換擴(kuò)增，不需要使用微液滴多重鏈置換擴(kuò)增體系所需的礦物油、表面活性劑等組分，避免了這些組分對擴(kuò)增反應(yīng)體系的干擾。
具體實施方式
實施例1：利用聚四氟乙烯(ptfe)毛細(xì)管全基因組擴(kuò)增yh-1永生化細(xì)胞。
樣本：1ng人類永生態(tài)細(xì)胞系yh-1基因組dna。
反應(yīng)體系：2.5nmol的n6隨機(jī)序列引物，序列為5’-nnnn-s-n-s-n-3’，其中第4和第5位堿基的3’端經(jīng)硫代修飾處理；φ29dna聚合酶，10u；φ29dna聚合酶反應(yīng)緩沖液，定容至50μl。
在冰上混合反應(yīng)體系，隨后注入內(nèi)徑為320μm的聚四氟乙烯(ptfe)毛細(xì)管。毛細(xì)管預(yù)先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常溫處理1小時。反應(yīng)體系通入毛細(xì)管后，用環(huán)氧樹脂膠密封毛細(xì)管兩端，并將毛細(xì)管繞于金屬繞線器上。毛細(xì)管的截面積約為80425μm2，截面積的平方根約為283.6μm，反應(yīng)區(qū)域長度約為621.7mm。將纏有毛細(xì)管的繞線器放入30℃水浴中孵育16小時，再進(jìn)入另一個65℃水浴中放置5分鐘以滅活φ29dna聚合酶。
反應(yīng)完成后，拆除毛細(xì)管兩端的密封膠，回收反應(yīng)體系，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程制備高通量dna測序文庫，在hiseq4000測序儀上進(jìn)行序列測定。測序完成后利用bwa短序列比對軟件與人類參考基因組進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果表明，與常規(guī)的在離心管中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法對比，兩者在擴(kuò)增效率上并不存在顯著的差異，然而利用聚四氟乙烯毛細(xì)管的擴(kuò)增方法顯著提升了擴(kuò)增的一致性，不同區(qū)域覆蓋深度的變異系數(shù)(coefficientofvariation)由離心管中全基因組擴(kuò)增的0.78降低至毛細(xì)管中的0.38。覆蓋參考基因組90％的區(qū)域，毛細(xì)管法需要約6倍的測序深度，而離心管法需要約13倍的測序深度，毛細(xì)管法更加有優(yōu)勢。當(dāng)測序通量為基因組大小的35倍時，采用離心管法在基因組73.64％的區(qū)域覆蓋深度大于等于10倍，而采用毛細(xì)管法在基因組85.61％的區(qū)域覆蓋深度大于等于10倍。
實施例2：利用微流控芯片細(xì)長微流道擴(kuò)增單個tc-1小鼠永生化細(xì)胞基因組。
樣本：裂解后的小鼠永生態(tài)細(xì)胞系tc-1單細(xì)胞。
反應(yīng)體系：2.5nmol的n9隨機(jī)序列引物，序列為5’-nnnnnnn-s-n-s-n-3’，其中第7和第8位堿基的3’端經(jīng)硫代修飾處理；klenowdna聚合酶，5u；klenowdna聚合酶反應(yīng)緩沖液，定容至20μl。
利用軟光刻法制備含有細(xì)長微流道的玻璃微流控芯片，微流道反復(fù)彎折整齊排列，微流道橫截面為長方形，寬400μm，深500μm，微流道長200mm。微流控芯片的底面緊貼半導(dǎo)體溫控器件用于對芯片的溫度控制。
在冰上混合反應(yīng)體系，隨后注入上述微流控芯片中，并使反應(yīng)體系停留在細(xì)長微流道區(qū)域。微流道的截面積為0.2mm2，截面積的平方根約為447.2μm，反應(yīng)區(qū)域長度約為100mm。細(xì)長微流道預(yù)先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常溫處理1小時。反應(yīng)體系通入細(xì)長微流道后，利用半導(dǎo)體溫控器件進(jìn)行溫控，37℃孵育10小時，65℃孵育5分鐘以滅活klenowdna聚合酶。
反應(yīng)完成后，回收反應(yīng)體系，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程制備高通量dna測序文庫，在hiseq4000測序儀上進(jìn)行序列測定。測序完成后利用bwa短序列比對軟件與小鼠參考基因組進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果表明，與常規(guī)的在離心管中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法對比，兩者在擴(kuò)增效率上并不存在顯著的差異，然而利用微流控芯片微流道的擴(kuò)增方法顯著提升了擴(kuò)增的一致性，不同區(qū)域覆蓋深度的變異系數(shù)(coefficientofvariation)由離心管中全基因組擴(kuò)增的0.82降低至微流道中的0.40。覆蓋參考基因組40％的區(qū)域，微流道法需要約15倍的測序深度，而離心管法需要約30倍的測序深度，微流道法更加有優(yōu)勢。
實施例3：利用不銹鋼金屬管擴(kuò)增擴(kuò)增擬南芥基因組dna。
樣本：5ng擬南芥基因組dna。
反應(yīng)體系：2.5nmol的n12隨機(jī)序列引物，序列為5’-nnnnnnnnnnnn-3’；bstdna聚合酶，10u；bstdna聚合酶反應(yīng)緩沖液，定容至40μl。
在冰上混合反應(yīng)體系，隨后注入內(nèi)口為正方形的，邊長為2mm的不銹鋼方管中。不銹鋼管預(yù)先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常溫處理1小時。反應(yīng)體系通入不銹鋼管，用環(huán)氧樹脂膠密封不銹鋼管兩端。金屬管的截面積為4mm2，截面積的平方根為2mm，反應(yīng)區(qū)域長度約為10mm。隨后將不銹鋼管置于水浴鍋內(nèi)65℃孵育4小時，再進(jìn)入另一個80℃水浴中放置20分鐘以滅活bstdna聚合酶。
反應(yīng)完成后，回收反應(yīng)體系，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程制備高通量dna測序文庫，在hiseq4000測序儀上進(jìn)行序列測定。測序完成后利用bwa短序列比對軟件與擬南芥參考基因組進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果表明，與常規(guī)的在離心管中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法對比，兩者在擴(kuò)增效率上并不存在顯著的差異，然而利用不銹鋼管的擴(kuò)增方法提升了擴(kuò)增的一致性，不同區(qū)域覆蓋深度的變異系數(shù)(coefficientofvariation)由離心管中全基因組擴(kuò)增的0.79降低至不銹鋼管中的0.62。覆蓋參考基因組90％的區(qū)域，不銹鋼管法需要約12倍的測序深度，而離心管法需要約16倍的測序深度，不銹鋼管法更加有優(yōu)勢。
實施例4：利用聚乙烯(pe)毛細(xì)管擴(kuò)增k12大腸桿菌dna樣本。
樣本：2ng提取自k12大腸桿菌的基因組dna。
反應(yīng)體系：2.5nmol的n6隨機(jī)序列引物，序列為5’-nnnn-s-n-s-n-3’，其中第4和第5位堿基的3’端經(jīng)硫代修飾處理；φ29dna聚合酶，10u；φ29dna聚合酶反應(yīng)緩沖液，定容至50μl。
在冰上混合反應(yīng)體系，隨后注入內(nèi)徑為200μm的聚乙烯(pe)毛細(xì)管。毛細(xì)管預(yù)先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常溫處理1小時。反應(yīng)體系通入毛細(xì)管后，用環(huán)氧樹脂膠密封毛細(xì)管兩端，并將毛細(xì)管繞于金屬繞線器上。毛細(xì)管的截面積為31415.9μm2，截面積的平方根約為177.2μm，反應(yīng)區(qū)域長度約為621.7mm。將纏有毛細(xì)管的繞線器放入30℃水浴中孵育16小時，再進(jìn)入另一個65℃水浴中放置5分鐘以滅活φ29dna聚合酶。
反應(yīng)完成后，拆除毛細(xì)管兩端的密封膠，回收反應(yīng)體系，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程制備高通量dna測序文庫，在hiseq4000測序儀上進(jìn)行序列測定。測序完成后利用bwa短序列比對軟件與k12大腸桿菌參考基因組進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果表明，與常規(guī)的在離心管中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法對比，兩者在擴(kuò)增效率上并不存在顯著的差異，然而利用聚乙烯毛細(xì)管的擴(kuò)增方法顯著提升了擴(kuò)增結(jié)果的一致性。不同區(qū)域覆蓋深度的變異系數(shù)(coefficientofvariation)由離心管中全基因組擴(kuò)增的0.65降低至毛細(xì)管中的0.23。覆蓋參考基因組90％的區(qū)域，毛細(xì)管法需要約8倍的測序深度，而離心管法需要約17倍的測序深度，毛細(xì)管法更加有優(yōu)勢。
實施例5：利用微流控芯片細(xì)長微流道擴(kuò)增人類腫瘤k562永生化細(xì)胞基因組。
樣本：60pg提取自人類腫瘤細(xì)胞k562的基因組dna。
反應(yīng)體系：2.5pmol的n6隨機(jī)序列引物，序列為5’-nnnn-s-n-s-n-3’，其中第4和第5位堿基的3’端經(jīng)硫代修飾處理；φ29dna聚合酶，0.5u；φ29dna聚合酶反應(yīng)緩沖液，定容至0.25μl。
利用光刻法制備含有細(xì)長微流道的硅微流控芯片，微流道反復(fù)彎折整齊排列，微流道橫截面為長方形，寬5μm，深5μm，微流道長12m。微流控芯片的底面緊貼半導(dǎo)體溫控器件用于對芯片的溫度控制。
在冰上混合反應(yīng)體系，隨后注入上述微流控芯片中，并使反應(yīng)體系停留在細(xì)長微流道區(qū)域。微流道的截面積為25μm2，截面積的平方根約為5μm，反應(yīng)區(qū)域長度約為10m。細(xì)長微流道預(yù)先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常溫處理1小時。反應(yīng)體系通入細(xì)長微流道后，利用半導(dǎo)體溫控器件進(jìn)行溫控，30℃孵育10小時，65℃孵育5分鐘以滅活φ29dna聚合酶。
反應(yīng)完成后，回收反應(yīng)體系，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程制備高通量dna測序文庫，在hiseq4000測序儀上進(jìn)行序列測定。測序完成后利用bwa短序列比對軟件與人類參考基因組進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果表明，與常規(guī)的在離心管中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法對比，兩者在擴(kuò)增效率上并不存在顯著的差異，然而利用微流控芯片微流道的擴(kuò)增方法顯著提升了擴(kuò)增的一致性，不同區(qū)域覆蓋深度的變異系數(shù)(coefficientofvariation)由離心管中全基因組擴(kuò)增的0.82降低至微流道中的0.60。覆蓋參考基因組70％的區(qū)域，微流道法需要約16倍的測序深度，而離心管法需要約22倍的測序深度，微流道法更加有優(yōu)勢。