本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌pe-28株及利用該菌株制備人參肽的方法。
背景技術(shù)：
：生物活性肽(bioacti)根據(jù)肽鏈長(zhǎng)度，分為二肽、小分子肽和多肽，肽除具有營(yíng)養(yǎng)功能以外，還有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能，如降血壓、阿片樣活性、抗血栓、促進(jìn)免疫以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等。生物活性肽不僅具有廣泛的活性和多樣性，而且具有來(lái)源豐富、成本低、安全性好、易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨著對(duì)生物活性肽的作用機(jī)制、生理效果以及制備方法的深入研究，人們已經(jīng)從各種乳蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、魚貝類蛋白、膠原蛋白等食物蛋白的酶解產(chǎn)物或發(fā)酵制品中分離得到了多種生物活性肽。一些生物活性肽已經(jīng)作為健康食品、功能食品和藥物實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，并取得巨大的經(jīng)濟(jì)效益，生物活性肽應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。目前，對(duì)活性肽的研究日益活躍，市場(chǎng)上活性肽的種類和數(shù)量不斷增加。活性肽的制備主要包括蛋白酶酶解、基因工程、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵等方法。使用食品級(jí)微生物發(fā)酵酶解活性肽制備技術(shù)，例如乳酸菌發(fā)酵乳蛋白制備降壓肽、抗氧化肽等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種利用乳桿菌發(fā)酵酶解技術(shù)制備功能性生物活性肽的新方法，基于此，本發(fā)明提供一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌pe-28株及利用該菌株制備人參肽的方法。本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctccno:m2017087。本發(fā)明還提供了采用上述的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制備人參肽的方法，該方法包括以下步驟：步驟一、將干人參根粉碎，用60％乙醇溶液回流提取兩次，過(guò)濾后濾渣用80～100℃熱水提取兩次，每次提取0.5～1.5h，過(guò)濾后合并濾液，經(jīng)濃縮、離心后上清液加入固體(nh4)2so4進(jìn)行沉淀，4℃靜置過(guò)夜，再經(jīng)離心、透析、凍干工藝獲得人參總蛋白凍干粉；步驟二、將人參總蛋白凍干粉制成人參蛋白培養(yǎng)基，將植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株接種于人參蛋白培養(yǎng)基中，所述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的接種量是人參蛋白培養(yǎng)基體積的3％，37℃靜置培養(yǎng)15～25h，經(jīng)離心、濃縮、凍干工藝獲得人參肽。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟一，將干人參根粉碎至30目。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟一，所述干人參根選取5年以下通過(guò)栽培獲得的干人參的根。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟一，所述熱水溫度為80℃。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟一，所述(nh4)2so4濃度為70％。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟二中，所述人參蛋白培養(yǎng)基的制備過(guò)程如下：稱取人參總蛋白凍干粉25g，葡萄糖20g，加水配制成1000ml溶液，115℃滅菌20min，獲得人參蛋白培養(yǎng)基。作為優(yōu)選的實(shí)施例，步驟二中，離心的條件為：6000rpm，10min，4℃。利用上述的制備方法獲得的人參肽。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株在制備食品、保健品、藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一株具有高蛋白酶解活力的乳酸菌新菌株-植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，以及利用該植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株發(fā)酵酶解人參蛋白制備功能性人參肽的方法，為微生物發(fā)酵酶解制備生物活性肽提供了一條新途徑。本發(fā)明提供的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株及其發(fā)酵酶解制備的人參肽產(chǎn)品都可以作為功能性益生菌和功能性原料應(yīng)用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域，所獲得的小分子生物活性人參肽具有顯著的提高免疫力和抗疲勞作用。附圖說(shuō)明圖1為硫酸銨分級(jí)沉淀人參總蛋白的sds-page電泳圖譜。圖2為利用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制備的人參總蛋白hplc分析圖譜。圖3為利用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制備的人參肽hplc分析圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明是經(jīng)廣泛篩選獲得的一株具有高蛋白酶解活力的乳酸菌新菌株-植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，并以人參蛋白為底物，利用植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株發(fā)酵酶解制備小分子生物活性人參肽，該小分子生物活性人參肽具有顯著的提高免疫力和抗疲勞作用，是開發(fā)健康食品和保健食品重要的功能因子。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)(武漢大學(xué)保藏中心)，保藏編號(hào)為：cctccno:m2017087。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，是采用東北發(fā)酵酸菜經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)純化得到的，20％甘油、-80℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株經(jīng)多種試驗(yàn)鑒定，革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性、吲哚試驗(yàn)陰性、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)陰性、明膠液化試驗(yàn)陰性、水解淀粉試驗(yàn)陰性和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的生理生化特性如下：革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性，聯(lián)苯胺試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陽(yáng)性；不運(yùn)動(dòng)的桿菌；最適生長(zhǎng)溫度為37～42℃，適宜ph為5.0～7.0；在15℃和45℃能夠生長(zhǎng)；耐受6.5％nacl；不水解淀粉，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；在液體mrs培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長(zhǎng)，久置菌體呈白色沉淀。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的api50ch(法國(guó)梅里埃公司)鑒定結(jié)果如下：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、n-乙酰-葡萄糖胺、七葉醇、柳醇、纖維二糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉籽糖、牻牛兒糖、葡萄糖酸鹽；不能利用阿東醇、阿拉伯糖、糖原、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、肌醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、α-甲基-d-甘露糖苷、淀粉、鼠李糖、木糖醇、d-松二糖、d-塔格糖、d-米蘇糖、葡萄糖酸鹽、d-阿拉伯糖醇、巖糖、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、5-酮基-葡萄糖酸鹽。本發(fā)明的菌株pe-28經(jīng)16srdna序列同源性分析可以確定為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株可以作為一種活性成分在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用。所說(shuō)的產(chǎn)品可以為利用植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株、其發(fā)酵物或者其發(fā)酵物提取物制作而成的食品、保健品或藥品等。利用本發(fā)明的一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株發(fā)酵酶解制備人參肽的方法，包括以下步驟：步驟一、將干人參根粉碎，用60％乙醇溶液回流提取兩次，過(guò)濾后濾渣用80～100℃熱水提取兩次，每次提取0.5～1.5h，過(guò)濾后合并濾液，經(jīng)濃縮、離心后上清液加入固體(nh4)2so4進(jìn)行沉淀，4℃靜置過(guò)夜，再經(jīng)離心、透析、凍干工藝獲得人參總蛋白凍干粉；步驟二、將人參總蛋白凍干粉制成人參蛋白培養(yǎng)基，將植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株接種于人參蛋白培養(yǎng)基中，所述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的接種量是人參蛋白培養(yǎng)基體積的3％，37℃靜置培養(yǎng)15～25h，經(jīng)離心、濃縮、凍干工藝獲得人參肽。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均通過(guò)常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。固體bcp培養(yǎng)基：溶劑為水，含酵母膏2.5g/l、蛋白胨5g/l、葡萄糖5g/l、溴甲酚紫0.04g/l、瓊脂15g/l，ph為7.0。液體bcp培養(yǎng)基與固體bcp培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于不加入瓊脂。固體mrs培養(yǎng)基：溶劑為水，含蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、kh2po42g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸鈉5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·4h2o0.05g/l、吐溫-801ml/l、瓊脂15g/l、葡萄糖20g/l，ph為6.6。液體mrs培養(yǎng)基與固體mrs培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于不加入瓊脂。實(shí)施例1本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的制備一、菌株的分離1、樣本取材：東北發(fā)酵酸菜。取東北發(fā)酵酸菜5g，固體用研缽研碎呈糊狀，加入45ml生理鹽水(為10倍稀釋)，混勻取0.5ml稀釋液，再次用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋至10-3，取100ul液體(10-1、10-2、10-3)涂布于固體bcp培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，48～72h)。挑取產(chǎn)黃圈的單菌落接種于固體mrs培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，48h)，經(jīng)固體mrs培養(yǎng)基平板反復(fù)劃線培養(yǎng)純化(37℃，48h)，得到多株純培養(yǎng)菌種。2、將上述獲得的多株純培養(yǎng)的菌種分別接種于液體mrs培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃，14～18h)，然后加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。3、經(jīng)革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性、吲哚試驗(yàn)陰性、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)陰性、明膠液化試驗(yàn)陰性、水解淀粉試驗(yàn)陰性和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性從多株純培養(yǎng)的菌種中篩選出多株植物乳桿菌，選取其中的1株命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株。二、菌株的鑒定1、本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的生理生化鑒定結(jié)果如下：革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性，聯(lián)苯胺試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陽(yáng)性；不運(yùn)動(dòng)的桿菌；最適生長(zhǎng)溫度為37～42℃，適宜ph為5.0～7.0；在15℃和45℃能夠生長(zhǎng)；耐受6.5％nacl；不水解淀粉，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；在液體mrs培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長(zhǎng)，久置菌體呈白色沉淀。2、本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的api50ch(法國(guó)梅里埃公司)鑒定結(jié)果如下：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、n-乙酰-葡萄糖胺、七葉醇、柳醇、纖維二糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉籽糖、牻牛兒糖、葡萄糖酸鹽；不能利用阿東醇、阿拉伯糖、糖原、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、肌醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、α-甲基-d-甘露糖苷、淀粉、鼠李糖、木糖醇、d-松二糖、d-塔格糖、d-米蘇糖、葡萄糖酸鹽、d-阿拉伯糖醇、巖糖、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、5-酮基-葡萄糖酸鹽。3、16srdna序列同源性分析(1)ctab法提取菌株基因組dna將分離的多株植物乳桿菌接種于液體mrs培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，取10ml培養(yǎng)液，10000r/min離心10min，離心后棄去上清液，用te緩沖液清洗菌體1次；將清洗后的菌體重懸浮于1.9ml的te緩沖液中，加入0.1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的sds溶液、10μl濃度為20mg/ml的蛋白酶k、5μl濃度為50mg/ml的溶菌酶，混勻后在37℃的水浴鍋中水浴1h；水浴后，向體系中加入300μl5m的nacl溶液和300μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的ctab-nacl溶液，混勻后在65℃的水浴鍋中水浴20min；水浴后，向體系中加入等體積的氯仿-異戊醇溶液(氯仿溶液與異戊醇溶液的體積比為24:1)，充分混勻后10000r/min離心30min；吸取上清液至新的離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇溶液(酚溶液、氯仿溶液、異戊醇溶液的體積比為25:24:1)，充分混勻后10000r/min離心30min；吸取上清液至新的離心管中，加入0.6倍體積的異戊醇溶液，在-20℃的條件下放置2h，然后10000r/min離心20min，棄去上清液；用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液清洗沉淀，然后10000r/min離心20min，在室溫條件下放置至乙醇完全控干；將沉淀溶于20μlte緩沖液中，加入1μl的rna酶并在37℃的水浴鍋中水浴1h，獲得菌株基因組dna，置于-20℃保存。(2)pcr擴(kuò)增①擴(kuò)增引物：根據(jù)乳酸菌的16srdna序列的保守區(qū)域，采用jung-hoonyoon等人設(shè)計(jì)的引物，其序列如下：16sf：5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇；16sr：5＇-agaaaggaggtgatccagc-3＇。②pcr反應(yīng)體系如表1所示：表1體系組分反應(yīng)體系takaraextaq(5u/μl)0.25μl10×extaqbuffer(mg2+plus)5μl5μldntpmixture(各2.5mmol/l)4μl基因組dna1μl正向引物(10μmol/l)1μl反向引物(10μmol/l)1μl滅菌雙餾水37.75μl總體積50μl③pcr擴(kuò)增程序如下：④檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)先制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的瓊脂糖凝膠(加入10mg/ml的溴化乙錠eb)，pcr擴(kuò)增結(jié)束后，吸取5μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物和1μl的6×loadingbuffer混合均勻，用移液器加入到瓊脂糖凝膠板的點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳。目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為1500bp，使用dl2000的dnamarker，以1×tae作為電泳液，電泳電壓為100v，電泳時(shí)間為40min。(3)分析將驗(yàn)純后的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工進(jìn)行測(cè)序；獲得各菌株的16srdna序列通過(guò)blast程序與genbank庫(kù)中已知菌株的序列信息進(jìn)行同源性比對(duì)分析，鑒定待測(cè)菌株；以16srdna序列同源性大于99％為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類，然后再將待測(cè)菌株與模式菌株的16srdna序列利用mega4.0軟件中的neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16srdna序列如序列表中的seqidno:1所示。基于上述分析結(jié)果可以確定，本發(fā)明的菌株pe-28為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。4、菌株的保藏本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)(武漢大學(xué)保藏中心)，保藏編號(hào)為：cctccno:m2017087。實(shí)施例2植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的蛋白酶活力分析采用鄰苯二甲醛法篩選評(píng)價(jià)菌株的蛋白酶活力，鄰苯二甲醛法是一種得到廣泛認(rèn)可的蛋白酶水解活性測(cè)定方法。其原理是通過(guò)鄰苯二甲醛與β-巰基乙醇發(fā)生水解反應(yīng)，釋放出α-氨基酸，在紫外波長(zhǎng)340nm處有強(qiáng)吸收峰，通過(guò)測(cè)定α-氨基酸含量來(lái)反映乳酸菌的蛋白水解能力大小。其具體步驟如下：(1)試劑配制100μg/ml酪氨酸溶液的配制：將酪氨酸在105℃烘箱中烘至恒重，精確稱取恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6ml、1mol/l的鹽酸使其溶解，用0.2mol/l鹽酸定容至100ml，此時(shí)酪氨酸溶液濃度為1000μg/ml，再吸取此溶液10ml，以0.2mol/l鹽酸定容至100ml，即配制成濃度為100μg/ml的酪氨酸溶液，此溶液配成后應(yīng)及時(shí)使用或及時(shí)放入冰箱中保存。opa試劑的配制：將62.5ml、0.1m的四硼酸鈉溶液，6.25ml、20％sds溶液，100mg鄰苯二甲醛，5ml甲醇溶液，250μlβ-巰基乙醇溶液混合，定容至250ml，即配制成opa試劑，opa試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，并避光保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別量取0、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml的酪氨酸溶液(濃度為100μg/ml)，用ddh2o將溶液補(bǔ)至5ml，混合均勻，備用；取150μl不同濃度的酪氨酸溶液，加入3mlopa試劑，輕輕震蕩均勻，室溫反應(yīng)2min，測(cè)定od340值；以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)、od340值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.0146x+0.0021(r2＝1)。(3)樣品測(cè)定將本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株按3％(v/v)的量接種于11％脫脂乳中，37℃培養(yǎng)24h；取1.25ml菌液，加入0.3mlddh2o，3ml、0.75m三氯乙酸，混合均勻后，室溫靜止10min；6000r/min、4℃離心6min，取上清備用；取150μl上清，加入3mlopa試劑，輕輕震蕩，室溫條件靜止反應(yīng)2min，于波長(zhǎng)340nm處測(cè)定溶液的吸光度；得到的od340值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)照，得到的蛋白酶水解活性相當(dāng)于酪氨酸的量，也可直接以od340值作對(duì)比。由表2的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的蛋白酶水解活性高于其他測(cè)試菌株(nc305、dm-12、nc301)，游離氨基酸含量可達(dá)到137.48μg/ml。表2高蛋白水解活性菌株復(fù)篩結(jié)果菌株游離氨基酸含量(μg/ml)pe-28137.48nc30510.04dm-120.97nc30156.74實(shí)施例3利用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株發(fā)酵酶解制備人參肽1、人參總蛋白的提取選材：5年以下通過(guò)栽培獲得的干人參的根。稱取5年以下栽培干人參的根2000g，粉碎至30目，加入10～30倍量(干人參的根與60％乙醇溶液的重量比為1:10-30)的60％乙醇溶液回流提取2次，過(guò)濾，濾渣用10～30倍量(濾渣與80℃熱水的重量比為1:10-30)的80℃熱水煮沸提取2次，每次1h，過(guò)濾，合并濾液，取濾液1l濃縮至100ml，離心(4000rpm，10min，4℃)，上清液加入固體(nh4)2so4進(jìn)行沉淀，(nh4)2so4濃度為70％(硫酸銨的質(zhì)量百分含量g/100g)，4℃靜置過(guò)夜，經(jīng)離心(5000rpm，30min，4℃)、透析(6000～8000da)、凍干得人參總蛋白凍干粉。2、人參肽的制備培養(yǎng)基的制備：稱取人參總蛋白凍干粉25g，葡萄糖20g，加水配制成1000ml溶液，115℃滅菌20min，獲得人參蛋白培養(yǎng)基；發(fā)酵：按人參蛋白培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)3％接入本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，37℃靜置培養(yǎng)20h，經(jīng)離心(6000rpm，10min，4℃)、上清濃縮、凍干得人參肽。3、人參總蛋白的sds-page電泳分析和人參肽的分析采用硫酸銨分級(jí)沉淀試驗(yàn)對(duì)人參總蛋白進(jìn)行sds-page電泳，其結(jié)果如圖1所示。4、人參總蛋白和人參肽的高效液相色譜(hplc)分析將上述獲得的人參總蛋白于5000rpm、4℃條件下離心10min，離心后的上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行hplc檢測(cè)，以表3流動(dòng)相比例梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，柱溫：50℃，流速：0.5ml/min，色譜柱：zorbax300sb-c18，其hplc圖譜如圖2所示。同理，將上述獲得的人參肽發(fā)酵液于5000rpm、4℃條件下離心10min，離心后的上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行hplc檢測(cè)，以表3流動(dòng)相比例梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，柱溫：50℃，流速：0.5ml/min，色譜柱：zorbax300sb-c18，其hplc圖譜如圖3所示。結(jié)果表明：通過(guò)比較利用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株發(fā)酵酶解制備的人參總蛋白hplc圖譜(圖2)與人參肽hplc圖譜(圖3)可知，所制得的人參肽在不同保留時(shí)間出現(xiàn)不同的小分子肽峰：1.57/1.75/2.19/3.32/4.51/5.25/6.22/7.44。表3梯度洗脫(min)0.1％三氟乙酸0.01％三氟乙酸+80％乙睛0.009821.009828.8055459.0059515.0059515.2098225.00982本發(fā)明公開了一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。sequencelisting<110>吉林省命之元生物科技有限公司<120>一株高蛋白酶解活力植物乳桿菌pe-28株及利用該菌株制備人參肽的方法<160>1<210>1<211>1472<212>dna<213>人工<400>1acttcaccctaatcatctgtcccaccttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccg60actttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt120attcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttg180cagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgca240actcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatt300tgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaactt360aatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacg420acacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaat480ctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaa540accacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcgg600ccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccct660ccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgct720acccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtg780ttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgca840ctcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagac900ttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctac960gtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgaggctttctggttaaataccgtcaata1020cctgaacagttactctcagatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacc1080cttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctac1140tgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctc1200aggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccg1260cgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaag1320ttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcc1380cacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatc1440aataccagagttcgttcgacttgcatgatagc1472當(dāng)前第1頁(yè)12