本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學技術領域，具體涉及一種昆蟲水虻腸道來源的粘質沙雷氏菌bsfl-6及其應用，該粘質沙雷氏菌bsfl-6分離自轉化含四環(huán)素污染物料的水虻腸道，還涉及該粘質沙雷氏菌與水虻協(xié)同降解四環(huán)素的應用，還涉及該粘質沙雷氏菌抑制有害菌金黃色葡萄球菌及大腸桿菌生長的應用。

背景技術：

隨著集約化現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素在其生產(chǎn)過程中使用量越來越大，高劑量的抗生素可以用于治療各種疾病，而低劑量的則可用于促進畜禽生長和增產(chǎn)，在全球范圍內幾乎所有地區(qū)都采用抗生素來實現(xiàn)追求產(chǎn)量、提高經(jīng)濟效益的目的。其中，四環(huán)素在藥品市場中占有重要地位，是世界上應用最為廣泛的抗生素之一。相關統(tǒng)計顯示，2014年我國四環(huán)素產(chǎn)量達到4000余噸，此外，全國還有4萬噸左右的四環(huán)素衍生物及其鹽的生產(chǎn)能力。雖然在國內外醫(yī)藥市場上，四環(huán)素已退出抗感染的主流藥物品種，但因其價格低廉，抗菌譜廣，多年來大量用于畜禽用藥及添加到飼料中。它們進入動物或人體內后大約70％不能被吸收，而是以母體化合物的形式直接被排出體外。

環(huán)境中的四環(huán)素對微生物、植物和動物存在著一定的生態(tài)毒性，并誘使微生物產(chǎn)生抗性基因增加生態(tài)風險。它能抑制微藻蛋白質合成和葉綠體的生成；通過抑制葉綠體合酶的活性，從而對植物生長產(chǎn)生抑制作用；抑制水生動物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈-o-去乙基酶、β-半乳糖苷酶等，并可能造成魚類較嚴重的dna損傷；引起小鼠肝細胞基因表達的改變，涉及包括能量代謝的抑制、蛋白質的合成以及藥物代謝相關酶系基因的抑制等多個分子機制。同時，由四環(huán)素等導致的抗性基因的積累也是耐受細菌——“超級細菌”產(chǎn)生原因之一，是十分嚴重的生態(tài)威脅。

在針對畜禽糞便的各項處理技術中，水虻處理技術是一項新型高效、低成本高產(chǎn)值技術。水虻是一種資源昆蟲，其幼蟲類似于蠅蛆能以畜禽糞便為食，但比蠅蛆個頭更大，生長周期更長，預蛹期會自動爬出，更易實現(xiàn)操縱控制，相應的處理效率和生物質產(chǎn)出更高；其成蟲相對蒼蠅更潔凈，不趨近人類；許多研究者將水虻直接接種到堆積的畜禽糞便中，發(fā)現(xiàn)其同時具有趨避蠅蛆、除臭、抑制和殺死病原微生物的作用，至水虻預蛹時期(2-3周)還可以直接收集從畜禽糞便中爬出的已脫皮的干凈幼蟲，形成更高附加值的副產(chǎn)品(包括蟲體蛋白、昆蟲油脂、殘留肥料等)，用于飼料形成整個生態(tài)養(yǎng)殖循環(huán)，因此受到了世界研究者的關注。

針對上述問題，申請人在對含四環(huán)素的雞糞和豬糞的水虻轉化研究中，發(fā)現(xiàn)水虻可以有效分解四環(huán)素等抗生素。通過構建無菌水虻體系、比較水虻腸道微生物在分解四環(huán)素過程中的貢獻，研究發(fā)現(xiàn)，水虻腸道微生物是水虻分解四環(huán)素的關鍵參與者。本發(fā)明從水虻腸道中分離得到了一株水虻腸道共生菌粘質沙雷氏菌bsfl-6，具備增強水虻在轉化物料過程中抵抗和降解四環(huán)素的能力，并對有害菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)及大腸桿菌(e.coli)有抑菌活性，是一株水虻腸道益生菌，目前，國際上還沒有從昆蟲腸道分離具有降解抗生素并可以與昆蟲水虻共生降解抗生素的昆蟲腸道細菌的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種粘質沙雷氏菌bsfl-6，該菌株能與水虻良好共生，本身在好氧環(huán)境中具有一定的降解四環(huán)素的能力，同時能有效抑制有害菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)及大腸桿菌(e.coli)，該菌株已于2017年2月28日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)bsfl-6，保藏編號：cctccno:m2017073，地址：中國武漢武漢大學。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了粘質沙雷氏菌bsfl-6的應用，包括利用該菌株制備抵抗和/或降解四環(huán)素的水虻，或是利用該菌制備成四環(huán)素的降解劑，或是制備同時降解四環(huán)素和抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的制劑。

為了達到以上目的，本發(fā)明采取以下措施：

通過構建無菌水虻體系、比較水虻腸道微生物在分解四環(huán)素過程中的貢獻，申請人發(fā)現(xiàn)，水虻腸道微生物是水虻分解四環(huán)素的關鍵參與者，通過分離，申請人自轉化含四環(huán)素污染物料的水虻腸道中分離得到一株粘質沙雷氏菌bsfl-6，該菌株已于2017年2月28日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)bsfl-6，保藏編號：cctccno：m2017073，地址：中國武漢武漢大學。

粘質沙雷氏菌bsfl-6在28℃下培養(yǎng)產(chǎn)生紅色色素，該菌具有纖維素水解、蛋白水解、淀粉水解、脂肪水解、解磷、解鉀和固氮等活性，并能拮抗有害菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)及大腸桿菌(e.coli)。

粘質沙雷氏菌bsfl-6的培養(yǎng)：在lb培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)。

粘質沙雷氏菌bsfl-6的應用，包括利用該菌株制備抵抗和降解四環(huán)素的水虻，或是利用該菌制備成四環(huán)素的降解劑，或是制備同時降解四環(huán)素和抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的制劑。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.粘質沙雷氏菌bsfl-6具有纖維素水解、蛋白水解、淀粉水解、脂肪水解、解磷、解鉀和固氮等活性，可與水虻共生，促進水虻生長；

2.粘質沙雷氏菌bsfl-6能拮抗有害菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)及大腸桿菌(e.coli)，是一株水虻腸道益生菌；

3.粘質沙雷氏菌bsfl-6可以離體降解四環(huán)素，而且可以與水虻聯(lián)合降解四環(huán)素，是一株具有抗生素降解應用潛力的水虻腸道益生菌。

附圖說明

圖1為粘質沙雷氏菌bsfl-6在含不同濃度四環(huán)素的lb培養(yǎng)基中的生長曲線示意圖。

圖2為粘質沙雷氏菌bsfl-6回接于無菌水虻處理含四環(huán)素物料時四環(huán)素降解率比較圖。

具體實施方式

下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為報道的微生物學常規(guī)操作方法。所用試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實施例1：

從水虻腸道分離和鑒定粘質沙雷氏菌bsfl-6

申請人采用含40mg/l四環(huán)素的lb培養(yǎng)基，從轉化含四環(huán)素污染物料的水虻腸道研磨液中分離得到一株粘質沙雷氏菌bsfl-6，產(chǎn)紅色色素，該菌株已于2017年2月28日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)bsfl-6，保藏編號：cctccno：m2017073，地址：中國武漢武漢大學。粘質沙雷氏菌bsfl-6的生理生化特性和培養(yǎng)特性如表1所示。

表1粘質沙雷氏菌bsfl-6的生理生化特性和培養(yǎng)特性

“+”為陽性，“-”為陰性。

實施例2：

粘質沙雷氏菌bsfl-6的離體培養(yǎng)：

將粘質沙雷氏菌bsfl-6在平板上劃線活化，取平板上單菌落接種到裝100ml有l(wèi)b培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度為28℃、搖床轉速180rpm、培養(yǎng)時間12h，得到粘質沙雷氏菌bsfl-6發(fā)酵菌懸液(本發(fā)明或簡稱bsfl-6菌懸液)，該菌懸液的有效菌濃度為10⁸cfu/ml(od600值1.5)。

實施例3：

粘質沙雷氏菌bsfl-6的體外降解四環(huán)素：

將500μlbsfl-6菌懸液(有效菌濃度是10⁸cfu/ml)分別接種至裝有200ml含20、40、80和160mg/l四環(huán)素的lb培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度為28℃、搖床轉速180rpm、培養(yǎng)時間96h，檢測內容及結果如下：

1)檢測其生長曲線，結果如圖1所示，隨著四環(huán)素濃度的增高，粘質沙雷氏菌bsfl-6的適應期逐漸延長，但在適應期之后即進入對數(shù)生長期，并在進入對數(shù)生長期后的24小時內達到10⁸cfu/ml(od600值1.5)；即使在160mg/l四環(huán)素的濃度條件下，粘質沙雷氏菌bsfl-6均能耐受生長，說明其對高濃度的四環(huán)素有很好的耐受作用。

2)檢測其培養(yǎng)基中的四環(huán)素濃度變化，至72h時，含20、40、80和160mg/l四環(huán)素的培養(yǎng)基中四環(huán)素降解率分別為：29.9±0.8％，42.1±0.5％，57.3±1.2％，61.7±0.9％。

實施例4：

粘質沙雷氏菌bsfl-6在水虻體內促進水虻轉化四環(huán)素的應用：

本實施例所用的水虻為亮斑扁角水虻武漢品系。

1)將含40mg/l四環(huán)素的無菌人工物料(固含量50g，含水率65％)裝入無菌三角瓶中，成為物料三角瓶；

2)實驗設置3組，每組3個平行：

其一，在物料三角瓶中接種1mlbsfl-6菌懸液(有效菌濃度是10⁸cfu/ml)以及100頭無菌水虻幼蟲(不含腸道微生物)，標記為bsfl-6回接處理組；

其二，在物料三角瓶中接入100頭無菌水虻幼蟲(不含腸道微生物)，標記為無菌水虻處理組；

其三，在物料三角瓶中接種1mlbsfl-6菌懸液(有效菌濃度是10⁸cfu/ml)，標記為bsfl-6離體處理組；

3)將以上3個實驗組置于28℃培養(yǎng)箱，保持通風及無菌環(huán)境，培養(yǎng)12d，取初始物料及12d的各組物料，測試其四環(huán)素含量，計算各組四環(huán)素的降解率，同時測定水虻重量；

4)實驗結果如圖2所示，bsfl-6回接處理組的四環(huán)素降解率為59.6±7.9％，要顯著高于無菌水虻處理組(其降解率為38.2±7.3％)和bsfl-6離體處理組(其降解率為30.8±3.2％)近兩倍，說明粘質沙雷氏菌bsfl-6可以有效幫助水虻提高其四環(huán)素的降解效果，并且其與水虻共同處理的效果要優(yōu)于離體處理的效果；12d時bsfl-6回接處理組的水虻鮮重為185±6mg/條，比較于正常水虻同等條件培養(yǎng)12d的鮮重170±6mg/條的數(shù)據(jù)，結果說明bsfl-6回接處理有利于水虻自身的生長增重，因此，bsfl-6是水虻生長和降解四環(huán)素的腸道益生菌。