一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體及其制備方法和應(yīng)用。它是在GenBank登錄號為KF451925.1的堿性α-淀粉酶基因Amy703基礎(chǔ)上，缺失其N端669個核苷酸(223個氨基酸)，得到堿性α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建成基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到高熱穩(wěn)定性高比酶活的堿性α-淀粉酶突變體N-Amy703。突變體比酶活提高到170.15U/mg，是突變前的40倍；其在50℃的t1/2為28min，比突變前的t1/2提高了近4倍。同時其最適反應(yīng)溫度提高了10℃。本發(fā)明提供的N-Amy703酶學(xué)性質(zhì)有大幅度改善，更適用于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α -淀粉酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]α -淀粉酶（EC 3. 2. I. I)屬于糖苷水解酶13家族（GH13)，能催化水解淀粉及相關(guān)多聚物內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，分布于植物、動物及微生物中。α-淀粉酶因能水解淀粉及相關(guān)多聚物產(chǎn)生α異頭物的單糖或寡糖，或通過轉(zhuǎn)糖苷作用形成α糖苷鍵，是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并且是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的商品化酶，占全球酶制劑市場份額的25%?33%，尤其是酸性淀粉酶已廣泛應(yīng)用于淀粉原料液化、青貯飼料、白酒釀造、烘焙等工業(yè)化生產(chǎn)中。此外，在堿性溶液中表現(xiàn)出最佳活性的堿性α-淀粉酶可應(yīng)用于造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性，以及作為洗滌添加劑去除淀粉類污漬，作用日益突出。
[0003]由于在高溫下反應(yīng)具有減少微生物污染、增加底物溶解度及降低粘度等優(yōu)點，工業(yè)生產(chǎn)過程一般要求在高溫下進(jìn)行。同時，比酶活較高的酶轉(zhuǎn)化等量底物或產(chǎn)生等量產(chǎn)物所需要的酶更少，時間更短。
[0004]來自于Bacillus pseudofirmus 703的堿性α -淀粉酶Amy703 (氨基酸序列的GenBank登錄號為AGT54942)，其在pH 9. O，40°C時具有最高酶活，在堿性pH (8. O?10.5)條件下穩(wěn)定，在50°C處理20min后，殘余酶活為18. 5%，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、Ni柱純化后的比酶活為4. 93U/mgo但堿性α -淀粉酶Amy703的比酶活與熱穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高，以滿足工業(yè)生產(chǎn)提高效率節(jié)約能源的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是利用基因技術(shù)改造GenBank登錄號為AGT54942的堿性α -淀粉酶，提高其比酶活、熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的更高要求。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。在GenBank登錄號為KF451925. I的堿性α -淀粉酶基因Amy703，其對應(yīng)的氨基酸序列收錄號為AGT54942的基礎(chǔ)上，設(shè)計引物（FP和RP)進(jìn)行PCR，獲得缺失N端669個核苷酸的α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示；
[0007]所述引物為：FP:5’CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3’
[0008]RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’。
[0009]本發(fā)明的重組堿性α -淀粉酶Amy703的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：
[0010]I)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆得到GenBank登錄號為KF451925. I的堿性α -淀粉酶基因Amy703。
[0011 ] 2)將Amy703基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上，得到重組載體pET28a-Amy703 ；
[0012]3)設(shè)計缺失Amy703基因N端669個核苷酸的突變引物FP和RP，以重組載體pET28a-Amy703 為模板，進(jìn)行 PCR ；
[0013]FP: 5 ’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3’
[0014]RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’
[0015]PCR 反應(yīng)體系：10XEx Taq buffer, 5 μ I ；dNTP (2. 5mM), 5 μ I ；突變引物FP (10 μ Μ)，2 μ I ;突變引物 RP (10 μ Μ)，2 μ I ;Ex Taq, O. 3 μ I ;模板，I μ I ;加 ddH20 至50 μ Io
[0016]空白對照：將以上體系中的DNA模板換成ddH20，其他不變。
[0017]PCR擴(kuò)增體系：94°C，5min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，2min 15s，25 個循環(huán)；72°C，7min ；12°C, ；
[0018]4)將步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物用0. 7%的瓊脂糖凝膠回收后，連接T載體pMD18_T，通過測序驗證，得到堿性α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示;
[0019]5)將N_Amy703基因片段用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切，酶切體系為：BamH I ,0. 5 μ I ；Xho I，O. 5 μ I ;10XK buffer，5 μ I ;PCR 回收產(chǎn)物，30 μ 1，加 ddH20 至50 μ I，37°C處理2h后，用O. 7 %的瓊脂糖凝膠回收，與經(jīng)過同樣方式處理后的載體pET28a在16°C酶連2h，酶連體系為：酶切片段，1.2μ1 ;酶切載體，O. 3μ1 Solution I，I. 5 μ I。酶連產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD克隆感受態(tài)細(xì)胞中，挑選兩個轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序得到N端669個核苷酸缺失的重組載體pET28a-N-Amy703 ；
[0020]6)將步驟5)獲得的重組載體pET28a-N-Amy703轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到產(chǎn)堿性 α -淀粉酶 N-Amy703 的重組菌株 BL21 (DE3) -pET28a-N_Amy703 ；
[0021]7)將菌株BL21 (DE3) -pET28a-N-Amy703按照常規(guī)的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白方法，獲得重組蛋白N-Amy703，分析堿性α -淀粉酶突變體N_Amy703的酶學(xué)性質(zhì)。
[0022]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L。
[0023]本發(fā)明通過PCR方法缺失Amy703基因的N端669個核苷酸得到N_Amy703，并將其連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD感受態(tài)中，篩選到重組載體pET28a-N-Amy703 (圖I)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、破菌、純化獲得堿性α -淀粉酶突變體N-Amy703 (圖2)，對N_Amy703進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其在50°C處理20min后，殘余酶活從原始酶Amy703的18. 5%提高到72. 2% (圖4)。同時，比酶活從原始酶Amy703的4. 93U/mg，提高到170. 15U/mg，提高了近40倍。突變體N_Amy703最適反應(yīng)溫度和最適pH分別從Amy703的40°C ,pH 9.0提高到50°C，pH 9. 5。這為堿性α -淀粉酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0024]淀粉酶酶活力（U)定義方法：在最適反應(yīng)條件下，I分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化生成I微摩爾產(chǎn)物所需的酶量為一個活力單位（U)。
[0025]檢測堿性α -淀粉酶比酶活（U/mg)的定義方法：原始酶（Amy703)與突變體(N-Amy703)通過相同方式純化后（Ni柱純化），每毫克純化蛋白所具有的酶活力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖l:(a)目的基因的擴(kuò)增。M ： λ-EcoTH I digest DNA Marker ; I :PCR 擴(kuò)增條帶；
[0027](b)重組質(zhì)粒檢測。M:A-EcoT14 I digest DNA Marker ；I :重組質(zhì)粒酶切條帶。
[0028]圖2 ：SDS-PAGE電泳檢測純化后的堿性α -淀粉酶突變體。M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I :純化的堿性α-淀粉酶突變體條帶。
[0029]圖3 :原始酶Amy703的熱穩(wěn)定性：將純化后的酶在不同溫度下處理20min后，測定殘余酶活。
[0030]圖4 :突變體N-Amy703的熱穩(wěn)定性：將純化后的酶在不同溫度下處理20min后，測定殘余酶活。

【具體實施方式】
[0031]實施例I
[0032]I)采用PCR方法克隆得到GenBank登錄號為KF451925. I的堿性α -淀粉酶基因Amy703。將Amy703基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上，得到重組載體pET28a-Amy703 ；
[0033]2)以重組載體pET28a-Amy703為模板，使用突變引物FP和RP進(jìn)行PCR ；
[0034]FP: 5? CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC 3，
[0035]RP:5’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC 3’
[0036]PCR 反應(yīng)體系：10 X Pyrobest buffer, 5 μ I ；dNTP (2. 5mM)，5 μ I ;突變引物FP(10yM),2yl ;突變引物 RP (10 μ Μ)，2 μ I ；Pyrobest, O. 3 μ I ;模板，Ιμ? ;加 ddH20 至50 μ Io空白對照：將以上體系中的DNA模板換成ddH20，其他不變。
[0037]PCR擴(kuò)增體系：94°C,5min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，2min 15s，25 個循環(huán)；72°C,7min ；12°C, ；
[0038]3)將步驟2)獲得的PCR產(chǎn)物用0. 7%的瓊脂糖凝膠回收后，連接T載體pMD18_T，通過測序驗證，得到堿性α-淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。N-Amy703基因片段用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切，酶切體系為：BamH I，O. 5 μ I ；Xho I，0· 5 μ I ；10ΧΚ buffer, 5 μ I ;PCR 回收產(chǎn)物，30 μ 1，加 ddH20至 50 μ 1,37°C處理2h后，用O. 7 %的瓊脂糖凝膠回收，與經(jīng)過同樣方式處理后的載體pET28a在16 °C酶連2h，酶連體系為：酶切片段，1.2μ1 ;酶切載體，O. 3μ1 Solution I，I. 5 μ I。酶連產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD (Invitrogen公司）克隆感受態(tài)細(xì)胞中，挑選兩個轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序得到N端669個核苷酸缺失的重組載體pET28a-N-Amy703 ；
[0039]4)將步驟3)獲得的重組載體pET28a-N-Amy703轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到產(chǎn)堿性α -淀粉酶突變體N-Amy703的重組菌株BL21 (DE3)-pET28a-N_Amy703 ；
[0040]實施例2堿性α -淀粉酶突變體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0041]將實施例I的重組菌株BL21 (DE3) -pET28a-N_Amy703接種到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltl= O. 8，加入IPTG至終濃度為O. 5mM，18°C、200rpm條件下誘導(dǎo)12h。離心收集菌體，超聲波破菌，離心去上清，過Ni柱純化，用超濾管濃縮，得到純化后的堿性α -淀粉酶突變體蛋白，SDS-PAGE檢測。
[0042]實施例3堿性α -淀粉酶突變體的酶活測定
[0043]α -淀粉酶的酶活測定方法：將純化后的蛋白稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取50 μ I稀釋酶液，加到500 μ I提前預(yù)熱的可溶性淀粉底物中，在指定溫度下反應(yīng)15min，沸水浴5min終止反應(yīng)，加800 μ I DNS溶液，沸水浴lOmin，冷卻后，在540nm波長處測定吸光值?？瞻讓φ諡榉兴r加入50 μ I酶液。以在最適反應(yīng)條件下，每分鐘生產(chǎn)I μ mo I/L還原糖所需的酶量作為一個酶活力單位（U)。
[0044]經(jīng)實驗測定，淀粉酶突變體N-Amy703在50 °C處理20min后，殘余酶活從原始酶Amy703的18. 5 %提高到72. 2 %。同時，比酶活從原始酶Amy703的4. 93U/mg，提高到170. 15U/mg，提高了近 40 倍。
【權(quán)利要求】
1.一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α-淀粉酶突變體N-Amy703，其特征在于在GenBank登錄號為KF451925.1的堿性α -淀粉酶基因Amy703，其對應(yīng)的氨基酸序列收錄號為AGT54942的基礎(chǔ)上，設(shè)計引物FP、RP進(jìn)行PCR，獲得缺失N端669個核苷酸的α -淀粉酶突變體基因N-Amy703，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； 所述引物為:FP:5’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC3’
RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC3’。
2.一種熱穩(wěn)定性及比酶活提高的堿性α -淀粉酶突變體構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆得到堿性α-淀粉酶基因Amy703 ; 2)將步驟I)獲得的堿性α-淀粉酶基因Amy703連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a上，得到重組載體pET28a-Amy703 ； 3)設(shè)計缺失Amy703基因N端669個核苷酸的突變引物FP和RP，以重組載體pET28a-Amy703 為模板進(jìn)行 PCR，
FP: 5 ’ CGCGGATCCAATGTCTCTCACAACTTTAACCACAACC3’
RP: 5 ’ CCGCTCGAGTTATTTCTGACCTCGCTTGTCACTC3’ 4)將步驟3)獲得的PCR產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖凝膠回收后，連接到T載體pMD18-T，通過測序驗證，得到權(quán)利要求1)所述的堿性α -淀粉酶突變體基因N-Amy703 ; 5)將N-Amy703基因片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xho I雙酶切，酶切體系為:BamHI，0.5 μ I ；Xho I，0.5 μ I ；10ΧΚ buffer, 5 μ I ；PCR 回收產(chǎn)物，30 μ 1，加 ddH20 至 50 μ 1，37°C處理2h后，用0.7%的瓊脂糖凝膠回收，與經(jīng)過同樣方式處理后的載體pET28a在16°C酶連2h，酶連體系為:酶切片段，1.2μ1 ;酶切載體，0.3μ1 ；Solut1n I，1.5μ1，酶連產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD克隆感受態(tài)細(xì)胞中，挑選兩個轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序得到N端669個核苷酸缺失的重組載體pET28a-N-Amy703 ； 6)將步驟5)獲得的重組載體pET28a-N-Amy703轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到產(chǎn)堿性α -淀粉酶突變體 N-Amy703 的重組菌株 BL21 (DE3)-pET28a-N_Amy703 ； 7)將菌株BL21(DE3)-pET28a-N-Amy703按照常規(guī)的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白方法，獲得重組蛋白N-Amy703，分析堿性α -淀粉酶N_Amy703的酶學(xué)性質(zhì)。
【文檔編號】C12N15/70GK104498453SQ201410852880
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】張桂敏, 盧爭輝, 馬延和 申請人:湖北大學(xué)