本發(fā)明屬于辣木籽深加工領域，具體涉及一種從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法。
背景技術：
人的每個細胞每天大約可受到自由基103－104次的攻擊。而當體內的氧化增強系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡向氧化增強方向變化時，就會造成氧化脅迫（亦稱氧化應激）。當細胞處于氧化應激態(tài)時，自由基會與機體內脂類、糖類、蛋白質、dna等，發(fā)生各種氧化反應，引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化傷害。在正常情況下，人體具有多層次的抗氧化防御系統(tǒng)，嚴格控制著體內自由基的氧化效應，以維持體內環(huán)境的相對穩(wěn)定?？寡趸烙到y(tǒng)由兩類物質構成：一類是能捕獲自由基的酶系，如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等；另一類是具還原能力的抗氧化物質，如維生素e、維生素c及其他抗氧化物質等。這些物質攝入不足，就會使機體捕獲自由基的能力下降，從而導致自由基在體內的堆積，造成機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機體的衰老、疲勞并誘發(fā)阿爾茨海默氏癥，老齡化進程，白內障，急性肝毒性，心血管疾病，動脈硬化，腎炎，糖尿病，風濕病，炎癥過程，dna損傷所致癌變等。
肽類物質是眾多研究者公認的安全性較高的一類抗氧化劑。肽的抗氧化活性與其氨基酸的組成及排列順序、疏水性、空間體積大小及酸堿性等有關：（1）肽的抗氧化活性主要是由于其序列中tyr、trp、cys或met等具有供質子或供電子能力的氨基酸殘基存在；（2）肽序列中的疏水性氨基酸如leu、pro、phe及val對肽的抗氧化活性具有重要貢獻；（3）肽序列中的酸性氨基酸殘基對肽的抗氧化活性起到關鍵作用。
辣木，是辣木科辣木屬的植物，原產于印度北部的喜馬拉雅山地區(qū)，廣泛種植在亞洲和非洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，辣木共有14個種，印度傳統(tǒng)辣木（moringaoleiferalam.）生長快，分布廣，是栽培面積最大、研究最多的辣木種。我國對辣木的引種種植和開發(fā)研究主要集中在云南、廣西、廣東、福建、貴州、臺灣等省份。2012年，辣木葉被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準作為新資源食品。辣木全身都是寶，其葉片、花朵、種子及嫩芽、嫩莖、根等均可食用，是藥食同源的植物。印度和非洲國家常用辣木來治療高血壓、糖尿病、心血管疾病、風濕、關節(jié)炎等高發(fā)疾病。辣木籽中含有豐富的油脂以及蛋白質，是優(yōu)質的蛋白質來源。辣木籽蛋白含有較豐富的供質子或供電子能力的氨基酸包括：tyr、met、cys；較豐富的疏水性氨基酸包括：leu、pro、phe及val；以及豐富的酸性氨基酸：glu。因此，采用酶法可以制備得到具有強抗氧化活性的辣木籽肽。辣木籽肽可作為高效的抗氧化劑用于食品工業(yè)，具有較強的社會與經濟效益。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法。該方法通過高溫蒸煮、高壓均質、堿法提取的前處理方法，通過蛋白酶酶解、離心去油、分級醇沉、大孔樹脂富集處理方法，提取得到辣木籽蛋白肽。
本發(fā)明方法得到的辣木籽蛋白肽中，蛋白質含量>90%，水分含量<8%，orac值>1450μmoltroloxequiv/g。
本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)。
一種從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法，采用高溫蒸煮、高壓均質、堿法提取、酶解、分級醇沉、大孔樹脂富集聯(lián)合處理，具體包括如下步驟：
（1）高溫蒸煮：將新鮮辣木籽烘干后去殼、粉碎，過篩，得到的辣木籽粉進行高溫蒸煮；
（2）高壓均質：取經高溫蒸煮后的辣木籽粉，加入去離子水，高速剪切后過膠體磨，再進行高壓均質，得到辣木籽勻漿液；
（3）減法提取：在辣木籽粉勻漿液中加入氫氧化鈉，調節(jié)ph值，加熱提取后，冷卻至室溫，得到混懸液；
（4）酶解：調節(jié)混懸液的ph值，加入蛋白酶進行酶解后，滅酶，離心分離，去除上層油脂，取上清液；
（5）分級醇沉：將步驟（4）得到的上清液進行初步真空濃縮后，加入預冷后的無水乙醇，勻速攪拌后，離心，得到上清液a；將上清液a再次真空濃縮后，加入預冷后的無水乙醇，勻速攪拌，離心，在得到的沉淀物中加入去離子水溶解后，真空濃縮，冷凍干燥，得到粉末；
（6）大孔樹脂富集：將步驟（5）得到的粉末溶于水中，過大孔樹脂柱，采用乙醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥，得到辣木籽蛋白肽。
進一步地，步驟（1）中，所述過篩是過60目篩。
進一步地，步驟（1）中，所述高溫蒸煮是在100-120℃的條件下蒸煮30-50min。
進一步地，步驟（2）中，高溫蒸煮后的辣木籽粉與去離子水的料液比為1:6~8g/ml。
進一步地，步驟（2）中，所述高速剪切是在8000~10000rpm的速率剪切10~20分鐘。
進一步地，步驟（2）中，所述過膠體磨的次數(shù)為2~3次。
進一步地，步驟（2）中，所述高壓均質的壓力為20~40mpa。
進一步地，步驟（2）中，所述過高壓均質的次數(shù)為2~3次。
進一步地，步驟（3）中，所述調節(jié)ph值是調節(jié)值ph值為7.0~9.0。
進一步地，步驟（3）中，所述加熱提取是在40~60℃的條件下提取40~60min。
進一步地，步驟（4）中，調節(jié)混懸液的ph值至7.0~8.0。
進一步地，步驟（4）中，所述蛋白酶的加入量為辣木籽質量的1~3%。
進一步地，步驟（4）中，所述蛋白酶為胰酶和堿性蛋白酶，胰酶的加入量占總酶量的40-60%，堿性蛋白酶的加入量占總酶量的40-60%。
更進一步地，步驟（4）中，所述堿性蛋白酶包括型號為ns37071的蛋白酶。
進一步地，步驟（4）中，所述酶解是在50~56℃的條件下酶解18~24小時。
進一步地，步驟（4）中，所述滅酶是在90~96℃滅酶30-50min。
進一步地，步驟（4）中，所述離心分離是8000~10000g離心20-30min。
進一步地，步驟（5）中，所述初步真空濃縮和再次真空濃縮均為濃縮至固形物含量為30~40%。
進一步地，步驟（5）中，所述預冷的無水乙醇為預冷至4~8℃的無水乙醇。
進一步地，步驟（5）中，步驟（4）得到的上清液濃縮后，預冷的無水乙醇的加入量為使體系中乙醇含量達到10~20wt%。
進一步地，步驟（5）中，所述勻速攪拌均為室溫下200-400r/min轉速攪拌4~6h。
進一步地，步驟（5）中，所述離心均為4000~6000g離心20~30min。
進一步地，步驟（5）中，上清液a濃縮后，預冷的無水乙醇的加入量為使體系中乙醇含量達到40~60wt%。
進一步地，步驟（5）中，沉淀物中加入去離子水的量為沉淀物濕重的8~10倍。
進一步地，步驟（6）中，所述粉末溶于水后的濃度為100-200mg/ml。
進一步地，步驟（6）中，所述大孔樹脂為安伯萊特xad-16大孔樹脂。
進一步地，步驟（6）中，所述梯度洗脫為采用0-60vol%乙醇溶液梯度洗脫，具體為：1-3個柱體積采用100vol%水洗脫，4-6個柱體積采用100-50vol%水、0-50vol%乙醇洗脫，6-7個柱體積采用50-40vol%水、50-60vol%乙醇洗脫，7-8個柱體積采用40vol%水、60vol%乙醇洗脫，收集60vol%乙醇洗脫液。
進一步地，提取得到的辣木籽蛋白肽中，蛋白質含量>90%，水分含量<8%，且具有強抗氧化性，orac值>1450μmoltroloxequiv/g。
提取得到的辣木籽蛋白肽可用于藥品、保健品和食品中。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：
（1）本發(fā)明方法通過高溫蒸煮、高壓均質、堿法提取的前處理方法，聯(lián)合蛋白酶酶解、離心去油處理方法，實現(xiàn)控制酶解，提高了原料利用率，釋放抗氧化肽，最大程度地提取辣木籽蛋白肽；
（2）本發(fā)明方法采用分級醇沉、大孔樹脂富集處理方法去除抗氧化性較弱的組分，高效富集抗氧化性較強的組分；
（3）本發(fā)明工藝操作簡單、生產成本低、無污染，所得辣木籽蛋白肽中，抗氧化肽蛋白含量>90%，水分含量<8%，orac值>1450μmoltroloxequiv/g，可用于藥品、保健品和食品中。
具體實施方式
本發(fā)明用下列實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實施例。
以下實施例中，氧自由基吸收能力（oyxgenradicalabsorbancecapacity，orac）測定方法如下：
在96孔熒光板各微孔中分別加入20μl待測樣品（將各酶解產物用75mmol/l磷酸鹽緩沖液做適當稀釋，每個樣品待測液濃度為0.05mg/ml），然后添加60μl70nmol/l熒光素，在37℃下預置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入120μl40mmol/laaph(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride)啟動反應，并將微孔板置于酶標儀中在37℃下以激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長538nm進行連續(xù)測定，每1min測定1次各孔熒光強度，測定時間設定在熒光衰減呈基線后為止，樣品的orac值越高則其抗氧化能力越強。
實施例1
從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法，包括以下步驟：
（1）高溫蒸煮：將新鮮辣木籽烘干后去殼粉碎，過60目篩，在100℃條件下高溫蒸煮辣木籽粉30min；
（2）高壓均質：取經高溫蒸煮后的辣木籽粉，按照料液比1:6g/ml加入去離子水，以8000rpm的速率剪切10分鐘，過膠體磨2次，得辣木籽勻漿液，20mpa高壓均質2次；
（3）堿法提取：在辣木籽粉勻漿液中加入氫氧化鈉，調節(jié)ph值至7.0，在溫度為40℃的條件下，提取40min，冷卻至室溫，得混懸液；
（4）酶解：調節(jié)混懸液ph值至7.0，加入質量為辣木籽質量1%的蛋白酶（胰酶和ns37071蛋白酶的質量比為2:3），在50℃的條件下酶解18小時，90℃滅酶30min，8000g離心20min；分離，去除上層油脂，所得上清液為富含辣木籽蛋白肽的酶解液；
（5）分級醇沉：真空濃縮辣木籽酶解液至固形物含量30%，加入預冷至4℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到10%（按質量計），200r/min室溫勻速攪拌4h后，4000g離心20min，得到上清液；將上清液濃縮至固形物含量30%，加入預冷至4℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到40%（按質量計），200r/min室溫勻速攪拌4h后，4000g離心20min，得到沉淀；加入沉淀濕重8倍的去離子水，溶解后，真空濃縮，冷凍干燥，得到粉末；
（6）大孔樹脂富集：將粉末溶于水中，濃度為100mg/ml，過安伯萊特xad-16大孔樹脂柱，采用0-60vol%乙醇溶液進行8個柱體積梯度洗脫，流速為2ml/min，具體為：1-5個柱體積采用100vol%水、0vol%乙醇洗脫；6-7個柱體積采用50vol%水、50vol%乙醇洗脫；7-8個柱體積采用40vol%水、60vol%乙醇洗脫；收集60%（v/v）乙醇洗脫液，冷凍干燥，得具有強抗氧化活性的辣木籽蛋白肽1。
所得蛋白肽1中，蛋白質含量為92%，水分含量為7%，orac值為1455μmoltroloxequiv/g。
實施例2
從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法，包括以下步驟：
（1）高溫蒸煮：將新鮮辣木籽烘干后去殼粉碎，過60目篩，在105℃條件下高溫蒸煮辣木籽粉40min；
（2）高壓均質：取經高溫蒸煮后的辣木籽粉，按照料液比1:7g/ml加入去離子水，以9000rpm的速率剪切15分鐘，過膠體磨3次，得辣木籽勻漿液，30mpa高壓均質3次；
（3）堿法提?。涸诶蹦咀逊蹌驖{液中加入氫氧化鈉，調節(jié)ph值至8.0，在溫度為50℃的條件下，提取50min，冷卻至室溫，得混懸液；
（4）酶解：調節(jié)混懸液ph值至7.5，加入質量為辣木籽質量2%的蛋白酶（胰酶和ns37071蛋白酶的質量比為1:1），在53℃的條件下酶解21小時，93℃滅酶40min，9000g離心25min，分離，去除上層油脂，所得上清液為富含辣木籽蛋白肽的酶解液；
（5）分級醇沉：真空濃縮辣木籽酶解液至固形物含量35%，加入預冷至6℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到15%（按質量計），300r/min室溫勻速攪拌5h后，5000g離心25min，得到上清液；將上清液濃縮至固形物含量35%，加入預冷至6℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到50%（按質量計），300r/min室溫勻速攪拌5h后，5000g離心25min，得到沉淀；加入沉淀濕重9倍的去離子水，溶解后，真空濃縮，冷凍干燥，得到粉末；
（6）大孔樹脂富集：將粉末溶于水中，濃度為150mg/ml，過安伯萊特xad-16大孔樹脂柱，采用0-60vol%乙醇溶液進行8個柱體積梯度洗脫，流速為2ml/min，具體為：1-3個柱體積采用100vol%水洗脫；4-6個柱體積采用75vol%水、25vol%乙醇洗脫；6-7個柱體積采用45vol%水、55vol%乙醇洗脫；7-8個柱體積采用40vol%水、60vol%乙醇洗脫；收集60%（v/v）乙醇洗脫液，冷凍干燥，得具有強抗氧化活性的辣木籽蛋白肽2。
所得蛋白肽2中，蛋白質含量為91%，水分含量為7%，orac值為1500μmoltroloxequiv/g。
實施例3
從辣木籽中提取強抗氧化蛋白肽的方法，包括以下步驟：
（1）高溫蒸煮：將新鮮辣木籽烘干后去殼粉碎，過60目篩，在110℃條件下高溫蒸煮辣木籽粉50min；
（2）高壓均質：取經高溫蒸煮后的辣木籽粉，按照料液比1:8g/ml加入去離子水，以10000rpm的速率剪切20分鐘，過膠體磨2次，得辣木籽勻漿液，40mpa高壓均質2次；
（3）堿法提?。涸诶蹦咀逊蹌驖{液中加入氫氧化鈉，調節(jié)ph值至9.0，在溫度為60℃的條件下，提取60min，冷卻至室溫，得混懸液；
（4）酶解：調節(jié)混懸液ph值至8.0，加入質量為辣木籽質量3%的蛋白酶（胰酶和ns37071蛋白酶的質量比為3:2），在56℃的條件下酶解24小時，96℃滅酶50min，10000g離心30min，分離，去除上層油脂，所得上清液為富含辣木籽蛋白肽的酶解液；
（5）分級醇沉：真空濃縮辣木籽酶解液至固形物含量40%，加入預冷至8℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到20%（按質量計），400r/min室溫勻速攪拌6h后，6000g離心30min，得到上清液；將上清液濃縮至固形物含量40%，加入預冷至8℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到60%（按質量計），400r/min室溫勻速攪拌6h后，6000g離心30min，得到沉淀；加入沉淀濕重10倍的去離子水，溶解后，真空濃縮，冷凍干燥，得到粉末；
（6）大孔樹脂富集：將粉末溶于水中，濃度為200mg/ml，過安伯萊特xad-16大孔樹脂柱，采用0-60vol%乙醇溶液進行8個柱體積梯度洗脫，具體為：1-3個柱體積采用100vol%水洗脫；4-6個柱體積采用50vol%水、50vol%乙醇洗脫；7-8個柱體積采用40vol%水、60vol%乙醇洗脫。收集60%（v/v）乙醇洗脫液，冷凍干燥，得具有強抗氧化活性的辣木籽蛋白肽3。
所得蛋白肽3中，蛋白質含量為93%，水分含量為6%，orac值為1550μmoltroloxequiv/g。
對比例1
從辣木籽中提取辣木籽蛋白肽的方法，包括以下步驟：
（1）高溫蒸煮：將新鮮辣木籽烘干后去殼粉碎，過60目篩，在110℃條件下高溫蒸煮辣木籽粉50min；
（2）高壓均質：取經高溫蒸煮后的辣木籽粉，按照料液比1:8g/ml加入去離子水，以10000rpm的速率剪切20分鐘，過膠體磨2次，得辣木籽勻漿液，40mpa高壓均質2次；
（3）堿法提?。涸诶蹦咀逊蹌驖{液中加入氫氧化鈉，調節(jié)ph值至9.0，在溫度為60℃的條件下，提取60min，冷卻至室溫，得混懸液；
（4）酶解：調節(jié)混懸液ph值至8.0，加入質量為辣木籽質量3%的蛋白酶（胰酶和ns37071蛋白酶的質量比為3:2），在55℃的條件下酶解24小時，95℃滅酶50min，8000g離心30min，分離，去除上層油脂，所得上清液為富含辣木籽蛋白肽的酶解液；
（5）分級醇沉：真空濃縮辣木籽酶解液至固形物含量40%，加入預冷至4℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到20%（按質量計），400r/min室溫勻速攪拌4h后，4000g離心20min，得到上清液；將上清液濃縮至固形物含量40%，加入預冷至4℃的無水乙醇，使得體系中乙醇含量達到60%（按質量計），400r/min室溫勻速攪拌4h后，4000g離心20min，得到沉淀；加入沉淀濕重10倍的去離子水，溶解后，真空濃縮，冷凍干燥，得到辣木籽蛋白肽4。
所得蛋白肽4中，蛋白質含量為68%，水分含量為7%，orac值為540μmoltroloxequiv/g。
由實施例1~3和對比例1可知，實施例與對比例最大區(qū)別在于：實施例使用了大孔樹脂富集技術，通過實施例1~3制備的辣木籽肽蛋白含量高、抗氧化能力強，辣木籽肽蛋白含量以及orac值分別對比例的1.35倍和2.70~2.87倍。
本發(fā)明通過高溫蒸煮、高壓均質、堿法提取、酶解、分級醇沉、大孔樹脂富集去雜聯(lián)合處理，可獲得蛋白含量高、抗氧化活性強的辣木籽肽，可廣泛應用于食品領域中。