本發(fā)明涉及熒光檢測領域，具體而言，涉及一種金納米簇與銅鋅超氧化物歧化酶的用途及試劑盒。

背景技術：

銅鋅超氧化物歧化酶(sod)是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。研究表明，銅鋅超氧化物歧化酶具有抗衰老的功效。按照其所含金屬輔基的不同，銅鋅超氧化物歧化酶可以分為銅鋅超氧化物歧化酶、錳銅鋅超氧化物歧化酶、以及鐵銅鋅超氧化物歧化酶等。銅鋅超氧化物歧化酶是真核生物酶，主要存在于真核細胞的細胞漿中，也是研究最多，結(jié)構(gòu)最清楚的一類銅鋅超氧化物歧化酶。對銅鋅超氧化物歧化酶的含量進行檢測，在抗衰老及腫瘤預防方面起著重要的作用，并且日益受到重視。

目前檢測銅鋅超氧化物歧化酶的方法主要有黃嘌呤氧化酶細胞色素c法、鄰苯三酚法、羥胺法、化學發(fā)光法等。以黃嘌呤氧化酶-細胞色素c法為例，在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成尿酸，同時產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基將氧化型細胞色素c還原為還原型細胞色素c，后者在550nm有最大吸收。存在銅鋅超氧化物歧化酶時，超氧陰離子自由基被催化而歧化，細胞色素c還原反應速率降低，根據(jù)細胞色素c在加入銅鋅超氧化物歧化酶前后被超氧陰離子自由基還原的速率變化，即可測定銅鋅超氧化物歧化酶的活性。

現(xiàn)有測定銅鋅超氧化物歧化酶的方法，多是通過其對超氧陰離子自由基的清除反應，改變發(fā)色團或者發(fā)光試劑的濃度，來間接對其活性進行定量。這些方法技術繁瑣、步驟多、成本高，且超氧陰離子自由基的壽命很短，通過銅鋅超氧化物歧化酶清除超氧陰離子自由基的測定方法，容易受到超氧陰離子濃度不準確的影響，從而影響其準確度。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種金納米簇和銅鋅超氧化物歧化酶的用途，本發(fā)明的研究結(jié)果顯示，銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇所產(chǎn)生的熒光具有淬滅效應，其為后期金納米簇的廣泛應用、以及銅鋅超氧化物歧化酶的準確檢測提供了新的思路。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶的定性檢測和定量檢測，且檢測的特異性強、靈敏度高。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于測定銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒。利用這種試劑盒，可方便的對銅鋅超氧化物歧化酶進行定性檢測和定量檢測。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供了銅鋅超氧化物歧化酶在對金納米簇的熒光淬滅效應中的應用，即：

本發(fā)明提供了一種銅鋅超氧化物歧化酶在淬滅金納米簇產(chǎn)生的熒光中的用途。

本發(fā)明提供了一種銅鋅超氧化物歧化酶在抗金納米簇的熒光干擾中的用途。

第二方面，本發(fā)明提供了金納米簇在檢測銅鋅超氧化物歧化酶中的應用，即：

本發(fā)明提供了一種金納米簇在銅鋅超氧化物歧化酶的檢測中的用途。

本發(fā)明提供了一種金納米簇用于制備銅鋅超氧化物歧化酶的檢測試劑盒中的用途。

第三方面，本發(fā)明提供了一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，即：

一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，其包括：將待測溶液與金納米簇混合。

第四方面，本發(fā)明提供了一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測試劑盒，即：

一種用于檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，其包括：金納米簇。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

發(fā)明人在對金納米簇的研究中發(fā)現(xiàn)，金納米簇所產(chǎn)生的熒光能夠被銅鋅超氧化物歧化酶淬滅，且銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅能力與其濃度呈正相關。這就為金納米簇的應用拓寬了新方向，比如在某些需要去除或避免金納米簇的熒光干擾的情況下，可以選用銅鋅超氧化物歧化酶將其熒光淬滅；或者將金納米簇應用到生物溶液的分析檢測中，如用金納米簇檢測銅鋅超氧化物歧化酶。

本實施方式提供的這種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法和試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶的定性檢測和定量檢測，且檢測的特異性強、靈敏度高，能夠有效解決現(xiàn)有技術中由于超氧陰離子自由基壽命較短，導致測定銅鋅超氧化物歧化酶的準確度低的問題。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本公開內(nèi)容的實施例1中的標準工作曲線圖；

圖2為本公開內(nèi)容的實施例2中制備的金納米簇的透射電鏡掃描圖；

圖3為本公開內(nèi)容的實驗例1中銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅效應的實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本實施方式提供的金納米簇和銅鋅超氧化物歧化酶的用途進行具體說明：

金納米簇，是由幾個至上百個金原子組成。由于金納米簇的尺寸與電子的費米波長相近，導致其具有離散的電子態(tài)和熒光發(fā)光等類似分子的性質(zhì)；并且因其超小的尺寸、良好的生物相容性和卓越的光學穩(wěn)定性，在納米技術領域中展現(xiàn)了良好的應用前景。

發(fā)明人在對金納米簇的研究中發(fā)現(xiàn)，金納米簇所產(chǎn)生的熒光能夠被銅鋅超氧化物歧化酶淬滅，即銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇具有熒光淬滅效應，且銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅能力與其濃度呈正相關。

這就為金納米簇的應用拓寬了新方向，比如，本實施方式提供的一種銅鋅超氧化物歧化酶在抗金納米簇的熒光干擾中的用途。

在某些需要去除或避免金納米簇的熒光干擾的情況下，可以選用銅鋅超氧化物歧化酶將其熒光淬滅。更為具體的，利用銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅效應，在含有金納米簇的溶液體系中加入適當濃度的銅鋅超氧化物歧化酶以減弱金納米簇的熒光，以此來實現(xiàn)金納米簇更為廣泛的用途。

拓寬金納米簇的應用，還體現(xiàn)在將金納米簇應用到生物溶液的分析檢測中，如用金納米簇檢測銅鋅超氧化物歧化酶、或者制備用來檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒。

采用金納米簇檢測銅鋅超氧化物歧化酶的原理是：銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光產(chǎn)生淬滅的現(xiàn)象，通過測定金納米簇的熒光，便可得到銅鋅超氧化物歧化酶的活性或含量。更為具體的，當待測溶液中含有銅鋅超氧化物歧化酶時，當待測溶液與金納米簇混合時，銅鋅超氧化物歧化酶會使金納米簇的熒光減弱，即可實現(xiàn)對銅鋅超氧化物歧化酶的定量檢測。此外，由于銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅效應與銅鋅超氧化物歧化酶的濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關，因此可實現(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶的定量檢測。

本實施方式基于上述原理，提供了一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，包括：

將待測溶液與金納米簇混合。

當待測溶液與金納米簇混合時，如果待測溶液中含有銅鋅超氧化物歧化酶，則混合液中金納米簇的熒光會減弱；且銅鋅超氧化物歧化酶的濃度越大，混合液中金納米簇的熒光會減弱的趨勢越大。

進一步的，將待測溶液與金納米簇混合后，還包括檢測所得混合液的熒光發(fā)射光譜的步驟，以得到混合液中金納米簇的熒光強度。

可選擇的，在測定所得混合液的熒光發(fā)射光譜時，選用的激發(fā)波長為350～380nm，或為355～375nm，或360～370nm，或363～368nm。更為具體的為，在激發(fā)波長為365nm下，測定所得混合液的熒光發(fā)射光譜。

可選擇的，金納米簇的熒光強度為金納米簇在最大發(fā)射波長處的熒光強度。最大發(fā)射波長處的熒光強度最大、且相對其他發(fā)射波長處的熒光更加穩(wěn)定，從而使得檢測結(jié)果的準確度更高。

在本實施方式中采用標準曲線法，建立混合液的熒光強度與銅鋅超氧化物歧化酶的濃度之間的線性關系，來實現(xiàn)對銅鋅超氧化物歧化酶的定量檢測。該方法的操作簡單、可實施性強，能夠?qū)崿F(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶的定量測定。

這種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)銅鋅超氧化物歧化酶的定性檢測和定量檢測，且檢測的特異性強、靈敏度高，能夠有效解決現(xiàn)有技術中由于超氧陰離子自由基壽命較短，導致測定銅鋅超氧化物歧化酶的準確度低的問題。

本實施方式中所用到的金納米簇可以直接購買，或者采用現(xiàn)有技術中的方法進行合成?？蛇x擇的，金納米簇的粒徑為2～4nm，或者為3nm。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，金納米簇的粒徑在上述范圍內(nèi)時，熒光效應更強、且更加穩(wěn)定。

在某些具體的實施例中，金納米簇的制備方法包括：將氯金酸與多肽混合，并于65～75℃下反應20～28h，其中所述多肽中含有至少一個硫原子。

其中，多肽中至少含有一個硫原子，即可以是一個、兩個或者更多。更為具體的，形成多肽的氨基酸中至少有一個甲硫氨酸、或至少有一個半胱氨酸、或至少有一個胱氨酸；當然，也可以是同時含有甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸中任意兩個、或三者都含有。

可選擇的，多肽為短肽，例如可以是二肽、三肽或者四肽。更為具體的，在某些實施例中，多肽為谷胱甘肽。

合成金納米簇時的反應溫度為65～75℃，或者為67～73℃；或者為69～71℃；或者為69℃、70℃、71℃。

合成金納米簇時的反應時間為20～28h，或者為22～26h；或者為23～25h；或者為24h。

本實施方式還提供的一種檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，該試劑盒包括金納米簇。利用該試劑盒，可方便的對銅鋅超氧化物歧化酶進行定性檢測和定量檢測，且特異性強、靈敏度高。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述：

實施例1

本實施例提供一種用于檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，其包括：金納米簇。

本實施例提供一種銅鋅超氧化物歧化酶的檢測方法，其包括以下步驟：

a.配制含有銅鋅超氧化物歧化酶的標準溶液(銅鋅超氧化物歧化酶的濃度分別為5u/ml、10u/ml、30u/ml、50u/ml)。

b.分別將不同濃度的標準溶液與50μg/ml的金納米簇混合均勻，得到多個第一混合液；同時，將50μg/ml的金納米簇與水混合均勻，得到空白對照液，其中，水的體積與標準溶液體積一致。

c.設置激發(fā)波長為365nm，分別測定空白對照液、以及多個第一混合液的熒光發(fā)射光譜，并測定最大發(fā)射波長(610nm)處的熒光強度。

d.以銅鋅超氧化物歧化酶的濃度為橫坐標，以所測得的熒光強度為縱坐標進行線性擬合，得到標準工作曲線，如圖1所示，其線性方程為：y＝-2.51x+169.34

e.將含有銅鋅超氧化物歧化酶的待測溶液與50μg/ml的金納米簇混合均勻，得到第二混合液。采用步驟c的方法，測定第二混合液的熒光強度，并將其帶入所得到的標準工作曲線，計算得到待測溶液中銅鋅超氧化物歧化酶的濃度。

實施例2

本實施例提供了一種用于檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，其包括：金納米簇。

其中，金納米簇的制備方法包括：

將5ml、4mmhaucl4和5ml、4mm的谷胱甘肽溶液混合，在室溫下攪拌5min，然后油浴升溫到70℃，反應24h，將得到的金納米簇通過3000分子量的超濾離心管進行提純，即得，其透射電鏡掃描圖如圖2所示。

實施例3

本實施例提供了一種用于檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，其包括：金納米簇。

其中，金納米簇的制備方法包括：

將5ml、4mmhaucl4和5ml、4mm的二肽(由甘氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-半胱氨酸形成)溶液混合，在室溫下攪拌5min，然后油浴升溫到75℃，反應20h，將得到的金納米簇通過3000分子量的超濾離心管進行提純，即得。

實施例4

本實施例提供了一種用于檢測銅鋅超氧化物歧化酶的試劑盒，其包括：金納米簇。

其中，金納米簇的制備方法包括：

將5ml、4mmhaucl4和5ml、4mm的三肽(由甘氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸形成)溶液混合，在室溫下攪拌5min，然后油浴升溫到65℃，反應28h，將得到的金納米簇通過3000分子量的超濾離心管進行提純，即得。

實驗例1

本實驗例對本發(fā)明實施方式中提供的一種銅鋅超氧化物歧化酶在淬滅金納米簇產(chǎn)生的熒光中的用途進行說明。

將金納米簇溶液與銅鋅超氧化物歧化酶混合均勻，放置在365nm紫外燈下觀察，同時以金納米簇溶液作為空白對照。結(jié)果如圖3中的插圖所示。

金納米簇溶液在365nm紫外燈下呈橘紅色(如圖3中a管溶液所示)，再將金納米簇溶液與銅鋅超氧化物歧化酶混合后，所得混合液在365nm紫外燈下呈無色(如圖3中b管溶液所示)，由此可見，銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇具有熒光淬滅效應。

設置激發(fā)波長為365nm，分別測定上述a管溶液(金納米簇溶液)和b管溶液(金納米簇溶液與銅鋅超氧化物歧化酶的混合液)的熒光發(fā)射光譜。

結(jié)果如圖3所示，其中，a曲線是金納米簇溶液的發(fā)光光譜，即淬滅前的發(fā)射光譜；b曲線是金納米簇溶液與銅鋅超氧化物歧化酶的混合液的發(fā)射光譜，即淬滅后的發(fā)光光譜。由圖3可見，銅鋅超氧化物歧化酶能夠使金納米簇在最大發(fā)射波長600nm處的發(fā)光強度由165銳減到40左右，由此說明，銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇具有熒光淬滅效應。

綜上所述，在本實施方式中，發(fā)明人在對金納米簇的研究中發(fā)現(xiàn)，金納米簇所產(chǎn)生的熒光能夠被銅鋅超氧化物歧化酶淬滅，且銅鋅超氧化物歧化酶對金納米簇的熒光淬滅能力與其濃度呈正相關。這就為金納米簇的應用拓寬了新方向，比如在某些需要去除或避免金納米簇的熒光干擾的情況下，可以選用銅鋅超氧化物歧化酶將其熒光淬滅；或者將金納米簇應用到生物溶液的分析檢測中，如用金納米簇檢測銅鋅超氧化物歧化酶。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。