本發(fā)明屬于水稻抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高水稻品種穗瘟室內(nèi)鑒定準(zhǔn)確性的方法。

背景技術(shù)：

水稻是我國(guó)乃至世界的重要糧食作物。稻瘟病(pyriculariaoryzaecav.)是我國(guó)主要水稻病害之一，與紋枯病、白葉枯并稱(chēng)水稻三大病害，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)安全。稻瘟病在水稻整個(gè)生育階段皆可發(fā)生，主要危害水稻葉片、莖稈、穗部。按危害時(shí)期及部位的不同，主要可分為苗瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟、支梗瘟和谷粒瘟。其中因穗瘟直接影響水稻產(chǎn)量而最為受到重視。目前防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施依然是抗病品種的選育與利用，而水稻品種抗稻瘟病鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)及前提。

根據(jù)病原的來(lái)源及環(huán)境因素的控制情況，目前水稻品種抗稻瘟病鑒定主要分為自然誘發(fā)鑒定和室內(nèi)人工接種鑒定兩大類(lèi)。自然誘發(fā)鑒定是指利用自然環(huán)境中已有的病原在自然的溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響下對(duì)水稻品種造成侵染，從而通過(guò)水稻品種的發(fā)病表現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定。自然誘發(fā)鑒定具有鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，病原對(duì)水稻品種致病壓力持久穩(wěn)定，單次可以鑒定大量樣本，鑒定結(jié)果直接反映水稻生產(chǎn)狀況等優(yōu)點(diǎn)，但是存在著鑒定結(jié)果嚴(yán)重依賴(lài)自然氣候條件，易受極端天氣影響，一年只能進(jìn)行一次鑒定試驗(yàn)，病原種群背景復(fù)雜，鑒定重復(fù)性差等缺點(diǎn)。室內(nèi)人工接種鑒定是指病原和環(huán)境因素全部或部分受人為控制，從而對(duì)水稻品種進(jìn)行抗病鑒定。室內(nèi)人工接種鑒定具有病原背景清晰，環(huán)境條件可調(diào)，鑒定試驗(yàn)安排靈活不受農(nóng)時(shí)限制，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但目前廣為采用的室內(nèi)人工接種鑒定存在著對(duì)試驗(yàn)操作人員要求高，病原對(duì)水稻品種致病壓力難以持久穩(wěn)定等缺點(diǎn)。而且目前室內(nèi)人工接種鑒定主要是進(jìn)行苗期葉瘟鑒定，水稻生產(chǎn)中最受重視的穗瘟鑒定因其試驗(yàn)難度大反而較少被采用。穗瘟室內(nèi)人工鑒定難度主要在于水稻穗瘟易感生育期在孕穗期至破口期，此期間若僅依靠有限次數(shù)的人工噴霧接種，稻瘟病病原很難從植株表面侵入。目前進(jìn)行穗瘟室內(nèi)人工鑒定主要是通過(guò)在水稻葉鞘內(nèi)進(jìn)行人工注射稻瘟病孢子懸浮液來(lái)誘發(fā)穗瘟，但是該方法會(huì)對(duì)植株造成傷口，會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果造成影響，而且人工成本太高，難以進(jìn)行大規(guī)模鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是以室內(nèi)人工接種鑒定為基礎(chǔ)結(jié)合自然誘發(fā)鑒定的特點(diǎn)，通過(guò)引入誘發(fā)品種，并分期播種，使鑒定材料長(zhǎng)期處于持續(xù)穩(wěn)定致病壓力之下，從而簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，不會(huì)人為對(duì)鑒定品種植株造成傷口，病原背景清晰，環(huán)境條件可調(diào)，鑒定時(shí)間安排靈活，重復(fù)性高，使大規(guī)模穗頸瘟室內(nèi)人工鑒定成為可能。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種提高水稻品種穗瘟室內(nèi)人工接種鑒定準(zhǔn)確性的方法，步驟包括：

(1)育苗：根據(jù)水稻品種的數(shù)量確定試驗(yàn)小區(qū)大小，小區(qū)為矩形，每個(gè)品種1行，每行10株，行間距約10cm，育苗土采用稻田土，小區(qū)四周條播麗江新團(tuán)黑谷作為誘發(fā)品種；

(2)菌株活化：將保存的單孢菌株活化于番茄燕麥培養(yǎng)基的平板中，28℃黑暗培養(yǎng)3d～5d；

(3)誘導(dǎo)產(chǎn)孢：小麥浸泡至吸水充分，用錐形瓶分裝，每瓶分裝小麥150g，濕熱滅菌45min，自然冷卻，挑取步驟(2)中菌落邊緣健壯菌絲，轉(zhuǎn)接至錐形瓶中，28℃黑暗培養(yǎng)10d，期間每24h搖動(dòng)一次，使菌絲均勻生長(zhǎng)，當(dāng)菌絲布滿(mǎn)培養(yǎng)基質(zhì)后，將培養(yǎng)基質(zhì)倒出用清水搓洗，去掉表面氣生菌絲，瀝干，平鋪于潔凈的淺盤(pán)中，蓋上一層潔凈紗布，放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，黑光燈照射，溫度設(shè)置為28℃，使小麥粒表面大量產(chǎn)生分生孢子；

(4)孢子懸浮液配制：用蒸餾水配制0.05％的吐溫-80溶液，用該溶液震蕩搓洗小麥粒，過(guò)濾，配制成孢子懸浮液，每個(gè)菌株配制500ml菌液；

(5)噴霧接種：待秧苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，用透明塑料薄膜將小區(qū)四周隔離，隔離高度為2m，頂部用無(wú)紡布覆蓋，用微型噴霧器將步驟(4)中配置好的菌液均勻噴施于小區(qū)內(nèi)水稻葉片上，蓋上遮陽(yáng)網(wǎng)，20-30℃保溫保濕3d，然后取下遮陽(yáng)網(wǎng)；

(6)誘發(fā)品種育苗及小區(qū)病原的培育：誘發(fā)品種采用麗江新團(tuán)黑谷，育苗容器使用可移動(dòng)的條狀育苗盤(pán)，第1期誘發(fā)品種與鑒定品種同時(shí)播種，當(dāng)?shù)?期誘發(fā)品種長(zhǎng)到三葉一心期時(shí)，播種第2期誘發(fā)品種，前一期誘發(fā)種移至外側(cè)，后一期誘發(fā)品種置于內(nèi)側(cè)；當(dāng)?shù)?期誘發(fā)品種長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，播種第3期誘發(fā)品種，前兩期誘發(fā)種移至外側(cè)，第3期誘發(fā)品種置于內(nèi)側(cè)；依次類(lèi)推，直至鑒定品種成熟；

(7)鑒定結(jié)果調(diào)查：調(diào)查記載方法參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程nyt2646-2014》。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述番茄燕麥培養(yǎng)基：番茄汁150ml、燕麥40g、瓊脂20g、加水至1000ml。

進(jìn)一步的，步驟(3)中，所述淺盤(pán)內(nèi)平鋪一張濕潤(rùn)的吸水紙。

進(jìn)一步的，步驟(6)中，所述誘發(fā)品種分期播種，培育小區(qū)病原。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明是以室內(nèi)人工接種鑒定為基礎(chǔ)結(jié)合自然誘發(fā)鑒定的特點(diǎn)，通過(guò)引入誘發(fā)品種，并分期播種，使鑒定材料長(zhǎng)期處于持續(xù)穩(wěn)定致病壓力之下，從而簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，不會(huì)人為對(duì)鑒定品種植株造成傷口，病原背景清晰，環(huán)境條件可調(diào)，鑒定時(shí)間安排靈活，重復(fù)性高，使大規(guī)模穗瘟室內(nèi)人工鑒定成為可能。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明試驗(yàn)田布局分布圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

一種提高水稻品種穗瘟室內(nèi)人工鑒定準(zhǔn)確性的方法，包括以下步驟：

(1)育苗：根據(jù)水稻品種的數(shù)量確定試驗(yàn)小區(qū)大小，小區(qū)為矩形，每個(gè)品種1行，每行10株，行間距約10cm，育苗土采用稻田土。小區(qū)四周條播麗江新團(tuán)黑谷作為誘發(fā)品種。小區(qū)布局如圖1所示。

(2)菌株活化：將保存的單孢菌株活化于番茄燕麥培養(yǎng)基(番茄汁150ml，燕麥40g，瓊脂20g，加水至1000ml)的平板中，28℃黑暗培養(yǎng)3d～5d。

(3)誘導(dǎo)產(chǎn)孢：小麥浸泡至吸水充分，用錐形瓶分裝，每瓶分裝小麥150g，濕熱滅菌45min，自然冷卻。挑取步驟(2)中菌落邊緣健壯菌絲，轉(zhuǎn)接至錐形瓶中，28℃黑暗培養(yǎng)10d，期間每24h搖動(dòng)一次，使菌絲均勻生長(zhǎng)。當(dāng)菌絲布滿(mǎn)培養(yǎng)基質(zhì)后，將培養(yǎng)基質(zhì)倒出用清水搓洗，去掉表面氣生菌絲，瀝干，平鋪于潔凈的淺盤(pán)中，淺盤(pán)內(nèi)預(yù)先平鋪一張干凈濕潤(rùn)的吸水紙，鋪放的厚度要薄，盡量不要堆疊。蓋上一層潔凈紗布，放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，黑光燈照射，溫度設(shè)置為28℃，3d后小麥粒表面即有大量分生孢子產(chǎn)生。

(4)孢子懸浮液配制：用蒸餾水配制0.05％的吐溫-80溶液，用該溶液震蕩搓洗小麥粒，過(guò)濾，配制成孢子懸浮液，每個(gè)菌株配制500ml菌液。

(5)噴霧接種：待秧苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，用透明塑料薄膜將小區(qū)四周隔離，隔離高度為2m，頂部用無(wú)紡布覆蓋。用微型噴霧器將步驟(4)中配置好的菌液均勻噴施于小區(qū)內(nèi)水稻葉片上，蓋上遮陽(yáng)網(wǎng)，20℃～30℃保溫保濕3d，然后取下遮陽(yáng)網(wǎng)。

(6)誘發(fā)品種育苗及小區(qū)病原的培育：誘發(fā)品種采用麗江新團(tuán)黑谷，育苗容器使用可移動(dòng)的條狀育苗盤(pán)，第1期誘發(fā)品種與鑒定品種同時(shí)播種，當(dāng)?shù)?期誘發(fā)品種長(zhǎng)到三葉一心期時(shí)，播種第2期誘發(fā)品種，前一期誘發(fā)種移至外側(cè)，后一期誘發(fā)品種置于內(nèi)側(cè)；當(dāng)?shù)?期誘發(fā)品種長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，播種第3期誘發(fā)品種，前兩期誘發(fā)種移至外側(cè)，第3期誘發(fā)品種置于內(nèi)側(cè)；依次類(lèi)推，直至鑒定品種成熟；

(7)鑒定結(jié)果調(diào)查：調(diào)查記載方法參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程nyt2646-2014》。每株水稻的病級(jí)以發(fā)病最重的單穗為準(zhǔn)，損失率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。0級(jí)-3級(jí)定為“r”，5級(jí)-9級(jí)定為“s”。每個(gè)品種有3株以上(含3株)表現(xiàn)為“s”則該品種記為感病，否則記為抗病。

表1水稻穗瘟單穗損失率分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

注：本表參照nyt2646-2014中表a.3編制。