本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種調(diào)控植物貯藏蛋白分選的蛋白質(zhì)gmgpa3及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆是我國(guó)重要的油料和蛋白作物。大豆貯藏蛋白占大豆籽粒蛋白含量的70％-80％，是食用蛋白的重要來源，同時(shí)也是幼苗萌發(fā)所需的氨基酸和氮的來源。與其他植物比較，大豆貯藏蛋白中氨基酸組成比較齊全，尤其富含賴氨酸。美國(guó)食品和藥品管理局(fda)的健康通告顯示，每天食用含有25g大豆蛋白的食品，有助減少心血管發(fā)病率。大豆籽粒貯藏蛋白主要在發(fā)育的大豆子葉中合成，并以蛋白體形式沉積。以11s蛋白為例，首先11s貯藏蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上以前體的形式合成，之后經(jīng)由高爾基體，分選進(jìn)入蛋白貯藏液泡，并在液泡加工酶的作用下切割成成熟的酸堿亞基。此途徑的正常轉(zhuǎn)運(yùn)是貯藏蛋白能否正常沉積的關(guān)鍵，對(duì)大豆的蛋白品質(zhì)形成至關(guān)重要。但有關(guān)該途徑的分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理在大豆中尚無報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)的名稱為gmgpa3，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。其中，序列2由498個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述d)中，“同源性”包括與本發(fā)明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與gmgpa3蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：a1)編碼gmgpa3蛋白質(zhì)的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述材料中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1所示的cdna分子或dna分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼gmgpa3蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼gmgpa3蛋白質(zhì)的cdna分子或基因組dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列1由1497個(gè)核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼gmgpa3的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼gmgpa3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼gmgpa3且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，a2)所述的含有編碼gmgpa3的核酸分子的表達(dá)盒(gmgpa3基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)gmgpa3的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)gmgpa3轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止gmgpa3轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35s：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動(dòng)子(pin2)或lap啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pf128(cn101063139b(中國(guó)專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述gmgpa3基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供gmgpa3蛋白質(zhì)或上述生物材料的新用途。本發(fā)明提供了gmgpa3蛋白質(zhì)或上述生物材料在調(diào)控植物貯藏蛋白分選中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物貯藏蛋白分選體現(xiàn)在降低植物谷蛋白前體強(qiáng)度和/或降低植物谷蛋白前體含量和/或提高植物谷蛋白酸性亞基含量和/或提高植物谷蛋白堿性亞基含量。所述谷蛋白前體強(qiáng)度是指谷蛋白前體含量與谷蛋白酸性亞基含量的比值。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述生物材料在培育貯藏蛋白分選正常的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種培育貯藏蛋白分選正常的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育貯藏蛋白分選正常的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提高受體植物中g(shù)mgpa3蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的貯藏蛋白分選正常。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的貯藏蛋白分選正常體現(xiàn)在如下(1)-(4)中任一種：(1)轉(zhuǎn)基因植物的谷蛋白前體強(qiáng)度低于受體植物；(2)轉(zhuǎn)基因植物的谷蛋白前體含量低于受體植物；(3)轉(zhuǎn)基因植物的谷蛋白酸性亞基含量高于受體植物；(4)轉(zhuǎn)基因植物的谷蛋白堿性亞基含量高于受體植物。上述方法中，所述提高受體植物中g(shù)mgpa3蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性的方法為在受體植物中過表達(dá)gmgpa3蛋白質(zhì)。上述方法中，所述過表達(dá)的方法為將所述gmgpa3蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物。所述gmgpa3蛋白質(zhì)的編碼基因是通過pcambia1300-221-gmgpa3重組載體導(dǎo)入受體植物，pcambia1300-221-gmgpa3重組載體為在載體pcambia1300-221的xbai識(shí)別序列間插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的dna分子，且保持載體pcambia1300-221的其他序列不變得到的載體。pcambia1300-221-gmgpa3重組載體表達(dá)序列2所示的gmgpa3蛋白，gmgpa3蛋白的表達(dá)由35s啟動(dòng)子啟動(dòng)。上述方法中，所述gmgpa3蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻，所述水稻具體為水稻突變體gpa3。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的貯藏蛋白分選相關(guān)蛋白gmgpa3及其編碼基因可以使成熟谷蛋白含量降低突變體gpa3中成熟谷蛋白含量上升至正常水平：水稻突變體gpa3與t0代轉(zhuǎn)空載體植株種子中谷蛋白前體含量基本無差異，成熟的酸性和堿性亞基含量基本無差異，水稻突變體gpa3中谷蛋白前體強(qiáng)度分別為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株不同株系l1、l2和l3的2.93倍、1.79倍和3.09倍，t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株不同株系l1、l2和l3的成熟酸性亞基和堿性亞基強(qiáng)度均有提升。t0代轉(zhuǎn)空載體植株與水稻突變體gpa3的種子外觀基本相同，t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株不同株系的種子出現(xiàn)了透明現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的貯藏蛋白分選相關(guān)蛋白gmgpa3及其編碼基因可以用來培育一種貯藏蛋白分選正常的轉(zhuǎn)基因植物。附圖說明圖1為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的鑒定結(jié)果。其中，泳道1為陰性對(duì)照，泳道2為陽(yáng)性對(duì)照，泳道3-7均為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株。圖2為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的種子外觀及橫切面。其中，baifengb表示白豐b，gpa3表示水稻突變體gpa3，l1-l3分別為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的不同株系。圖3為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的種子蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果。其中，baifengb表示白豐b，gpa3表示水稻突變體gpa3，l1-l3分別為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的不同株系。圖4為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的種子中的谷蛋白前體強(qiáng)度結(jié)果。其中，baifengb表示白豐b，gpa3表示水稻突變體gpa3，l1-l3分別為t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株的不同株系。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的載體pcambia1300-221記載于如下文獻(xiàn)：xiao-baoyingetal.,rna-dependentrnapolymerase1fromnicotianatabacumsuppressesrnasilencingandenhancesviralinfectioninnicotianabenthamiana.plantcell.2010，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的水稻突變體gpa3記載于如下文獻(xiàn)：renetal.,glutelinprecursoraccumulation3encodesaregulatorofpost-golgivesiculartrafficessentialforvacuolarproteinsortinginriceendosperm.[j].plantcell,2014,26:410-25.，公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。水稻突變體gpa3是從白豐b的60co輻射誘變突變體庫(kù)中篩選獲得，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)gpa3的gpa3基因(os03g0835800)的第11個(gè)外顯子中有一個(gè)由c到t的單堿基替換，導(dǎo)致氨基酸翻譯提前終止，形成286個(gè)氨基酸的殘基。gpa3突變體的貯藏蛋白分選異常，57kda谷蛋白前體異常積累，伴隨著酸堿亞基含量降低，gpa3突變體成熟籽粒表現(xiàn)為皺縮和粉質(zhì)，且千粒重降低了30％左右。下述實(shí)施例中的大豆williams82記載于如下文獻(xiàn)：haun,w.j.,hyten,d.l.,xu,w.w.,gerhardt,d.j.,albert,t.j.,richmond,t.,jeddeloh,j.a.,jia,g.f.,springer,n.m.,vance,c.p.&stupar,r.m.(2011).thecompositionandoriginsofgenomicvariationamongindividualsofthesoybeanreferencecultivarwilliams82.plantphysiology155,645-655.，國(guó)家種質(zhì)庫(kù)編號(hào)為i2a12645，統(tǒng)一編號(hào)為wdd00587。公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。實(shí)施例1、大豆蛋白gmgpa3基因的克隆1、cdna的獲得提取大豆williams82的總rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。2、pcr擴(kuò)增以步驟1獲得的cdna為模板，采用引物gmgpa3-cdna-f/r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：gmgpa3-cdna-f:5'-ttgaaacgaaacaagaagaatgc-3'；gmgpa3-cdna-r:5'-cgtaggttcaaacatggcataaa-3'。3、測(cè)序?qū)cr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果：pcr擴(kuò)增得到大小為1497bp的條帶，其具有序列表中序列1所示的核苷酸，將序列1所示的基因命名為gmgpa3基因，gmgpa3基因編碼的蛋白命名為gmgpa3，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。實(shí)施例2、大豆蛋白gmgpa3在調(diào)控植物貯藏蛋白分選中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)gmgpa3植株的制備1、重組載體的制備在載體pcambia1300-221的xbai識(shí)別序列間插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的dna分子，且保持載體pcambia1300-221的其他序列不變，得到重組載體，并將該重組載體命名為pcambia1300-221-gmgpa3。pcambia1300-221-gmgpa3與pcambia1300-221的區(qū)別僅在于：pcambia1300-221-gmgpa3為在pcambia1300-221的xbai識(shí)別序列間插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的dna分子得到的重組載體。pcambia1300-221-gmgpa3重組載體表達(dá)序列2所示的gmgpa3蛋白，gmgpa3蛋白的表達(dá)由35s啟動(dòng)子啟動(dòng)。2、重組菌的制備分別將載體pcambia1300-221和pcambia1300-221-gmgpa3導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105菌株(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)中，分別得到的含有pcambia1300-221和pcambia1300-221-gmgpa3的重組農(nóng)桿菌，將其分別命名為eh-pcambia1300-221和eh-pcambia1300-221-gmgpa3。3、轉(zhuǎn)基因植物的制備利用步驟2獲得的重組菌eh-pcambia1300-221-gmgpa3進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，獲得t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株。具體步驟如下：(1)28℃培養(yǎng)eh-pcambia1300-221-gmgpa316小時(shí)，收集菌體，并稀釋到n6液體培養(yǎng)基(sigma公司，c1416)中至od600≈0.5，獲得菌液；(2)將培養(yǎng)至一個(gè)月的水稻突變體gpa3成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(n6固體培養(yǎng)基，sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；(3)將步驟(2)共培養(yǎng)后的愈傷組織接種在n6固體篩選培養(yǎng)基1(n6固體篩選培養(yǎng)基1為向n6固體培養(yǎng)基中加入潮霉素得到的潮霉素濃度為100mg/l的培養(yǎng)基)上24℃培養(yǎng)16天進(jìn)行第一次篩選；(4)挑取步驟(3)第一次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入上述n6固體篩選培養(yǎng)基1上24℃下培養(yǎng)進(jìn)行第二次篩選，每15天繼代一次；(5)挑取步驟(4)第二次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入n6固體篩選培養(yǎng)基2(n6固體篩選培養(yǎng)基2為向n6固體培養(yǎng)基中加入潮霉素得到的潮霉素濃度為50mg/l的培養(yǎng)基)上24℃下培養(yǎng)進(jìn)行第三次篩選，每15天繼代一次；(6)挑取步驟(5)得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入水稻分化培養(yǎng)基(北京西美杰科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為c167)上24℃下進(jìn)行分化，得到分化成苗的t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株。利用步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌eh-pcambia1300-221，按照上述步驟(1)-(6)中的方法，得到t0代轉(zhuǎn)空載體植株。4、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定對(duì)t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株進(jìn)行pcr鑒定，引物序列如下：5′-gaacattgccgcaccctagatg-3′；5′-atcccgaagcaacggtccaa-3′。并以pcambia1300-221-gmgpa3作為陽(yáng)性對(duì)照(圖1中泳道1)，水稻粳稻品種kitaake基因組dna作為陰性對(duì)照(圖1中泳道2)。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，t0代轉(zhuǎn)gmgpa3植株均含有目的基因gmgpa3基因(圖1中泳道3-7)。選取t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3用于下述表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。二、轉(zhuǎn)gmgpa3植株的表型檢測(cè)1、種子表型的觀察分別將步驟一獲得的t0代轉(zhuǎn)空載體植株、t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3以及白豐b(baifengb)、水稻突變體gpa3(gpa3)種植在試驗(yàn)田中，至種子成熟。種子成熟后，收取各植株種子并去殼，觀察種子外觀及橫切面。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，t0代轉(zhuǎn)空載體植株與水稻突變體gpa3的種子外觀基本相同，而t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3種子均出現(xiàn)了透明現(xiàn)象(圖2)，并且t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3的種子有不同程度的透明現(xiàn)象。與野生型白豐b(baifengb)種子的透明表型相比，gmgpa3可以恢復(fù)突變體gpa3的表型，說明gmgpa3具有調(diào)控貯藏蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。2、種子貯藏蛋白sds-page凝膠圖譜分析分別提取t0代轉(zhuǎn)空載體植株、t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3以及白豐b(baifengb)、水稻突變體gpa3(gpa3)的種子蛋白進(jìn)行sds-page檢測(cè)，根據(jù)蛋白電泳結(jié)果，利用軟件quantityone對(duì)谷蛋白前體、酸性亞基和堿性亞基進(jìn)行定量，并計(jì)算轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3以及白豐b(baifengb)和水稻突變體gpa3(gpa3)中谷蛋白前體強(qiáng)度。谷蛋白前體強(qiáng)度是指谷蛋白前體含量與谷蛋白酸性亞基含量的比值。上述種子蛋白提取及電泳方法如下：隨機(jī)挑取粒數(shù)去殼，研缽中磨成米粉，稱取25mg，加入700μl提取液(配方如表1所示)，混勻，50℃烘箱過夜，次日12，000rpm離心5min，吸取上清進(jìn)行sds-page檢測(cè)。電泳時(shí)，首先采用80v跑濃縮膠，待蛋白進(jìn)入分離膠之后，電壓升至120v，跑至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠底部時(shí)，從玻璃板中剝?nèi)∧z，考馬斯亮藍(lán)染色15min后，去除染色液，水漂洗剩余的染色液后，加入適量脫色液，脫色至可清晰分辨蛋白條帶后，bio-rad凝膠成像設(shè)備掃描。表1、sds-page制膠加樣表(一個(gè)電泳槽凝膠用量)凝膠貯液(ml)tris-hcl(ml)h2o(ml)10％sds(μl)temed(μl)10％ap(μl)15％分離膠14.8311.083.6629724.751247.5％濃縮膠3.354.994.99133.842084各株系中種子蛋白的sds-page檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。各株系中谷蛋白前體強(qiáng)度大小的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出：和水稻突變體gpa3種子中谷蛋白前體強(qiáng)度相比，t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3種子中谷蛋白前體強(qiáng)度明顯降低，水稻突變體gpa3種子中谷蛋白前體強(qiáng)度(110.03)分別為t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1(37.65)、l2(61.48)和l3(35.66)的2.93倍、1.79倍和3.09倍。和水稻突變體gpa3種子中成熟酸性亞基和堿性亞基強(qiáng)度相比，t0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)gmgpa3植株純合株系l1、l2和l3的成熟酸性亞基和堿性亞基強(qiáng)度均有提升。水稻突變體gpa3與t0代轉(zhuǎn)空載體植株種子中的谷蛋白前體含量基本無差異，成熟的酸性和堿性亞基含量基本無差異。上述結(jié)果說明：gmgpa3及其基因均可以使水稻突變體gpa3的貯藏蛋白分選恢復(fù)正常。序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所<120>一種調(diào)控植物貯藏蛋白分選的蛋白質(zhì)gmgpa3及其編碼基因與應(yīng)用<160>2<210>1<211>1497bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgcattactgggttcgagcttcttcttctgatttcgccggaacccatccccaacgtcgc60agtggtcattccgctgttaacatcgggaaatccaaggttgtcgtgttcggaggactcgtg120gataagaagtttctcagcgatatggctgtctatgatattgaggccaaacaatggtttcag180cctgagtgcactggaagtggttcagatgggcatgtgggtcctagctctcgggctttccat240gttgccgttgccattgattgtcatatgttcatttttggtggtcgccttgggagtcaaagg300ttgggggacttttgggttttggatactgatatatggcaatggtctgaactaactggcttc360ggtgacttgccttcaccacgagattttgctgcagcttcagcagttggaaaccgtaaaatt420gttatgtatggtggatgggatggaaaaaagtggttatctgatgtttatgtcttggataca480atatccctcgagtggatggagctctcagtttctggaacattgccgcaccctagatgtggg540catactgccacaatggtcgaaaaacggttacttgtttatggtggaagaggaggaggtgga600ccaattatgggcgatttatgggcgttgaagggcctcattgaagaagagaatgaagcacct660gggtggactcaattaaagcttccaggtcaagcaccttctccccgatgtggccatacagtg720acatccggaggacactatttgttgatgtttggagggcatgggactggtggatggttgagt780cgttatgatatctattataatgattgcattatattagacagagtttcagcacagtggaag840cggctctccataggcaatgaaccccctcctgctagagcataccactctatgtcaattatt900ggttcacggtatctgctaattggtggttttgatgggaaatcaacttatggtgatccctgg960tggttagtccctcaagaggacccaattgcaagtagattaactgcatctccacccagaaat1020attcctgaaagtaaggatgttacctcacttaatgatgattttcaacctcagttcaaggaa1080agccaaacagagaaatttcctttctctgaattgcaaagacgattgcaaatatcagtttcg1140gaatccaattctaggcttcatattgtaaatgagttggaagataaagagcttcttgagtta1200gcatcaagattagcaggtgaaaatgtttctacaaattcactgaaggcaattgaagcactt1260cgtgaacactggagaaagtctgaatcgaatatggttaaactcaaagagcttggaccgttg1320cttcgggattaccaacgtctaatatacaggcaatatctagaaaggagtgcatctgctcaa1380caacctggatttggtgaacaagtgatgcatcaactttaccatgtaaaaaatgctactcag1440ttgcgcatggatgatattccaaaacttttggcagagtacaaacagctacctatatga1497<210>2<211>498<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2methistyrtrpvalargalaserserseraspphealaglythrhis151015proglnargargserglyhisseralavalasnileglylysserlys202530valvalvalpheglyglyleuvalasplyslyspheleuseraspmet354045alavaltyraspileglualalysglntrppheglnproglucysthr505560glyserglyseraspglyhisvalglyproserserargalaphehis65707580valalavalalaileaspcyshismetpheilepheglyglyargleu859095glyserglnargleuglyaspphetrpvalleuaspthraspiletrp100105110glntrpsergluleuthrglypheglyaspleuproserproargasp115120125phealaalaalaseralavalglyasnarglysilevalmettyrgly130135140glytrpaspglylyslystrpleuseraspvaltyrvalleuaspthr145150155160ileserleuglutrpmetgluleuservalserglythrleuprohis165170175proargcysglyhisthralathrmetvalglulysargleuleuval180185190tyrglyglyargglyglyglyglyproilemetglyaspleutrpala195200205leulysglyleuilegluglugluasnglualaproglytrpthrgln210215220leulysleuproglyglnalaproserproargcysglyhisthrval225230235240thrserglyglyhistyrleuleumetpheglyglyhisglythrgly245250255glytrpleuserargtyraspiletyrtyrasnaspcysileileleu260265270aspargvalseralaglntrplysargleuserileglyasnglupro275280285proproalaargalatyrhissermetserileileglyserargtyr290295300leuleuileglyglypheaspglylysserthrtyrglyaspprotrp305310315320trpleuvalproglngluaspproilealaserargleuthralaser325330335proproargasnileprogluserlysaspvalthrserleuasnasp340345350asppheglnproglnphelysgluserglnthrglulyspheprophe355360365sergluleuglnargargleuglnileservalsergluserasnser370375380argleuhisilevalasngluleugluasplysgluleuleugluleu385390395400alaserargleualaglygluasnvalserthrasnserleulysala405410415ileglualaleuarggluhistrparglyssergluserasnmetval420425430lysleulysgluleuglyproleuleuargasptyrglnargleuile435440445tyrargglntyrleugluargseralaseralaglnglnproglyphe450455460glygluglnvalmethisglnleutyrhisvallysasnalathrgln465470475480leuargmetaspaspileprolysleuleualaglutyrlysglnleu485490495proile當(dāng)前第1頁(yè)12