本發(fā)明屬于中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅布麻花多糖、提取方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羅布麻（apocynumvenetuml）是夾竹桃科（apocynaceae）植物，俗稱野麻，又名“夾竹桃麻”、“茶花麻”、“茶棵子”等。羅布麻花性味甘、苦，微寒，具有平肝降壓，養(yǎng)心安神，清熱利水的功能。羅布麻花中主要含黃酮類和強(qiáng)心苷等，其有效成分具有降低血壓、血脂，強(qiáng)心利尿，平肝疏肝，抗炎，止咳平喘，抗過敏等功能。在新疆，當(dāng)?shù)鼐用裼闷浠ê腿~泡茶保健用。羅布麻花氣味芳香宜人,一直是維吾爾族傳統(tǒng)的降壓飲品。此外羅布麻花水煎服可治療頭暈，曬干后裝枕頭可以明目、降血壓。多糖是由10個以上的單糖及糖苷鍵相連接而成的高聚物。多糖不僅可以作為支持組織，能量來源，還參與生物合成反應(yīng)以及細(xì)胞間的識別、受精、胚胎形成、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、激素激活、細(xì)胞增殖、病毒和細(xì)菌的感染、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生命現(xiàn)象和生理過程。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外研究者對多糖的認(rèn)識進(jìn)一步加深。文獻(xiàn)檢索顯示：植物多糖具抗氧化、降血糖、降血脂、抗血栓、抑菌、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞等作用。藥理活性與化學(xué)成分密切相關(guān)，目前尚未見有羅布麻花多糖的結(jié)構(gòu)和體外溶栓(或纖溶)作用的相關(guān)報道，因此研究羅布麻花多糖，對于羅布麻的深度開發(fā)利用具有重要意義。

血液凝固簡稱凝血，是在內(nèi)源性或（和）外源性凝血途徑下產(chǎn)生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下產(chǎn)生凝血酶，最后凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，血液由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。凝血過程通常分為：①內(nèi)源性凝血途徑；②外源性凝血途徑；③共同凝血途徑。外源性凝血途徑是從組織因子暴露于血液而啟動，到因子x被激活的過程；臨床上以凝血酶原時間（pt）測定來反映外源性凝血途徑的狀況。內(nèi)源性凝血途徑是指從因子xii激活，到因子x激活的過程；臨床上以活化部分凝血活酶時間（aptt）來反映體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑的狀況。從因子x被激活至纖維蛋白形成，是內(nèi)、外源共同凝血途徑；主要包括凝血酶生成和纖維蛋白形成兩個階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種羅布麻花多糖、提取方法及其在凝血方面的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種羅布麻花多糖的提取方法，其包括如下步驟：

1）羅布麻花先用石油醚脫脂，再用乙醇提取脂溶性組分，取濾渣加水于90±5℃進(jìn)行熱提，熱提后醇沉，取沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，冷凍干燥，然后用蒸餾水溶解，采用sevag法脫除蛋白，將得到的上清液透析、冷凍干燥得到粗多糖；

2）粗多糖經(jīng)離子交換色譜和凝膠滲透柱色譜純化后，得到四個多糖組分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3。

步驟1）具體為：將羅布麻花和石油醚混合后回流提取1－3次，每次回流提取1－3h，回流提取結(jié)束后過濾，濾渣晾干，加入70±5%乙醇于50±5℃加熱提取2－4次，每次加熱提取1－3h，加熱提取結(jié)束后過濾，濾渣晾干獲得脫脂羅布麻花，然后用蒸餾水于90±5℃熱提取3－4次，每次熱提取3－4h，熱提取結(jié)束后趁熱抽濾，濾液減壓濃縮獲得濃縮液，然后向濃縮液中加入乙醇使終濃度為70±5%，靜置，離心得沉淀。

步驟2）具體包括如下步驟：

a）將粗多糖用蒸餾水溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，上樣到deae-52色譜柱，依次用蒸餾水、0.1mol/l氯化鈉溶液和0.2mol/l氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測，測490nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰的多糖樣品，減壓濃縮，透析，冷凍干燥；其中，蒸餾水的洗脫峰為組分1，0.1mol/l氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2，0.2mol/l氯化鈉溶液的洗脫峰為組分3；

b）組分1用蒸餾水溶解，0.22μm微孔濾膜過濾，上樣到sephadexg-100色譜柱，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測，測其在490nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，得到單一洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分命名為vp1；

c）組分2采用步驟b）同樣的方法進(jìn)行洗脫，得到兩組洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分分別命名為vp2a-i、vp2a-ii；

d）組分3采用步驟b）同樣的方法進(jìn)行洗脫，得到單一洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分命名為vp3；

羅布麻花多糖即為vp1或vp3。

采用上述提取方法得到的羅布麻花多糖vp1或vp3。

羅布麻花多糖組分vp1在制備促凝血藥物方面的應(yīng)用。

羅布麻花多糖組分vp3在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供具有活性多糖來源的植物羅布麻花，且從羅布麻花中提取獲得四個精制多糖組分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3，并對羅布麻花精制多糖的體外抗凝血效果進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果表明：羅布麻花精制多糖組分vp1具有良好的促凝血效果，且vp1促凝血效果優(yōu)于云南白藥，可見它可以單獨(dú)用于制備促凝血劑。羅布麻花精制多糖組分vp3則具有良好的抗凝血效果，且vp3抗凝血效果好于燈盞花素，可見其可以單獨(dú)用于制備抗凝血劑。

附圖說明

圖1為凝血機(jī)制圖；

圖2為經(jīng)deae-52色譜柱洗脫得到的羅布麻花多糖組分1、組分2和組分3的洗脫曲線圖；

圖3為經(jīng)sephadexg-100色譜柱洗脫得到的羅布麻花精制多糖組分vp1、vp2a-i、vp2a-ii和vp3的洗脫曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

羅布麻的干燥花于2015年7月采集于新疆阿克蘇地區(qū)。經(jīng)由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為夾竹桃科多年生宿根植物羅布麻(apocynumvenetuml.)干燥花。實(shí)施例中乙醇濃度如無特殊說明，均指的是體積濃度。

實(shí)施例1羅布麻花多糖的提取

一種羅布麻花多糖的提取方法，其包括如下步驟：

1）取陰干的羅布麻花770g，用2l石油醚在圓底燒瓶中60℃下回流提取2次，每次回流提取1h?；亓魈崛〗Y(jié)束后過濾，濾渣晾干，加入70%乙醇9l，于50℃加熱提取3次，每次加熱提取1h。加熱提取結(jié)束后過濾，濾渣晾干得脫脂羅布麻花479.7g。取全部脫脂羅布麻花，加10重量倍蒸餾水于90℃熱提取4次，每次熱提取4h。熱提取結(jié)束后趁熱抽濾，濾液減壓濃縮獲得濃縮液，然后向濃縮液中加入95%乙醇使終濃度為70%，靜置24h，離心得沉淀。取沉淀然后用無水乙醇，丙酮，無水乙醚依次洗滌兩次。冷凍干燥（在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行，-40℃真空冷凍干燥10-12h，下同），然后用蒸餾水溶解，采用sevag法脫除蛋白（具體為：將溶解有沉淀的蒸餾水與sevag試劑按5：1的體積比混合，震蕩、離心分層，將中間變性蛋白質(zhì)和下層有機(jī)溶劑除去，將上清液按上述步驟重復(fù)操作5-10次，直到無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)；sevag試劑為體積比5:1的氯仿、正丁醇混合液），將得到的上清液進(jìn)行透析（用透析袋在4℃下透析2天，透析袋截留分子量為8000－14000，每4h更換一次蒸餾水，下同）以除去小分子物質(zhì)，最后冷凍干燥，得到粗多糖58.58g；

2）將約250mg粗多糖溶解于15ml蒸餾水中并離心。取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，濾液上樣到deae-52色譜柱（2.6×40cm），依次用蒸餾水、0.1mol/l氯化鈉溶液和0.2mol/l氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫（恒流泵流速20r/min，用自動收集器收集洗脫液，每管8min，每管6ml），洗脫液采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀測波長490nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰的多糖樣品，減壓濃縮，透析（條件同上述步驟1），冷凍干燥；其中，蒸餾水的洗脫峰為組分1，0.1mol/l氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2，0.2mol/l氯化鈉溶液的洗脫峰為組分3；

3）組分1用蒸餾水溶解為濃度0.04g/ml的溶液，離心（tgl-16rg，5000r/min，15min），0.22μm微孔濾膜過濾，濾液上樣到sephadexg-100色譜柱（1.6×100cm），用蒸餾水進(jìn)行洗脫（恒流泵流速4r/min，用自動收集器收集洗脫液，每管40分鐘，每管6ml），采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測，測其在波長490nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，得到單一洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分命名為vp1；

4）組分2采用步驟3）同樣的方法進(jìn)行洗脫，得到兩組洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分分別命名為vp2a-i、vp2a-ii；

5）組分3采用步驟3）同樣的方法進(jìn)行洗脫，得到單一洗脫峰，減壓濃縮、冷凍干燥后得到的多糖組分命名為vp3；

羅布麻花多糖即為vp1或vp3。

實(shí)施例2羅布麻花多糖的抗凝血試驗(yàn)。

方法：家兔體外血漿凝血四項(xiàng)檢測。

儀器和材料：tgl-16gr高速臺式冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；hf6000-4半自動凝血分析儀（南方漢方醫(yī)療器械有限公司）；lrh-150生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；氯化鈉注射液；0.109mol/l枸櫞酸鈉溶液、注射用燈盞花素（湖南恒生制藥有限公司，20110202）；活化部分凝血酶時間（aptt）測定試劑盒（1121911）、凝血酶原時間（pt）測定試劑盒（105295）、凝血酶時間（tt）測定試劑盒（121168）、纖維蛋白原（fib）含量測定試劑盒（132107）均由上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

實(shí)驗(yàn)動物：獺兔，雄性，體重2.0～2.5kg，由河南大學(xué)藥學(xué)院中藥研究所提供（醫(yī)動字14-2-6號）。在25±2℃和濕度45-65％，12/12小時光暗環(huán)境中循環(huán)飼養(yǎng)，可自由獲得水和食物，動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠。

樣品溶液配制：

稱取羅布麻花多糖vp16.2mg，v2pa-i6mg，vp2a-ii7.5mg，vp34.6mg溶解于適量生理鹽水中，配置成5mg/ml濃度的溶液；

稱取燈盞花素8mg溶解于600μl生理鹽水中，制得濃度為13.33mg/ml的溶液；

稱取云南白藥1mg溶解于200μl生理鹽水中，制得濃度為5mg/ml的溶液。

實(shí)驗(yàn)方法。

(1)對aptt影響的檢測方法

血漿的制備：家兔耳緣靜脈取血3.6ml，置于含有400μl濃度為0.109mol/l枸櫞酸鈉的離心管中，輕輕顛倒混勻，3000rpm離心15min，取上層清液，備用。

在測試杯中加入25μl樣品溶液，再加入100μl血漿和37℃預(yù)溫的aptt試劑100μl，37℃孵育5min后加入37℃預(yù)溫的0.025mol/lcacl2溶液100μl，記錄凝固時間，即為aptt值。

(2)對pt影響的檢測方法

血漿的制備方法同上。在測試杯中加入25μl的樣品溶液，再加入100μl的血漿，37℃孵育3min后加入37℃預(yù)溫的pt試劑200μl，記錄凝固時間，即為pt值。

(3)對tt影響的檢測方法

血漿的制備方法同上。在測試杯中加入50μl樣品溶液和200μl的血漿，孵育3min后加入tt試劑200μl，記錄凝固時間，即為tt值。

(4)對fib影響的檢測方法

血漿的制備方法同上。按照說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200μl血漿和100μl樣品溶液，然后加入700μlfib緩沖液（購買的試劑盒中所含），混勻。取前述稀釋后的血漿200μl，37℃預(yù)溫3min，加入100μlfib凝血酶溶液（fib凝血酶溶液是用2.5mlfib緩沖液稀釋fib凝血酶所得，fib凝血酶為購買的試劑盒中所含），記錄纖維蛋白原的含量，即為fib值。

數(shù)據(jù)處理：抗凝血活性的數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值統(tǒng)計采用spss19.0軟件單因素方差分析（one-wayanova）進(jìn)行組間比較，p<0.05說明具有統(tǒng)計學(xué)意義。測定結(jié)果見表1。

注：與空白組比較，***p<0.001，0.01<**p<0.001；

與云南白藥比較，^￥￥￥p<0.001，與燈盞花素比較，^###p<0.001。

由表1可以看出：與空白組比較，vp1與vp3都能極顯著地縮短aptt（p<0.001），其中vp1效果超過了陽性對照云南白藥（p<0.001），而vp3效果遠(yuǎn)不如陽性對照云南白藥（p<0.001）；vp2a-i與vp2a-ii極顯著地延長了aptt（p<0.001），但效果弱于陽性對照燈盞花素。與空白組比較，vp3與vp2a--ii極顯著地延長了pt（p<0.001），其效果與陽性對照燈盞花素相似；vp1與vp2a-i作用效果與空白組相似。與空白組比較，vp1能極顯著地縮短tt（p<0.001），其效果遠(yuǎn)不如陽性對照云南白藥（p<0.001）；vp3能極顯著地延長tt（p<0.001），其效果遠(yuǎn)不如陽性對照燈盞花素（p<0.001）；vp2a-i與vp2a-ii作用效果與空白組相似。與空白組比較，vp1能極顯著地升高fib（p<0.001），vp2a-i、vp2a-ii與vp3作用效果與空白組相似。

綜合上述結(jié)果可以看出：羅布麻花多糖組分vp1具有一定的體外促凝血活性，可用于制備促凝血藥物；而羅布麻花多糖組分vp3則具有一定的體外抗凝血作用，可用于制備抗凝血藥物。