本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種包含北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus(rsv))是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體。出生后兩年內(nèi)90％以上嬰幼兒至少經(jīng)歷一次rsv感染，6個月以下嬰兒、老年人及免疫缺陷人群易發(fā)生嚴重感染及死亡。對于rsv感染引起的疾病，目前唯一有效的上市藥物就是帕利珠單抗(palivizumab)。rsv屬于副粘病毒科，肺炎病毒屬，是非節(jié)段單股負鏈rna囊膜病毒。病毒基因組全長15.2kb，包含10個編碼基因(依次為ns1、ns2、n、p、m、sh、g、f、m2、l)，共編碼11種蛋白，包括3種核衣殼蛋白(n、p、l)、3種跨膜蛋白(f、g、sh)、3種基質(zhì)蛋白(m、m2-1、m2-2)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1、ns2)。其中g(shù)、f兩種糖蛋白又被稱為粘附蛋白和融合蛋白，分別介導(dǎo)病毒與細胞的黏附和融合，對于病毒侵染宿主細胞具有重要作用，這兩種蛋白也是目前疫苗研制的主要靶抗原。根據(jù)g蛋白抗原特異性可將rsv分為a和b兩個亞型，兩型間g蛋白氨基酸序列僅有53％同源性，而f蛋白則有較高氨基酸同源性，高達90％，且以f蛋白作為疫苗抗原可同時預(yù)防a和b兩個亞型的rsv感染。

f蛋白由f1、f2兩個亞基組成，為i型糖蛋白，以三聚體形式存在。f蛋白存在兩種狀態(tài)：亞穩(wěn)定的融合前與較穩(wěn)定的融合后狀態(tài)。目前已發(fā)現(xiàn)f蛋白有6個中和抗體表位：i、ii、iv、v和vi及融合前抗原位點，針對抗原位點、i、ii、iv均有相應(yīng)中和單抗研制的報道，其中抗原位點ii就是rsv預(yù)防及治療性單抗帕利珠(palivizumab)及莫維珠(motavizumab)的結(jié)合位點，位于f1亞基的255-278位氨基酸，是“α螺旋-環(huán)-α螺旋”二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象型表位，在f蛋白融合前后構(gòu)象狀態(tài)保持不變，因此帕利珠對于融合前和融合后的rsv均具有中和活性。

上世紀60年代經(jīng)甲醛滅活的rsv疫苗(fi-rsv)在臨床試驗中出現(xiàn)了嚴重的erd現(xiàn)象，免疫后的嬰幼兒再次感染rsv時不但沒起到預(yù)防作用，肺部炎癥反應(yīng)反而加重，最終造成2名嬰幼兒死亡。因此在rsv疫苗研發(fā)中如何規(guī)避erd現(xiàn)象并提高疫苗的安全性和有效性成為首要考慮問題。目前已有較多的rsv候選疫苗包括減毒活疫苗、重組活病毒疫苗、重組亞單位(g/f蛋白)疫苗和核酸(g/f)疫苗等都處于臨床前和臨床研究。以novavax公司、medimmune公司和gsk公司為代表的研發(fā)機構(gòu)均以rsvf蛋白作為疫苗的靶抗原，且進入臨床研究階段，臨床研究數(shù)據(jù)顯示在成人中對于控制和預(yù)防rsv感染具有明顯作用。

雖然f蛋白有很好的免疫原性，但純化后的f蛋白免疫棉鼠后進行攻毒試驗曾經(jīng)出現(xiàn)過erd現(xiàn)象，揭示f蛋白仍存在一定程度的安全風(fēng)險。同時，不僅由f蛋白制備的疫苗可能會出現(xiàn)erd現(xiàn)象，其他免疫原蛋白同樣會有類似的風(fēng)險。因此，尋找一種安全有效的針對呼吸道合胞病毒的疫苗極為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中的一些疫苗免疫應(yīng)答弱，并且存在安全隱患的問題，提供了一種包含北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種包含北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白，所述重組融合蛋白由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白和插入在所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之間的外源蛋白質(zhì)片段組成。

本發(fā)明中所述的北極地松鼠肝炎病毒(arcticgroundsquirrelhepatitisvirus，agshv)屬于嗜肝dna病毒科，其宿主為北極地松鼠、灰松鼠、加利福尼亞地松鼠及旅鼠等，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與人乙肝病毒、土撥鼠肝炎病毒及地松鼠肝炎病毒關(guān)系較近，且agshv核心蛋白與人乙肝病毒核心抗原(hbc)結(jié)構(gòu)類似，可由240個或180個agshv核心蛋白自主裝配成病毒樣顆粒(t＝4或t＝3)。本發(fā)明人在充分借鑒已有成果的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造性地發(fā)明了基于agshv為載體，包含有外源表位的重組融合蛋白，通過優(yōu)化設(shè)計，在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒(chimericvlp，cvlp)，該cvlp作為疫苗成分，在保證疫苗安全性的前提下，可刺激產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，用于預(yù)防rsv的感染，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值。

在本發(fā)明中，所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列是以野生型蛋白質(zhì)序列(uniprotkb/swiss-prot:q64897.1)為參考序列，如seqidno.1所示的載體序列。

上述外源蛋白質(zhì)片段可以為任意目標蛋白質(zhì)片段，包括但不限于，具有免疫原性的蛋白質(zhì)片段，比如b細胞或t細胞受體、具有中和活性的抗原表位、蛋白標簽(gfp或egfp等)以及其他具有免疫學(xué)活性的肽段。

作為優(yōu)選，所述外源蛋白質(zhì)片段插入在所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之間，所述外源蛋白質(zhì)片段通過氨基酸連接臂與所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白連接。

在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源蛋白質(zhì)片段插入在北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之間，且通過適當(dāng)?shù)陌被徇B接臂連接后，其外源蛋白質(zhì)片段可最大程度的展現(xiàn)在病毒樣顆粒的表面，可提高該片段的免疫學(xué)活性。

病毒樣顆粒(virus-likeparticles，vlps)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的蛋白顆粒，缺失病毒核酸，無感染性，在結(jié)構(gòu)蛋白適當(dāng)位置插入外源表位后,能夠重復(fù)高密度的展示在vlp表面。因此，利用嵌合病毒樣顆粒技術(shù)制備疫苗具有安全高效的特點。

作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施方式中，所述重組融合蛋白裝配成病毒樣顆粒。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述重組融合蛋白在表達系統(tǒng)中形成嵌合病毒樣顆粒(cvlps)。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白和插入在所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之間的外源蛋白質(zhì)片段組成的重組融合蛋白在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白和插入在所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之間并通過氨基酸連接臂與所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白連接的外源蛋白質(zhì)片段組成的重組融合蛋白在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種上述重組融合蛋白在制備抗原呈遞載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種上述重組融合蛋白在制備疫苗中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述疫苗為呼吸道合胞病毒預(yù)防性疫苗。

作為優(yōu)選，上述重組融合蛋白在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒，所述嵌合病毒樣顆粒作為所述疫苗的一部分。

作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施方式中，上述重組融合蛋白中的外源蛋白質(zhì)片段為具有免疫原性的蛋白質(zhì)片段。

更優(yōu)選地，所述外源蛋白質(zhì)片段為呼吸道合胞病毒融合蛋白片段。

作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施方式中，上述插入在所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之間的外源蛋白質(zhì)片段為具有免疫原性的蛋白質(zhì)片段。

更優(yōu)選地，所述外源蛋白質(zhì)片段為呼吸道合胞病毒融合蛋白片段，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段通過n末端的gile氨基酸連接臂和c末端的l氨基酸連接臂與所述所述北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸連接。

在本發(fā)明中，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段可以為rsv基因組中的任意編碼基因編碼的蛋白，該編碼基因包括但不限于ns1、ns2、n、p、m、sh、g、f、m2或l基因，或其組合。

作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施方式中，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段為rsvf蛋白。

更優(yōu)選地，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段為rsvf蛋白中的抗原表位ii。該抗原表位ii的氨基酸序列如seqidno.3所示。

作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施方式中，所述重組融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

作為優(yōu)選，上述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白與呼吸道合胞病毒融合蛋白表位組成的重組融合蛋白裝配成病毒樣顆粒。

更優(yōu)選地，上述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白與呼吸道合胞病毒融合蛋白表位組成的重組融合蛋白在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種上述重組融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟1)將重組融合蛋白的基因序列按照漢遜酵母密碼子的優(yōu)劣性及trna豐度進行優(yōu)化和合成，得到優(yōu)化后的重組融合蛋白基因序列；

步驟2)用步驟1)中得到的重組融合蛋白基因序列替換載體puc25-su中的s基因序列，得到puc25-agru重組質(zhì)粒；

步驟3)將步驟2)中得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入漢遜酵母中誘導(dǎo)表達，經(jīng)提取、純化后得到所述重組融合蛋白。

具體地，上述制備方法可進一步包括以下步驟：

步驟a)基因的優(yōu)化與合成

將同時含有氨基酸連接臂和呼吸道合胞病毒融合蛋白片段基因序列的北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白基因序列，按照漢遜酵母密碼子的優(yōu)劣性及trna豐度進行優(yōu)化與合成；

步驟b)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將步驟a)中得到的基因序列替換載體puc25-su中的s基因序列，獲得puc25-agru重組質(zhì)粒；

步驟c)重組融合蛋白的表達和純化

將步驟b)中得到的puc25-agru重組質(zhì)粒，進行ecori和hindⅲ酶切后，線性化處理，電轉(zhuǎn)化入nvsi-h.p-105(△ura3△leu2)漢遜酵母菌中，獲得重組體，通過elisa方法篩選獲得重組融合蛋白高表達量陽性菌株，發(fā)酵誘導(dǎo)表達，收獲菌體，高壓破碎，離心取上清，凝膠過濾層析純化，即得重組融合蛋白。

其中，步驟a)中所涉及的基因是根據(jù)融合蛋白的氨基酸序列設(shè)計、優(yōu)化并合成的。作為優(yōu)選，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種上述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白與呼吸道合胞病毒融合蛋白表位組成的重組融合蛋白在制備呼吸道合胞病毒預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種疫苗，所述疫苗包含有效劑量的上述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白與呼吸道合胞病毒融合蛋白表位組成的重組融合蛋白，以及佐劑。

其中，所述優(yōu)選為含有低溶解性鋁成分，更優(yōu)選為氫氧化鋁。當(dāng)然，也可以使用如mf59，磷酸鋁，磷酸鈣，細胞因子(例如il-2，il-12，gm-csf)，皂苷(例如qs21)，mdp衍生物，cpg寡核苷酸，lps，mpl，聚磷腈(polyphosphazenes)，乳劑(例如弗氏(freund’s)，saf)，脂質(zhì)體，脂肽，病毒顆粒(virosome)，iscoms，cochleates，plg微粒，泊洛沙姆(poloxamer)顆粒，病毒樣顆粒，熱不穩(wěn)定腸毒素(lt)，霍亂毒素(ct)，突變體毒素(例如ltk63和ltr72)，微粒和/或聚合脂質(zhì)體等佐劑。

本發(fā)明所述疫苗可以通過任何合適的方式使用，例如皮內(nèi)(i.d.)，腹膜內(nèi)(i.p.)，肌肉內(nèi)(i.m.)，鼻內(nèi)，口服，皮下(s.c.)等及在任何合適的投遞裝置(o’hagan等，naturereviews,drugdiscovery2(9),(2003),727-735)中使用。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述疫苗在皮內(nèi)，皮下或肌肉內(nèi)使用。

上述疫苗可制成任意合適的劑型，包括但不限于凍干劑、液體劑、噴霧劑。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種抗體，所述抗體通過上述由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白與呼吸道合胞病毒融合蛋白表位組成的重組融合蛋白免疫個體后得到。

本發(fā)明的另一個方面是提供了一種包含上述重組融合蛋白的菌株。

本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明首次利用北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白作為外源表位呈遞載體，可以有效地在vlp表面展示外源表位，使外源表位在vlp表面重復(fù)高密度的分布，并且不影響vlp的自主裝配。

2)本發(fā)明重組融合蛋白利用漢遜酵母表達系統(tǒng)進行表達，蛋白表達量高，具有一定程度的蛋白翻譯后加工修飾，且重組融合蛋白在酵母體內(nèi)可自動裝配成cvlp，表達產(chǎn)物易純化。

3)本發(fā)明由北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白和呼吸道合胞病毒融合蛋白表位共同組成的重組融合蛋白，可結(jié)合帕利珠單克隆抗體，在免疫小鼠后，可產(chǎn)生針對rsv病原特異性中和抗體，對于研發(fā)rsv疫苗提供可行性。

4)本發(fā)明中基于agshv為載體，包含有外源表位的重組融合蛋白，通過優(yōu)化設(shè)計，在漢遜酵母中表達形成嵌合病毒樣顆粒(chimericvlp，cvlp)，該cvlp作為疫苗成分，在保證疫苗安全性的前提下，可刺激產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，用于預(yù)防rsv的感染，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為puc25-agru重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；

圖2為puc25-agru重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖，其中l(wèi)ane1為puc25-agru質(zhì)粒的酶切結(jié)果；

圖3為篩選到的蛋白高表達量陽性酵母菌株pcr鑒定結(jié)果圖，其中l(wèi)ane1為菌株pcr電泳結(jié)果；

圖4為本發(fā)明設(shè)計的重組融合蛋白組分鑒定結(jié)果圖，其中，

a:誘導(dǎo)表達后全菌體分析；

lane1為未誘導(dǎo)菌體；

lane2為誘導(dǎo)后菌體；

b:純化后重組融合蛋白sds-page分析；

lane3為純化后的目的蛋白電泳結(jié)果；

c:重組融合蛋白的western-blot分析；

lane4為目的蛋白的免疫印跡結(jié)果；

圖5為重組融合蛋白與帕利珠抗體的結(jié)合結(jié)果圖；

圖6為重組融合蛋白cvlp動態(tài)光散射結(jié)果圖；

圖7為磷鎢酸負染后重組融合蛋白的cvlp透射電鏡圖；

圖8為重組融合蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的病原特異性中和抗體滴度水平結(jié)果圖；

序列說明

seqidno.1為本發(fā)明中北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列；

seqidno.2為本發(fā)明的重組融合蛋白的氨基酸序列；

seqidno.3為本發(fā)明的重組融合蛋白中抗原表位的氨基酸序列；

seqidno.4為本發(fā)明的重組融合蛋白的核苷酸序列。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種包含北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。需要特別指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明，并且相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍的基礎(chǔ)上對本文所述內(nèi)容進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件和操作過程。

實驗材料：

ecori、hindⅲ限制性內(nèi)切酶以及pcr反應(yīng)試劑均來自takara公司；

rsvsf蛋白來自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，為昆蟲細胞重組表達產(chǎn)物，凍干劑；

帕利珠單克隆抗體來自medimmune公司；

山羊抗人igg-hrp來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；

氫氧化鋁佐劑來自servaelectrophoresisgmbh公司；

balb.c雌性小鼠來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；

puc25-su酵母表達質(zhì)粒來自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司；

nvsi-h.p-105(△ura3△leu2)漢遜酵母菌種來自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司；

rsvlong株(atccvr26)來自美國菌種保藏中心(atcc)；

下述實施例中所有有關(guān)基因測序及引物合成均委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；

下述實施例中所有有關(guān)基因合成和基因操作均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

下述培養(yǎng)基配方中的百分比均為質(zhì)量體積比：

md培養(yǎng)基：1.34％無氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖；

mm培養(yǎng)基：1.34％無氨基酸酵母氮源，0.8％無水甲醇；

sm-leu培養(yǎng)基：1.34％無氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸；

mm-leu培養(yǎng)基：1.34％無氨基酸酵母氮源，0.8％無水甲醇，0.01％亮氨酸；

ypd培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

固體培養(yǎng)基為上述液體培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂，高溫高壓滅菌。

實施例1：重組融合蛋白酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1、重組融合蛋白的設(shè)計

以北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白氨基序列(uniprotkb/swiss-prot:q64897.1)為參考序列，形成如seqidno.1所示的載體序列，在seqidno.1序列的第78位和第79位氨基酸之間插入呼吸道合胞病毒融合蛋白(genebank:aco83301.1)第254-277位氨基酸表位(seqidno.3所示)，該表位即是帕利珠抗體的結(jié)合位置，通過“gile”和“l(fā)”氨基酸連接臂串聯(lián)而成，形成如seqidno.2所示的氨基酸序列。

2、基因優(yōu)化和合成

根據(jù)seqidno.2所示的重組融合蛋白氨基酸序列，按照漢遜酵母密碼子的優(yōu)劣性及trna豐度進行基因序列的優(yōu)化，形成如seqidno.4所示的編碼基因序列，將該序列進行基因合成。

3、表達質(zhì)粒的構(gòu)建

按照圖1所示的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖，利用基因重組技術(shù)將目的基因替換表達載體puc25-su酵母表達質(zhì)粒中s基因，形成包含有重組融合蛋白基因序列(如seqidno.4所示)的酵母表達質(zhì)粒puc25-agru，該質(zhì)粒以漢遜酵母基因組上25srdna為同源重組整合臂，以ura3基因為標記基因，以mox啟動子高效啟動目的蛋白表達。

4、puc25-agru表達質(zhì)粒的酶切鑒定和基因序列測定

對puc25-agru酵母表達質(zhì)粒進行ecori和hindⅲ雙酶切鑒定，37℃，酶切1小時，酶切體系如表1所示，將酶切后的產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，可見該質(zhì)?？擅盖谐鰞蓷l基因片段，分別約為4kb的大片段和2kb的小片段，大片段即為包含有重組融合蛋白目的基因的酵母表達框，將該質(zhì)粒進行基因序列測定，結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果一致，無目的基因的改變。

表1酶切體系

實施例2：高表達陽性酵母菌株的篩選和鑒定

1、轉(zhuǎn)化

將nvsi-h.p-105(△ura3△leu2)漢遜酵母菌培養(yǎng)于ypd液體培養(yǎng)基中，菌體密度(od600)達到1.0時，進行酵母感受態(tài)的制備，將經(jīng)過ecori和hindⅲ雙酶切后的puc25-agru質(zhì)粒中大片段基因通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化入nvsi-h.p-105酵母菌內(nèi)，最終將轉(zhuǎn)化菌液涂布于sm-leu固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-5天，獲得轉(zhuǎn)化重組體。

2、elisa篩選

挑取sm-leu固體培養(yǎng)基上生長的單克隆菌落于2mlsm-leu液體培養(yǎng)基中，進行菌體培養(yǎng)，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)24小時。取200μl菌液轉(zhuǎn)接于4mlsm-leu液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待菌體密度(od600)達到10以上后，3000rpm離心收獲菌體，并重懸于4mlmm-leu培養(yǎng)基中進行菌體培養(yǎng)，此階段每隔6小時加入1％無水甲醇，誘導(dǎo)目的蛋白的表達，誘導(dǎo)24小時；離心收獲菌體并加入200μl酵母菌體破碎緩沖液(20mmpb，ph值7.2)及200mg玻璃珠，高頻低溫振蕩破碎，利用包被液(na2co3-nahco3溶液，ph值9.6)將蛋白上清液稀釋500倍并包被于酶標板上，100μl/孔，4℃包被8小時；加入含有1％bsa的pbs，100μl/孔，37℃封閉3小時；將帕利珠單抗稀釋至1μg/ml，100μl/孔，37℃，1小時；將山羊抗人igg-hrp稀釋10000倍，100μl/孔，37℃，1小時；加入50μl顯色液a和50μl顯色液b，室溫顯色10分鐘，加入50μl終止液c；在波長為450nm和630nm波長下讀取od值，選擇od值最高的菌株作為重組融合蛋白高表達酵母菌株。由于篩選到的酵母菌株僅補充了ura3基因，僅能在補充有亮氨酸的培養(yǎng)基中生長，因此將leu2基因轉(zhuǎn)化入篩選到的酵母菌內(nèi)，使該菌株可在md基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長。

3、菌種目的基因鑒定

提取重組融合蛋白高表達酵母菌株基因組，利用表2所示的引物進行目的基因的pcr擴增，pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表3、表4所示，將pcr產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，可擴增出預(yù)期大小的dna片段，將pcr產(chǎn)物進行基因序列測定，目的基因無改變。

表2菌種鑒定用引物信息表

表3pcr反應(yīng)體系

表4pcr反應(yīng)條件

實施例3：cvlp的制備和鑒定

1、酵母發(fā)酵及菌體破碎

將實施例2中篩選得到的重組融合蛋白高表達酵母菌種接種于10ml的md液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24小時，再轉(zhuǎn)接于100mlmd液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24小時，制備發(fā)酵種子，接種于5l發(fā)酵罐內(nèi)進行酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)，并利用甲醇進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達。發(fā)酵結(jié)束后，利用生理鹽水洗滌菌體2次，最終將菌體重懸于破碎緩沖液(20mmpb,50mmnacl,ph值7.2)中進行高壓破碎，離心取蛋白上清液。將誘導(dǎo)前后的全菌體蛋白進行10％sds-page電泳分析，結(jié)果如圖4a所示，箭頭所指即為目的蛋白帶。

2、目的蛋白純化及western-blot檢測

采用akta色譜純化儀(geaktaexplorer)進行凝膠過濾層析純化，介質(zhì)選擇sephacryls500-hr，柱體積為900ml，具體過程如下：

a、柱平衡：以3倍柱體積的平衡緩沖液(50mmpb+0.2mnacl，ph7.3)平衡層析柱至280nm吸收值無明顯的變化，小于0.5mau，將檢測器的吸收值歸零。

b、上樣：將100ml蛋白粗純液按照5ml/min泵速泵入層析柱中，上樣結(jié)束后，平衡緩沖液繼續(xù)流穿層析柱。

c、收樣：待緩沖液到1/3柱體積時280nm吸收值逐漸升高，按照5ml/管自動收集，并對收集后的樣品進行sds-page電泳分析。

d、柱回收及循環(huán)利用：0.2m氫氧化鈉溶液處理層析柱，而后利用平衡緩沖液平衡層析柱，繼續(xù)下一個蛋白的層析純化。

將純化后的目的蛋白進行10％sds-page電泳分析結(jié)果如圖4b所示，箭頭所指即為目的蛋白帶，分子量大小約為25kd，與預(yù)期大小基本一致。同時將純化后的目的蛋白進行western-blot檢測，按照常規(guī)方法將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至pvdf膜上后，利用帕利珠抗體進行檢測，結(jié)果如圖4c所示，箭頭所指即為目的蛋白顯影帶。

3、與帕利珠抗體的結(jié)合試驗

將純化后的cvlp從1μg/ml起始進行2倍梯度稀釋，并包被于酶標板上，同時以rsvsf蛋白為陽性對照，加入的帕利珠抗體濃度為1μg/ml，以驗證cvlp蛋白與帕利珠抗體的結(jié)合程度，結(jié)果如圖5所示，cvlp可有效的與帕利珠抗體結(jié)合。

4、cvlp的動態(tài)光散射及透射電鏡觀察

將純化后的蛋白進行動態(tài)光散射(malvern，nano-8s90)分析，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示vlp大小均一性良好，水合粒徑約為29nm。將目的蛋白滴于300目的鍍炭銅網(wǎng)膜上，吸附5分鐘，磷鎢酸負染1分鐘，透射電鏡(hitachi,jem-1400)觀察樣品的顆粒形態(tài)，結(jié)果如圖7所示，可見vlp大小在20-30nm之間，大小均一，形態(tài)良好。

實施例4：本發(fā)明重組融合蛋白的免疫學(xué)效果研究

取6-8周齡spf級balb/c雌性小鼠32只，隨機分成a、b、c和d4組，每組8只。分別按下列設(shè)計方案免疫接種：a組注射0.5μg的重組融合蛋白(cvlp)與250μg的氫氧化鋁佐劑混合物；b組注射0.5μg的rsvsf蛋白與250μg的氫氧化鋁佐劑混合物；c組注射生理鹽水與250μg的氫氧化鋁佐劑，為對照組。采取腹腔途徑免疫，各組均免疫3次，間隔2周。各組小鼠免疫后每日觀察小鼠狀態(tài)和體重變化。免疫結(jié)束后兩周，斷錐采血并分離血清。利用病毒微量中和試驗方法檢測血清中rsv特異性中和抗體滴度水平，結(jié)果如圖8所示，重組融合蛋白(cvlp)與氫氧化鋁佐劑混合后，可產(chǎn)生較高水平的rsv特異性中和抗體滴度，提示本發(fā)明重組融合蛋白有可作為rsv預(yù)防性疫苗的潛力。

對比例：本發(fā)明重組融合蛋白與其他類型重組融合蛋白的比較分析

按照實施例1的設(shè)計方案，分別設(shè)計以土撥鼠肝炎病毒核心抗原(whc)為呈遞載體的cvlp以及以人乙肝病毒核心抗原(hbc)為呈遞載體的cvlp，按照實施例1、2和3所述的方法分別制備，最終得到whc-cvlp和hbc-cvlp。按照實施例4中的動物免疫方法，在此基礎(chǔ)之上增加兩組，每組8只，d組注射0.5μg的whc-cvlp與250μg的氫氧化鋁佐劑混合物；e組注射0.5μg的hbc-cvlp與250μg的氫氧化鋁佐劑混合物，采取腹腔途徑免疫，各組均免疫3次，間隔2周。各組小鼠免疫后每日觀察小鼠狀態(tài)和體重變化。免疫后兩周，斷錐采血并分離血清，利用病毒微量中和試驗方法檢測血清中rsv特異性中和抗體滴度水平。結(jié)果如圖8所示，顯示agshv-cvlp的rsv特異性中和抗體滴度約為9.5，whc-cvlp的rsv特異性中和抗體滴度約為6.5，hbc-cvlp的rsv特異性中和抗體滴度約為3.0，agshv-cvlp較whc-cvlp和hbc-cvlp產(chǎn)生的中和抗體水平較高。以上結(jié)果提示agshv-cvlp在外源表位呈遞方面具有明顯優(yōu)勢，本發(fā)明重組融合蛋白有可作為rsv預(yù)防性疫苗的潛力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司；北京生物制品研究所有限責(zé)任公司

<120>一種包含北極地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

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