本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種cea.car-t及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor,car)修飾t細胞(car-t細胞治療技術(shù))是近年來發(fā)展非常迅速的一種過繼免疫細胞治療技術(shù)。通過基因改造技術(shù)，效應(yīng)t細胞的靶向性、殺傷活性和持久性均優(yōu)于常規(guī)應(yīng)用的免疫細胞，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)，是腫瘤免疫細胞治療領(lǐng)域中新的靶向治療方式。car-t細胞治療技術(shù)的特點在于將抗體的靶向特異性與t細胞的歸巢、組織穿透和靶向摧毀能力結(jié)合起來用于腫瘤治療，并在過去的十年中取得了飛速發(fā)展，在多種惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床轉(zhuǎn)化中均取得了顯著療效，多個臨床試驗結(jié)果也令人振奮。car-t技術(shù)將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與cd3-ζ鏈或fcεriγ的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)患者t細胞，使其表達嵌合抗原受體，患者的t細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的car-t細。根據(jù)胞內(nèi)區(qū)的結(jié)構(gòu)不同，可將car-t劃分為三代：第一代car-t(cfv+信號傳導(dǎo)部分)雖然能夠介導(dǎo)對腫瘤細胞的殺傷作用，但是不轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號和誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，并且體內(nèi)持續(xù)作用時間不長；第二代car-t通過增加共刺激分子(例如cd28)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以延長其體內(nèi)存活時間，促進其迅速擴增能力，通過構(gòu)建scfv/fc/cd28/cd3-ζ的car-t可以裂解靶細胞，且不需要b7與cd28的作用，僅靠單一分子就可以傳遞活化信號，產(chǎn)生大量的ifn-γ、il-2等細胞因子；第三代car-t增加了更多的共刺激信號結(jié)構(gòu)域(通常是腫瘤壞死因子受體家族成員)，例如4-1bb(又稱cd137)、ox40(又稱cd134)、cd27、可誘導(dǎo)共刺激分子(inducibleco-stimulatorymolecule，icos)等，第三代car-t較第二代具有更好的增強t細胞活化、擴增、抗腫瘤以及促進轉(zhuǎn)基因表達的能。目前成功運用于臨床的car-t細胞種類主要包括cd19-car-t、her-2/neu-car-t等，世界范圍內(nèi)多個中心正在進行靶向不同腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen,taa)的car-t細胞治療臨床研究，包括靶向cd133、cd138、cd20、cd30、egfr、c-met等。目前實體瘤缺乏好的靶點，主要是由于實體瘤細胞的異質(zhì)性，所以通過大量的臨床標本收集和驗證，找到更為特異性的實體瘤靶點是當前car-t細胞治療領(lǐng)域的一個重要方向。我們團隊先后構(gòu)建靶向腫瘤抗原cea、muc-1等car-t細胞，初步建立了car-t細胞制備的技術(shù)平臺，進行了系列臨床前研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體及其制備與應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供一種靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括依次連接的結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨摸區(qū)(cd28-tm)、胞內(nèi)4-1bb及胞內(nèi)cd3ζ。優(yōu)選地，所述結(jié)合癌胚抗原的多肽為抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)。優(yōu)選地，所述抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.11所示。優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.12所示。本發(fā)明一些實施例中，列舉了所述抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列seqidno.10所示。優(yōu)選地，所述cd28跨膜區(qū)的氨基酸序列如seqidno.13所示。優(yōu)選地，所述胞內(nèi)cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.14所示。優(yōu)選地，所述胞內(nèi)4-1bb的氨基酸序列如seqidno.15所示。優(yōu)選地，所述結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽與cd28跨膜區(qū)(cd28-tm)之間通過連接片段連接。所述連接片段的氨基酸數(shù)量可為≥2個。優(yōu)選地，所述連接片段為免疫球蛋白igd的鉸鏈區(qū)片段。進一步優(yōu)選地，所述連接片段為免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段的氨基酸序列如seqidno.16所示。所述連接片段可通過二硫鍵相互連接形成二聚體。優(yōu)選地，所述結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽的c末端與所述cd28跨膜區(qū)(cd28-tm)的n末端連接。本發(fā)明一些實施例中，列舉了所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體的氨基酸序列如seqidno.9所示。本發(fā)明第二方面提供了一種多核苷酸，其編碼所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體。本發(fā)明第三方面提供了一種表達載體，其含有所述多核苷酸。本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細胞，其被所述表達載體所轉(zhuǎn)化。本發(fā)明第五方面，提供一種制備所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體的方法，包括步驟：構(gòu)建含有靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體編碼多核苷酸序列的表達載體，然后將所述表達載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞中誘導(dǎo)表達，從表達產(chǎn)物中分離獲得所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體。本發(fā)明的第六方面，提供所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體在制備嵌合抗原受體t細胞及腫瘤治療藥物中的用途。本發(fā)明的第七方面，提供一種嵌合抗原受體t細胞，其表達所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體。本發(fā)明的第八方面，提供一種腫瘤治療藥物，其含有所述嵌合抗原受體t細胞。本發(fā)明的第九方面，提供一種腫瘤治療方法，包括步驟：將所述嵌合抗原受體t細胞施用于腫瘤患者。優(yōu)選地，所述腫瘤為癌胚抗原高表達的腫瘤。例如：結(jié)腸癌、腸癌、胃癌肝轉(zhuǎn)移及胰腺癌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：腸癌、胃癌肝轉(zhuǎn)移及胰腺癌等惡性實體腫瘤的治療仍是腫瘤治療的難點，雖然手術(shù)治療、放化療、介入治療等有一定療效，但患者生存率仍無顯著改善。目前，備受關(guān)注的car-t細胞治療技術(shù)有望成為該類腫瘤治療的突破口。本發(fā)明根據(jù)該類腫瘤特異性高表達cea腫瘤抗原的特點，設(shè)計靶向識別cea的特異性抗體，采用第二代car骨架作為載體，設(shè)計cea.car-t細胞，并通過一系列體外及體內(nèi)試驗，證實我們自行設(shè)計的cea.car-t細胞可以特異性識別并殺傷cea高表達的人腫瘤細胞系及移植瘤模型，證實其是一種安全、特異、有效的car-t細胞，具有重要的臨床應(yīng)用價值。附圖說明圖1：cea.car的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2：cea.car的整個表達框結(jié)構(gòu)示意圖。圖3a：流式結(jié)果顯示，在ifn-γ刺激前后，lovo細胞都高表達cea。圖3b：elisa結(jié)果顯示，和其他腫瘤細胞與cart共培養(yǎng)上清相比，lovo與cea嵌合cd4+t細胞或cea嵌合cd8+t細胞共育后ifn-γ分泌最高。圖3c：cea.car-t(bfp+)與lovo細胞共育后，t細胞活化標記分子(cd69)上調(diào)。圖4：lovo-nsg小鼠模型顯示，cea.car-t有效抑制腫瘤生長。具體實施方式car-tcar-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細胞免疫療法。嵌合抗原受體chimericantigenreceptor(car)。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。實施例1靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體表達載體的構(gòu)建本發(fā)明中，靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體可簡稱為cea.car。本發(fā)明中，如圖1所示，cea.car由依次連接的結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨摸區(qū)(cd28-tm)、胞內(nèi)4-1bb及胞內(nèi)cd3ζ融合而成。其中，結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽為抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)。所述單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈可變區(qū)(vh)。所述輕鏈可變區(qū)(vl)的編碼核苷酸序列如seqidno.1所示，具體為：gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。所述重鏈可變區(qū)(vh)的編碼核苷酸序列如seqidno.2所示，具體為：agcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。所述抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)的編碼核苷酸序列如seqidno.3所示，具體為：gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。cd28跨膜區(qū)(cd28-tm)的編碼核苷酸序列如seqidno.4所示，具體為：atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtg。胞內(nèi)4-1bb的編碼核苷酸序列如seqidno.5所示，具體為：cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。胞內(nèi)cd3ζ的編碼核苷酸序列如seqidno.6所示，具體為：cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨摸區(qū)(cd28-tm)之間免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段作為連接片段連接。所述免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段的編碼核苷酸序列如seqidno.7所示，具體為：gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaag。為了便于對cea.car的識別，在胞內(nèi)cd3ζ的c端連接了t2a-tagbfp。委托公司合成cea.car的整個表達框，如圖2所示，插入pcart-ef1a-scfv-car框載體(購自上海吉凱公司)，經(jīng)測序正確后，使用qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，獲得重組表達載體的高品質(zhì)質(zhì)粒。經(jīng)測序可知，cea.car的全長基因序列正確，均與預(yù)期相符。具體地，cea.car的編碼核苷酸序列如seqidno.8所示，具體為：atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgcgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。采用現(xiàn)有技術(shù)，對重組表達載體的高品質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)至宿主細胞中誘導(dǎo)表達，從表達產(chǎn)物中分離純化獲得cea.car。對獲得的cea.car經(jīng)n/c末端序列分析，結(jié)果表明所表達的cea.car均讀框無誤，與理論n/c末端氨基酸序列一致。因此，可得知，cea.car的氨基酸序列如seqidno.9所示，具體為：_metdtlllwvlllwvpgstgdtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleikgstsgggsgggsggggssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvsseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkmfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprl?？拱┡呖乖?cea)的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列如seqidno.10所示，具體為：dtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleikgstsgggsgggsggggssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvss?？拱┡呖乖?cea)的單鏈抗體(scfv)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.11所示，具體為：dtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleik。抗癌胚抗原(cea)的單鏈抗體(scfv)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.12所示，具體為：ssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvss。cd28跨膜區(qū)(cd28-tm)的氨基酸序列如seqidno.13所示，具體為：mfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv。胞內(nèi)4-1bb的氨基酸序列如seqidno.14所示，具體為：rfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。胞內(nèi)cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.15所示，具體為：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。結(jié)合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨膜區(qū)(cd28-tm)之間免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段作為連接片段連接。所述免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段的氨基酸序列如seqidno.16所示，具體為：eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。實施例2靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體表達慢病毒制備一、制備慢病毒1.目的：介紹生產(chǎn)和濃縮用于后續(xù)哺乳動物細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒的方法。2.設(shè)備和材料試劑及材料公司貨號dmem*培養(yǎng)基gibco11960044rpmi培養(yǎng)基lonza12-115q熱滅活fbs§gibco16140calphos哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染試劑盒clontech631312丁酸鈉sigmab5887-5g聚乙二醇(peg)sigmap5413-1kg*dmem“完全”培養(yǎng)基為加入10％熱滅活fbs的dmem培養(yǎng)基。在silverlab中，我們還添加了100u/ml青霉素-鏈霉素。§若無熱滅活fbs，可將常規(guī)fbs置于56℃水浴30分鐘，完全解凍以熱滅活fbs。3.步驟注意事項：傳統(tǒng)的病毒制備需要8個10厘米培養(yǎng)皿?？筛鶕?jù)需要進行調(diào)整。此過程中，同時制備3種病毒，每種病毒需要8個10厘米培養(yǎng)皿。3.1準備hek293t：3.1.1.準備制備慢病毒時，提前3天將hek293t細胞傳代接種于t-150培養(yǎng)瓶中。hek293t細胞培養(yǎng)方法如下(注意：盡量縮短細胞在濃縮胰蛋白酶中和培養(yǎng)箱外面的時間)：3.1.1.1.將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸凈，棄掉。3.1.1.2.向每個t-150培養(yǎng)瓶中加入2ml0.25％胰蛋白酶，并傾斜培養(yǎng)瓶以確保胰蛋白酶覆蓋整個瓶底。3.1.1.3.37℃孵育2-3分鐘。3.1.1.4.檢查細胞是否已從瓶底脫落；可傾斜培養(yǎng)瓶以促進細胞消化脫落。3.1.1.5.待細胞消化脫落后，向每個培養(yǎng)瓶中加入10mldmem完全培養(yǎng)基，并用移液管充分混合，以確保細胞完全懸浮于溶液中。3.1.1.6.將10μl細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至600μl離心管中，并加入90μl培養(yǎng)基稀釋、混勻。3.1.1.7.從上述1：10稀釋過的細胞懸液中取出15μl并與15μl臺盼藍混合，計數(shù)并計算出細胞密度。3.1.1.8.以5×106個/20ml培養(yǎng)基的細胞密度將細胞接種于t-150培養(yǎng)瓶中(3天后每個t-150培養(yǎng)瓶中的細胞數(shù)量可達到45-60×106)。3.1.1.9.將培養(yǎng)瓶平放于的co2培養(yǎng)箱中。3.1.2.培養(yǎng)72小時后，觀察細胞生長情況，若細胞密度達到80-90％，細胞狀態(tài)良好(細胞明亮，緊密附著于瓶底，細胞邊緣平整等)。則可用于后續(xù)慢病毒制備。3.2.慢病毒制備的第1天：注意：由于需要先等細胞粘附于培養(yǎng)皿底部才可開始進行calphos轉(zhuǎn)染，而這一過程大概需要需要4-6小時。因此要在慢病毒制備的第1天盡早將細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中。注意：或者，可在轉(zhuǎn)染前24小時按照3.5×106個/9ml密度接種于10cm培養(yǎng)皿中。3.2.1.制備一種慢病毒，需要8個10cm細胞培養(yǎng)皿，并標明日期、姓名和質(zhì)粒id號。3.2.2.如3.1.1.1-3.1.1.7所述，將hek293t細胞用胰蛋白酶消化，dmem完全培養(yǎng)基終止消化并計數(shù)。3.2.3.確定慢病毒制備所需的細胞數(shù)量：7×106個細胞/皿，8個皿/病毒。3.2.4.實際收取的細胞要比以上所需細胞數(shù)量多3.5×106個，以防損耗(例如，制備2種病毒需實際收取171.5×106，每種病毒8個培養(yǎng)皿的細胞)。3.2.5.加入適量的培養(yǎng)基使最終濃度為7×106個細胞/9ml。3.2.6.將9ml細胞懸浮液等分到每個標記好的10cm培養(yǎng)皿中。3.2.7.將每個培養(yǎng)皿平放于生物安全柜上，沿前后左右輕輕地來回移動，以使細胞均勻鋪于皿底。3.2.8.將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱。勿將多個培養(yǎng)瓶羅放于培養(yǎng)箱中。由于細胞的生長狀況不同，細胞密度達到80％大概需要3-6個小時。之后，便可開始進行calphos轉(zhuǎn)染。3.2.9.按下表計算所需的試劑體積。試劑每個培養(yǎng)皿需要的量構(gòu)建的質(zhì)粒dna15μg病毒載體pcmv-rev2(ps013)1μg病毒載體pchgp-2(ps014)10μg病毒載體pcmv-g(ps015)2μg2mcacl262μl無菌水總體積為500μl3.2.10.按照以下順序?qū)o菌水(來自calphos轉(zhuǎn)染試劑盒)，質(zhì)粒dna和2mcacl2溶液(來自calphos轉(zhuǎn)染試劑盒)加入15ml離心管中，并充分混合。3.2.11.按照平均每個反應(yīng)體系500μl2xhbs，將適量的2xhbs加入50ml離心管中，適當增加體積，避免損耗(例如，8個培養(yǎng)皿反應(yīng)體系可共加4100μlhbs)。3.2.12.使用1ml移液槍，將等體積的dna/cacl2混合物逐滴加入hbs中，滴加的同時輕輕晃動hbs管。3.2.13.將混合物在室溫下孵育20分鐘。待孵育即將結(jié)束時，取出早上鋪好的293t細胞。3.2.14.用1ml移液槍上下吹打混合hbs/cacl2/dna溶液。3.2.15.將1ml溶液逐滴滴加到每個培養(yǎng)皿中。3.2.16.重復(fù)步驟3.2.7，充分混勻。3.2.17.處理完所有培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱過夜孵育，不超過18小時即可進行下一步實驗。3.3.慢病毒制備的第2天(取出calphos成分)3.3.1.按照如下操作準備0.6m丁酸鈉溶液：3.3.1.1.將3.3027g丁酸鈉(sigma，貨號b5887-5g)溶于50mlh2o中。0.22-μm真空過濾器滅菌。室溫儲存。3.3.2.除去calphos成分(對細胞有毒)，并在轉(zhuǎn)染后18小時內(nèi)更換培養(yǎng)基。3.3.2.1.配制第2天所需培養(yǎng)基：245mldmem完全培養(yǎng)基中加入2.45ml0.6m丁酸鈉。(注意：本實驗中共24個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿中加入10ml培養(yǎng)基，可適當調(diào)整。)3.3.2.2.將上述培養(yǎng)基及不含鎂、鈣的1xpbs預(yù)熱至37℃。3.3.2.3.為避免細胞在培養(yǎng)箱外面呆的時間過長，可一次性取出兩塊培養(yǎng)皿依次進行處理。3.3.2.4.在培養(yǎng)皿的中央標記一條線來區(qū)分移除和加入培養(yǎng)基的部位，以減少對其他部位細胞的傷害。3.3.2.6.用10ml移液管和移液器放置緩慢，輕輕吸除培養(yǎng)基。3.3.2.7.旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，將吸除培養(yǎng)基的位置轉(zhuǎn)到對側(cè)，用10ml移液管沿培養(yǎng)皿的上緣緣緩慢加入5ml上述預(yù)熱的pbs。使培養(yǎng)基可沿培養(yǎng)皿底面緩緩流下。3.3.2.8.沿前后左右來回移動培養(yǎng)皿(如步驟3.2.7所示)以徹底沖洗。然后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，在吸除培養(yǎng)基的位置吸除pbs洗滌液。3.3.2.9.緩緩加入10ml步驟3.3.2.1中制備的含有丁酸鈉的dmem完全培養(yǎng)基。3.3.2.10.將培養(yǎng)皿回培養(yǎng)箱。3.3.2.11.按照步驟3.3.2.3-3.3.2.9處理其余的培養(yǎng)皿。3.4生產(chǎn)慢病毒的第三天(一代收集和peg處理)3.4.1收集病毒上清(24小時后換液)3.5病毒重懸3.5.8.1將收集到的病毒每盤加入50μ無血清的1640。不要用移液管上下混勻。3.5.8.2將超凈管用封口膜封口，在振蕩器上震動若干秒將其完全重懸。3.5.8.3將其在4攝氏度環(huán)境中靜置30min-1h，每份病毒在其v底冷凍管上做標記。3.5.8.4將病毒懸液在振蕩器上震蕩混勻至沒有明顯團塊。(超速離心后溶液及時沒有明顯沉淀也是濃稠的)。3.5.8.5將同一種病毒的重懸液加在同一個管子中。3.5.8.6將空的超凈管放入50ml離心管中，震動15sec將參與病毒上清移到管底。3.5.8.7將3.4.4.5中的上清轉(zhuǎn)移到一個總收集管中。3.5.8.8將上清震蕩使其均勻。3.5.8.9將一份上清轉(zhuǎn)移到v底凍存管中(每份大約25-50μl)。3.5.9將每份病毒貯存于-80℃。二、慢病毒滴定1.目的：介紹評估慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法2.設(shè)備和材料*dmem“完全”培養(yǎng)基為加入10％熱滅活fbs的dmem培養(yǎng)基。在silverlab中，我們還添加了100u/ml青霉素-鏈霉素?！烊魺o熱滅活fbs，可將常規(guī)fbs置于56℃水浴30分鐘，完全解凍以熱滅活fbs。3.步驟第1天注意：以最高病毒輸入量額外轉(zhuǎn)染幾個孔用于長期培養(yǎng)和冷凍保存注意：空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞作陰性對照1.每孔用0.5mlrpmi完全培養(yǎng)基將0.1×106個jurkat細胞接種至24孔板中。2.每孔按照1：1000加入聚凝胺(4mg/ml)(例如0.5ml培養(yǎng)基中加入0.5μl4ml/ml的聚凝胺)。3.復(fù)蘇病毒4.用rpmi完全培養(yǎng)基，1：1000稀釋濃縮病毒。5.以下列濃度將病毒加入每個孔中。a.加入50ul1：1000稀釋的病毒(最終的病毒體積：5×10-5ml)b.加入0.5ul未稀釋病毒(最終的病毒體積：5×10-4ml)c.加入1ul未稀釋的病毒(最終的病毒體積:為1×10-3ml)d.加入5ul未稀釋的病毒(最終的病毒體積：5×10-3ml)6.37℃過夜孵育。第2天每個孔中加入0.5ml新鮮的rpmi完全培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺。第3天1.收集樣品并利用流式細胞術(shù)進行檢測以分析基因的表達。2.以最高病毒輸入量額外轉(zhuǎn)染幾個孔用于長期培養(yǎng)和冷凍保存滴度計算：注意：滴度計算的線性范圍是15％-45％載體表達率。最終，經(jīng)計算獲得靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體表達慢病毒的滴度符合要求。實施例3t細胞的體外培養(yǎng)、遺傳修飾和擴增采用實施例2制備的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受體表達慢病毒慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人t淋巴細胞：1.將pbmc接種于24孔板的3個孔中，每孔500萬個細胞，1mlrpmi。2.每孔加入1ug/mlokt3和1：1000稀釋的il2刺激細胞。3.37℃孵育24h。4.6ml病毒上清液中加入6ul聚凝胺(4mg/ml)，混勻。5.每孔加入2ml病毒/聚凝胺混合物。6.1800r/s，離心50分鐘。7.每孔吸除2/3上清液；并向每個孔中加入2ml病毒/聚凝胺混合物和1:1000稀釋的il2。8.37℃孵育過夜。9.吸除2/3上清液；并向每個孔中加入2ml新鮮rpmi和1：1000稀釋的il2。10.37℃孵育過夜。11.收集樣品并利用流式細胞術(shù)進行檢測(cd4，cd8，tim3)以分析目的基因表達情況。從中篩選出成功進行了遺傳修飾的t細胞，亦即cea.car-t。接下來cea高表達細胞株lovo的鑒定及與cea-car-t共培養(yǎng)，觀察cea-car-t細胞效應(yīng)功能的變化：圖3a.在ifn-γ刺激或不刺激的情況下，facs檢測結(jié)果顯示與293t、ht-29、caco2和a375相比，lovo細胞中cea呈高表達。圖3b.與293t，ht-29，caco2和a375組相比，cea.car-t與lovo共培養(yǎng)時，cd4和cd8亞群中ifn-γ產(chǎn)生顯著增加。圖3c.構(gòu)建并濃縮高滴度復(fù)制缺陷型慢病毒載體。在轉(zhuǎn)染前24小時，將11-12×106的293t人胚胎腎細胞用10cm培養(yǎng)板鋪板。慢病毒載體純化后采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293t細胞，轉(zhuǎn)染24和48小時后收集培養(yǎng)上清。采用轉(zhuǎn)染cea.car的jurkat與lovo進行共培養(yǎng)殺傷實驗，結(jié)果表明共培養(yǎng)8h后，jurkat細胞中cd69分子表達水平顯著上調(diào)。實施例4體內(nèi)試驗驗證cea.car-t細胞的抗腫瘤作用選用實施例3中所構(gòu)建的cea.car-t細胞，采用人腸癌細胞株lovo在nsg小鼠中構(gòu)建移植瘤模型，體內(nèi)試驗探討cea.car-t在腸癌模型治療中的作用。如圖4所示，6只nsg小鼠皮下接種5x106人腸癌細胞株lovo，3只小鼠在第14天接種6x106的cea.car-t細胞，3只小鼠在第14天接種pbs，每2天測量腫瘤大小。lovo-nsg小鼠模型顯示，ceacart有效抑制腫瘤生長。本發(fā)明還嘗試過將cea.car上的抗cea的抗體替換成針對該抗原的抗體，來制備其他car-t，結(jié)果各方面的效果沒有本發(fā)明的cea.car-t效果好。以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應(yīng)當理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>常州市第一人民醫(yī)院<120>cea.car-t及其制備與應(yīng)用<130>171719<160>16<170>patentinversion3.3<210>1<211>384<212>dna<213>artificial<220><223>輕鏈可變區(qū)（vl）的編碼核苷酸序列<400>1gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtg60ctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgc120agagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaa180ccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccct240gtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggag300gctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcgga360ggggggaccaagctggaaataaaa384<210>2<211>369<212>dna<213>artificial<220><223>重鏈可變區(qū)（vh）的編碼核苷酸序列<400>2agcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtc60aagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaag120cagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagt180aaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacaca240gcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccg300tttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcacc360gtctcctca369<210>3<211>801<212>dna<213>artificial<220><223>抗癌胚抗原（cea）的單鏈抗體（scfv）的編碼核苷酸序列<400>3gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtg60ctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgc120agagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaa180ccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccct240gtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggag300gctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcgga360ggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttcc420ggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagcca480ggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatg540cactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcg600aatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacaca660tcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctat720tattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaagga780acctcagtcaccgtctcctca801<210>4<211>84<212>dna<213>artificial<220><223>cd28跨膜區(qū)（cd28-tm）的編碼核苷酸序列<400>4atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgaca60gtggccttcatcatcttttgggtg84<210>5<211>141<212>dna<213>artificial<220><223>胞內(nèi)4-1bb的編碼核苷酸序列<400>5cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccattt60atgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaa120gaagaaggaggatgtgaactg141<210>6<211>336<212>dna<213>artificial<220><223>胞內(nèi)cd3ζ的編碼核苷酸序列<400>6cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctg60tacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggc120cgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataac180gaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcgg240aggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacc300tacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg336<210>7<211>687<212>dna<213>artificial<220><223>免疫球蛋白igg4鉸鏈區(qū)片段的編碼核苷酸序列<400>7gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggaccc60agcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgag120gtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtac180gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagc240acctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaa300tacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaag360gccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatg420accaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgcc480gtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctg540gacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcag600gaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag660aagagcctgagcctgtccctgggcaag687<210>8<211>2109<212>dna<213>artificial<220><223>cea.car的編碼核苷酸序列<400>8atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggt60gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtg120ctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgc180agagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaa240ccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccct300gtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggag360gctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcgga420ggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttcc480ggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagcca540ggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatg600cactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcg660aatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacaca720tcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctat780tattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaagga840acctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcc900cccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctg960atgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatccc1020gaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccc1080agagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccag1140gactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagc1200atcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctg1260cctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggc1320ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactac1380aagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgacc1440gtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggcc1500ctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtg1560ctg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