本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種提高丙酸發(fā)酵效率的方法，具體涉及一種采用二次接種的方式提高丙酸發(fā)酵效率的方法。

背景技術：

產酸丙酸桿菌菌株(propionibacteriumacidipropionici)是微生物發(fā)酵生產丙酸的生產菌種，其發(fā)酵過程中產生的丙酸主要存在于發(fā)酵液中，但是丙酸的不斷積累會對菌體細胞生長以及丙酸自身代謝產生反饋抑制作用，進而降低了發(fā)酵效率。為了提高發(fā)酵效率，研究人員對生產菌株進行了基因改造(biotechnologyandbioengineering,2009,104:766-773；metabolicengineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反饋抑制機理(journalofbiotechnology,2013,167:56-63)，并采用了過程工程手段將發(fā)酵液中的丙酸移除，減緩了其對發(fā)酵的抑制作用(appliedmicrobiologyandbiotechnology,2001,56:676-680；bioresourcetechnology,2012,112:248-253；bioresourcetechnology,2012,104：652-659)。

上述方法均可以有效提高發(fā)酵過程中的底物轉化效率和丙酸產量，但是，在實際生產過程中，均需要在原有發(fā)酵設備的基礎上，增加其他的外接操作單元，如膜分離設備、層析分離設備等，使得發(fā)酵工藝變得復雜、操作變得繁瑣。

目前，已有技術公開了通過“二次接種”的方式來再次發(fā)酵，cn103478417a公開了一種二次接種分段固態(tài)發(fā)酵生產發(fā)酵豆粕的方法，首先將枯草芽孢桿菌液、假絲酵母菌液和乳酸桿菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合發(fā)酵；然后將乳酸桿菌液接入到發(fā)酵物中，混合，厭氧發(fā)酵，得到發(fā)酵豆粕。該方法采用二次接種，將不同的菌株分開接種的方式，以滿足好氧菌和厭氧菌的不同發(fā)酵需求，但其對于產酸丙酸桿菌菌株生產丙酸并不適用。

cn101012465a公開了一種二次接種疊加生物素的谷氨酸發(fā)酵生產方法，該方法以生物素缺陷型谷氨酸產生菌株為生產菌株，在營養(yǎng)條件豐富的情況下，采用二級接種使得菌體細胞和生物素保持“超亞適量”狀態(tài)，不僅解決了發(fā)酵供氧的問題，還克服了夏季高溫環(huán)境下的發(fā)酵熱問題，提高了生產效率。但是，丙酸桿菌發(fā)酵過程中存在嚴重的產物反饋抑制作用，與谷氨酸發(fā)酵生產時菌體細胞的生長環(huán)境差異甚大，因此，不適用于產酸丙酸桿菌菌株生產丙酸的情況。

由此可見，如何針對發(fā)酵過程中營養(yǎng)條件匱乏、有害代謝產物不斷積累、產物的反饋抑制作用，以及菌株生長性能和代謝活力不斷減弱，適應性降低等情況，提供一種即可以提高發(fā)酵效率，而又無需額外添加操作單元的方式就顯得尤為重要。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發(fā)明旨在提供一種提高丙酸發(fā)酵效率的方法，所述方法通過采用“二次接種”的方法，即在發(fā)酵過程中補接新鮮的種子液，提高了菌株的生產性能，所述方法操作簡單，不會延長發(fā)酵周期，而且不增加任何設備投資，便于工業(yè)化生產。

為達此目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種提高丙酸發(fā)酵效率的方法，包括如下步驟：

(1)菌種活化：將保存的丙酸桿菌進行活化；

(2)發(fā)酵：將活化后的丙酸桿菌轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)二次接種：在發(fā)酵到80-156h時以5-20％的接種量將丙酸桿菌進行二次接種。

本發(fā)明中，所述二次接種的菌種與接種量與第一次發(fā)酵前接種的菌種與接種量相同，菌種均是丙酸桿菌，所述方法通過在特定的時間點二次接入新鮮的種子液，提高了菌株的生產性能，提高了底物的轉化率，且該方法特異的針對丙酸發(fā)酵效果顯著，且經過二次接種，整個發(fā)酵的周期沒有延長。

本發(fā)明中，所述丙酸桿菌來自于微生物菌株保藏中心，保藏編號為cmcc1.2230。

根據本發(fā)明，步驟(1)所述的活化具體包括：將保存的丙酸桿菌接種于一級種子培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，再轉接至二級搖瓶種子培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)。

本發(fā)明中，所述丙酸桿菌保存在甘油管或斜面培養(yǎng)基中，所述甘油管或斜面培養(yǎng)基只要能夠用于保存丙酸桿菌的都是可行的，在此不做特殊限定，本領域技術人員可以根據需要自行選擇，示例性地，所述斜面培養(yǎng)基包括如下組分：20g/l葡萄糖、10g/l玉米漿、2g/l硫酸銨、2g/l碳酸鈣和15g/l瓊脂。

優(yōu)選地，所述轉接的接種量為5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，優(yōu)選為10％。

根據本發(fā)明，所述一級種子培養(yǎng)基和二級搖瓶種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分是相同的，所述種子培養(yǎng)基包括如下組分：30-40g/l葡萄糖、15-25g/l玉米漿、1-10g/l硫酸銨和1-10g/l磷酸二氫鉀，優(yōu)選為35g/l葡萄糖、21g/l玉米漿、5g/l硫酸銨和4g/l磷酸二氫鉀。

優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基的ph為6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，優(yōu)選為6.8-7.0。

根據本發(fā)明，所述丙酸桿菌在一級種子培養(yǎng)基和在二級搖瓶種子培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件是相同的。

優(yōu)選地，所述靜置培養(yǎng)的溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，優(yōu)選為30℃。

優(yōu)選地，所述靜置培養(yǎng)的時間為40-55h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h或55h，優(yōu)選為48h。

優(yōu)選地，步驟(2)所述轉接的接種量為5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，優(yōu)選為10％。

優(yōu)選地，步驟(2)發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：55-65g/l葡萄糖、35-45g/l玉米漿和磷酸二氫鉀4-5g/l，優(yōu)選為60g/l葡萄糖、41g/l玉米漿和4.6g/l磷酸二氫鉀。

所述葡萄糖例如可以是55g/l、56g/l、57g/l、58g/l、59g/l、60g/l、61g/l、62g/l、63g/l、64g/l或65g/l；所述玉米漿例如可以是35g/l、36g/l、37g/l、38g/l、39g/l、40g/l、41g/l、42g/l、43g/l、44g/l或45g/l；所述磷酸二氫鉀例如可以是4g/l、4.1g/l、4.2g/l、4.3g/l、4.4g/l、4.5g/l、4.6g/l、4.7g/l、4.8g/l、4.9g/l或5g/l。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，優(yōu)選為6.8-7.0。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph通過流加弱堿來維持ph的恒定，只要能夠調節(jié)ph的弱堿都是可行的，在此不做特殊限定，本領域技術人員可以根據需要自行選擇，本發(fā)明中采用氨水進行調節(jié)ph。

根據本發(fā)明，所述發(fā)酵培養(yǎng)中的葡萄糖濃度不低于10g/l。

本發(fā)明中隨著發(fā)酵的進行，葡萄糖不斷消耗，通過實時監(jiān)測葡萄糖濃度，補加葡萄糖來使得葡萄糖的濃度不低于10g/l，所述補加葡萄糖的方式為本領域的常規(guī)技術。

優(yōu)選地，步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，優(yōu)選為30℃。

優(yōu)選地，步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速率為40-60r/min，例如可以是40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min、45r/min、46r/min、47r/min、48r/min、49r/min、50r/min、51r/min、52r/min、53r/min、54r/min、55r/min、56r/min、57r/min、58r/min、59r/min或60r/min，優(yōu)選為50r/min。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的二次接種時間為80-156h，例如可以是80h、81h、82h、83h、84h、85h、86h、87h、88h、89h、90h、91h、92h、93h、94h、95h、96h、97h、98h、99h、100h、101h、102h、103h、104h、105h、108h、110h、113h、115h、118h、120h、123h、125h、128h、130h、133h、135h、138h、140h、143h、145h、148h、150h、153h或156h，優(yōu)選為82-100h，進一步優(yōu)選為82-90h，最優(yōu)選為84h。

本發(fā)明中，通過調節(jié)二次接種的時間，發(fā)明人發(fā)現，在發(fā)酵80h之前進行接種新鮮種子液，對底物轉化率的提高不明顯，隨著有害代謝產物的積累和營養(yǎng)物質的消耗，菌體的代謝能力逐漸下降，產物合成能力降低，在發(fā)酵80h之后進行接種新鮮種子液，底物轉化率明顯提高。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的接種量為5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，優(yōu)選為10％。

根據本發(fā)明，步驟(3)所述丙酸桿菌為步驟(1)活化后的丙酸桿菌。

作為優(yōu)選技術方案，所述提高丙酸發(fā)酵效率的方法包括如下步驟：

(1)菌種活化：將保存的丙酸桿菌接種于一級種子培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，再按接種量為5-20％轉接至二級搖瓶種子培養(yǎng)基中25-35℃靜置培養(yǎng)40-55h，所述種子培養(yǎng)基包括如下組分：30-40g/l葡萄糖、15-25g/l玉米漿、1-10g/l硫酸銨和1-10g/l磷酸二氫鉀，所述種子培養(yǎng)基的ph為6-7.5；

(2)發(fā)酵：將活化后的丙酸桿菌按接種量為5-20％轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中25-35℃、40-60r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，當葡萄糖濃度低于10g/l時補加葡萄糖，同時用氨水調節(jié)ph為6-7.5，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：55-65g/l葡萄糖、35-45g/l玉米漿和4-5g/l磷酸二氫鉀，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6-7.5；

(3)二次接種：在發(fā)酵到80-156h時以5-20％的接種量將步驟(1)活化后的丙酸桿菌進行二次接種，直至發(fā)酵結束。

與現有技術相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明方法在傳統批次發(fā)酵的基礎上通過在特定的時間點二次接入新鮮的種子液，提高了菌株在發(fā)酵后期相對惡劣條件下的生長代謝能力，進而提高了菌株的生產性能，且該方法特異的針對丙酸發(fā)酵效果顯著，在不延長發(fā)酵周期的情況下，底物的轉化率提高了6％以上，丙酸的產量提高了6％以上；

(2)本發(fā)明方法操作簡單，工業(yè)生產時無需增加任何額外的設備，便于工業(yè)化放大生產。

具體實施方式

為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

(1)菌種活化：將甘油管或斜面保存的菌種進行平板劃線活化，置于30℃恒溫厭氧培養(yǎng)72h，再按接種量為10％轉接至二級搖瓶種子培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)48h，所述種子培養(yǎng)基包括如下組分：35g/l葡萄糖、21g/l玉米漿、5g/l硫酸銨和4g/l磷酸二氫鉀，所述種子培養(yǎng)基的ph為6.8-7；

(2)發(fā)酵：將活化后的丙酸桿菌按接種量為10％轉接到10l發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率為50r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，當葡萄糖濃度低于10g/l時補加葡萄糖，同時用氨水調節(jié)ph為6.8-7，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：60g/l葡萄糖、41g/l玉米漿和4.6g/l磷酸二氫鉀，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.8-7；

(3)二次接種：在發(fā)酵到84h時以10％的接種量將步驟(1)活化后的丙酸桿菌進行二次接種，直至發(fā)酵結束。

所述實施例1的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到61.84g/l，產量為0.258g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.549g/g。

實施例2

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種量為5％之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到56.82g/l，產量為0.238g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.536g/g。

實施例3

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種量為20％之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到60.39g/l，產量為0.251g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.533g/g。

實施例4

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的時間為156h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到54.35g/l，產量為0.226g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.503g/g。

實施例5

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的時間為80h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到55.21g/l，產量為0.227g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.510g/g。

實施例6

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的時間為95h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到57.32g/l，產量為0.235g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.521g/g。

實施例7

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的時間為88h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到59.34g/l，產量為0.241g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.529g/g。

實施例8

相比于實施例1，除了步驟(2)中的培養(yǎng)溫度25℃，攪拌速率40r/min之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到58.46g/l，產量為0.248g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.533g/g。

實施例9

相比于實施例1，除了步驟(2)中的培養(yǎng)溫度35℃，攪拌速率60r/min之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到57.75g/l，產量為0.247g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.535g/g。

對比例1

相比于實施例1，除了未進行步驟(3)中的二次接種之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到48.51g/l，產量為0.183g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.398g/g。

對比例2

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種量為3％之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到49.78g/l，產量為0.203g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.436g/g。

對比例3

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種量為23％之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到51.29g/l，產量為0.214g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.472g/g。

對比例4

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種時間為75h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到52.64g/l，產量為0.220g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.475g/g。

對比例5

相比于實施例1，除了步驟(3)中的二次接種的接種時間為160h之外，其他條件與實施例1相同。

所述實施例的總共發(fā)酵時間長達240h，發(fā)酵液中的丙酸濃度可達到50.71g/l，產量為0.211g/(l·h)，葡萄糖對丙酸的轉化率為0.463g/g。

相比對比例1-5，實施例1-9通過進行二次接種，且通過在特定的時間進行特定接種量的接種，丙酸濃度和產量都明顯提高，葡萄糖對丙酸的轉化率也明顯提高；另外，相比實施例8-9，實施例1-7通過控制發(fā)酵溫度和轉速，也有利于丙酸濃度和產量的提高，葡萄糖對丙酸的轉化率也明顯提高；相比于實施例1和實施例4-7，通過控制二次接種時間在82-90h內，其丙酸濃度和產量都明顯提高，葡萄糖對丙酸的轉化率也明顯提高，丙酸轉化率都得到了進一步提高；相比于實施例1-3，通過控制二次發(fā)酵的接種量也使得丙酸濃度和產量都明顯提高，葡萄糖對丙酸的轉化率也明顯提高。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細工藝設備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細工藝設備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細工藝設備和工藝流程才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內。