一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法，屬于生物【技術領域】。本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加乳酸、蘋果酸、富馬酸或琥珀酸，實現P.acidipropionici丙酸產量分別提高43％、11％、10％和9％，并通過同時添加105mM乳酸、20mM富馬酸和30mM琥珀酸實現了丙酸產量的最大提高。本發(fā)明為促進產酸丙酸桿菌的丙酸發(fā)酵生產提供了有效的方法和新的思路。
【專利說明】一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 作為一種重要的C3平臺化合物，丙酸及其衍生物的用途十分廣泛，可應用于食品 防腐、飼料儲藏、醫(yī)藥中間體合成、農業(yè)除莠劑合成、有機合成中間體及香料、涂料、染料等 方面。2006年世界丙酸總生產能力在35萬噸/年左右，2008年達到50萬噸/年。美國是 世界上最大的丙酸生產及消費國。目前我國丙酸實際年產量只有200噸左右，遠遠不能滿 足實際的市場需求，每年仍需大量進口來彌補國內的空缺。
[0003] 目前，丙酸的生產方法有化學合成法和微生物發(fā)酵法。化學合成法以石油等化工 產品為原料，經過加溫、加壓利用催化劑合成丙酸，是現在工業(yè)上生產丙酸的主要方法。隨 著化石原料（如石油、煤炭）等不可再生資源、能源的日漸枯竭以及環(huán)境污染的日益加劇， 以可再生生物資源為原料大規(guī)模生產丙酸的微生物發(fā)酵法為丙酸的合成提供了新的思路。 用于丙酸發(fā)酵的菌種主要是丙酸桿菌屬，是一類革蘭氏陽性、不產芽孢、不運動、接觸酶陽 性的厭氧菌。其中產酸丙酸桿菌為目前國內外用于丙酸發(fā)酵研究的主要菌株之一，最適PH 為6. 5?7. 5,最適生長的溫度為28°C?37°C，具有較高的丙酸生產能力。然而，相對于日 益增長的市場需求，微生物發(fā)酵法的發(fā)展仍然嚴重受制于過低的丙酸產量。大幅提高發(fā)酵 的產量、生產強度和底物轉化率，是實現發(fā)酵法替代化學合成法生產丙酸的必要途徑。產酸 丙酸桿菌中丙酸的代謝途徑雖已知，但是制約丙酸產量的瓶頸仍未明確。
[0004] 本發(fā)明通過添加中間代謝物控制丙酸代謝途徑中關鍵代謝節(jié)點的通量，最終達到 提高丙酸的產量的目的。應用該方法可顯著提高產酸丙酸桿菌P.acidipropionici的丙酸 產量。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法，是在 產酸丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乳酸、蘋果酸、富馬酸或琥珀酸中的一種或幾種。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，乳酸、蘋果酸、富馬酸或琥珀酸中的一種或幾種是在 接種前添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述乳酸添加量為45_130mM。
[0008] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述乳酸添加量為70_105mM。
[0009] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述乳酸添加量為70_90mM。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蘋果酸添加量為10-60mM。
[0011] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述蘋果酸添加量為10_40mM。
[0012] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述蘋果酸添加量為40mM。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述富馬酸添加量為2_50mM。
[0014] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述富馬酸添加量為20_40mM。
[0015] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述富馬酸添加量為30mM。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述琥拍酸添加量為10-50mM。
[0017] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述琥珀酸添加量為10_30mM。
[0018] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述琥珀酸添加量為20_30mM。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產酸丙酸桿菌（Propionibacterium acidipropionici)是為產酸丙酸桿菌CGMCCL2230。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為按g/L計：酵母粉，8-10; 蛋白胨，3-5 ;KH2P04,1. 0-1. 5 ;Κ2ΗΡ04,2· 0-2. 5;甘油，20-25 ;CoCl2,0-0. 01 ;CaC03,25-30; ρΗ6· 8_7· 2〇
[0021] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（g/LH2O):酵母粉，10;蛋 白胨，5 ;KH2P04,1. 5 ;Κ2ΗΡ04,2· 5 ;甘油，25 ;C〇C12,0. 01 ;CaC03,30 ;ρΗ7· 0。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的特點是通過分別添加90mM乳酸、40mM蘋果酸、30mM 富馬酸或20mM琥拍酸，實現Ρ·acidipropionici丙酸產量分別提高43%、11 %、10%和9%; 并通過同時添加105mM乳酸、20mM富馬酸和30mM琥珀酸實現了丙酸產量提高77%。這為 提高產酸丙酸桿菌的丙酸發(fā)酵生產能力提供了新的思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1.外源添加乳酸、蘋果酸、富馬酸或琥拍酸對P. acidipropionici丙酸產量的 影響。

【具體實施方式】
[0024]種子培養(yǎng)基（g/LH2O):酵母粉，10;胰蛋白胨，5 ;KH2P04,L5 ;K2HP04, 2. 5 ;ρΗ7· 0。
[0025] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（g/LH2O):酵母粉，10 ;蛋白胨，5 ;ΚΗ2Ρ04,1. 5 ;Κ2ΗΡ04,2. 5 ;甘 油，25 ;C〇C12,0. 01 ;CaC03,30 ;ρΗ7· 0。
[0026] 細胞干重（DCW)的測定：取一定量的菌懸液，用稀鹽酸溶液適當稀釋后用UV7500 型可見分光光度計，于600nm處比色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。
[0027] 丙酸的測定方法：高效液相色譜（HPLC)儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（配 紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站）；色譜條件：色譜柱：AgilentZORBAXSB-Aq 柱，5以111，4.6111111\25〇111111;流動相：0.1381]1〇1/1^似]3 :>04，1(%(￥/￥)乙腈，用磷酸調至口!12.0; 流速：0. 8mL/min;柱溫：35oC;進樣量：10μL;紫外檢測器波長：210nm。
[0028] 實施例1發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加乳酸、蘋果酸、富馬酸或琥珀酸提高 P.acidipropioniciCGMCCL2230 丙酸產量
[0029]將冷凍甘油管保藏的P. acidipropionici接種到種子培養(yǎng)基，接種量1%，裝液量 lOO/lOOmL厭氧瓶，30°C靜置培養(yǎng)60h后，轉接到新鮮的種子培養(yǎng)基中，接種量1 %，同樣條 件培養(yǎng)40h，完成活化培養(yǎng)。
[0030] 將經活化培養(yǎng)好的P.acidipropionici以接種量10 %分別轉接到分別添加了 90mM乳酸、40mM蘋果酸、30mM富馬酸或20mM琥珀酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50/100mL厭氧 瓶，30°C靜置培養(yǎng)150h。
[0031]將發(fā)酵液于8000rpm離心5min與菌體分離，取ImL上清液用3. 68mM稀硫酸定容 至10mL，經0. 22μm濾膜過濾后使用HPLC法測定有機酸含量。結果如圖1所示。通過添加 不同濃度的不同酸P.acidipropionici發(fā)酵產酸的變化可以看出，在添加90mM乳酸、40mM 蘋果酸、30mM富馬酸或20mM琥拍酸的條件下，P.acidipropionici發(fā)酵丙酸的產量均有明 顯提高。未添加氨基酸時丙酸產量為9. 6g/L，添加乳酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸后丙酸產量 分別可達 13. 7g/L、10. 7g/L、10. 6g/L和 10. 5g/L。
[0032] 實施例2發(fā)酵培養(yǎng)基中復合添加乳酸、富馬酸和琥拍酸提高P. acidipropionici 丙酸產量
[0033] 取經活化培養(yǎng)好的P.AcidipropioniciCGMCCL2230以接種量10%轉接到復合 添加乳酸、富馬酸和琥珀酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50/100mL厭氧瓶，30°C靜置培養(yǎng)150h。
[0034] 將發(fā)酵液于8000rpm離心5min與菌體分離，取ImL上清液用3.68mM稀硫酸定容 至10mL，經0. 22μm濾膜過濾后使用HPLC法測定有機酸含量。結果如表1所示，通過添加 不同組合的酸時P.acidipropionici發(fā)酵產酸的變化可以看出，未添加氨基酸時丙酸產量 為9. 6g/L，同時添加乳酸、富馬酸和琥珀酸后丙酸產量最高可達17. 0g/L。
[0035] 表1:夕卜源添加不同組合的中間代謝物對P. acidipropionici丙酸產量的影響
[0036]

【權利要求】
1. 一種提高產酸丙酸桿菌丙酸產量的方法，是向產丙酸發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乳酸、蘋果 酸、富馬酸或琥珀酸中的一種或幾種。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，單獨添加乳酸或與其他酸混合添加時，培 養(yǎng)基中乳酸終濃度為45-130mM。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，乳酸終濃度為70-105mM。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，單獨添加蘋果酸或與其他酸混合添加時， 培養(yǎng)基中蘋果酸終濃度為l〇_6〇mM。
5. 根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于，蘋果酸終濃度為10-40mM。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，富馬酸單獨添加或與其他酸混合添加時， 培養(yǎng)基中富馬酸終濃度為2-50mM。
7. 根據權利要求1或6所述的方法，其特征在于，富馬酸終濃度為20-40mM。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，琥珀酸單獨添加或與其他酸混合添加時， 培養(yǎng)基中琥珀酸終濃度為l〇_5〇mM。
9. 根據權利要求1或8所述的方法，其特征在于，琥珀酸終濃度為10-30mM。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為按g/L計：酵 母粉，8-10 ;蛋白胨，3-5 ;KH2P04,1. 0-1. 5 ;K2HP04,2. 0-2. 5 ;甘油，20-25 ;C〇C12,0_0. 01 ; CaC03,25-30 ;pH6. 8-7. 2。
【文檔編號】C12R1/01GK104357497SQ201410567748
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權日:2014年10月22日
【發(fā)明者】劉龍, 陳堅, 堵國成, 李江華, 管寧子 申請人:江南大學