專利名稱：處理痤瘡丙酸桿菌的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開一般涉及用于對(duì)痤瘡丙酸桿菌(P. acnes)免疫的抗原性組合物。公開了用于產(chǎn)生用于預(yù)防痤瘡丙酸桿菌相關(guān)疾病和病癥，包括人和動(dòng)物中酒渣鼻的疫苗的方法，抗人和動(dòng)物中痤瘡丙酸桿菌的疫苗，以及產(chǎn)生抗痤瘡丙酸桿菌疫苗的方法。
背景技術(shù)：
作為棲息于人的微生物區(qū)系的一個(gè)成員，革蘭氏陽(yáng)性厭氧棒狀桿菌痤瘡丙酸桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes)主要存在于皮膚的皮脂腺內(nèi)。然而，它還可以從結(jié)膜、外耳道、口腔、上呼吸道分離到并且在一些個(gè)體中還可以從腸中分離到。痤瘡丙酸桿菌具有IO2至IO5-6CnT2的估計(jì)皮膚密度。痤瘡丙酸桿菌是公認(rèn)的機(jī)會(huì)性病原體，尤其與醫(yī)學(xué)植入物如中樞神經(jīng)系統(tǒng)分流器、硅膠植入物和假體髖關(guān)節(jié)有關(guān)。其還造成眼睛和眼周的感染和眼內(nèi)炎并且還涉及牙周和牙齒的感染。牙齒探查和處理導(dǎo)致痤瘡丙酸桿菌在血液中傳播，其是與損傷或人工瓣膜有關(guān)的心內(nèi)膜炎的公認(rèn)原因。痤瘡丙酸桿菌還在炎癥性痤瘡中起作用，因?yàn)獒槍?duì)痤瘡丙酸桿菌的抗菌治療導(dǎo)致改善，而痤瘡丙酸桿菌發(fā)生抗生素抗性與復(fù)發(fā)相關(guān)。痤瘡的通常形式，即尋常性痤瘡有時(shí)在生活中影響高達(dá)80%的人群，使得其成為最常見的皮膚感染。在嚴(yán)重形式的痤瘡與關(guān)節(jié)痛、骨炎癥(骨炎)和關(guān)節(jié)炎之間還存在強(qiáng)的相關(guān)性。在患有稱作SAPHO(滑膜炎，痤瘡，膿皰病，骨肥大和骨炎)綜合征的該種病癥的患者中，已經(jīng)從骨的活組織檢查樣品以及滑液和組織中得到痤瘡丙酸桿菌分離株。已經(jīng)基于血清學(xué)凝集試驗(yàn)和細(xì)胞壁糖分析鑒定出兩種不同表型的痤瘡丙酸桿菌， 即I型和II型。最近，基于recA的序列分析已經(jīng)顯示，I型和II型痤瘡丙酸桿菌代表著系統(tǒng)發(fā)育的不同組(McDowell等，2005)。痤瘡丙酸桿菌與綿羊和人紅細(xì)胞均產(chǎn)生共溶血反應(yīng)(Choudhury，1978)，這類似于首先于 1944 年證明的 Christie-Atkins-Munch-Petersen(CAMP)反應(yīng)(Christie 等， 1944)。CAMP反應(yīng)描述了綿羊紅細(xì)胞被來(lái)自無(wú)乳鏈球菌(Sti^ptococcus agalactiae)的 CAMP因子和來(lái)自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的毒素(鞘磷脂酶C)的協(xié)同溶血，證明CAMP因子對(duì)神經(jīng)酰胺具有非酶性親和性(Bernheimer等，1979)。對(duì)鞘磷脂酶所處理免疫紅細(xì)胞的檢查已經(jīng)顯示被重組無(wú)乳鏈球菌CAMP因子形成分散的膜孔(Lang和 Palmer, 2003)。除了對(duì)無(wú)乳鏈球菌的CAMP因子廣泛研究之外(Bernheimer等，1979 ；Brown 等，1974 Jurgens 等，1985，1987 ；RuhImann 等，1988 ；Skalka 等，1980)，已知許多其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生陽(yáng)性CAMP反應(yīng)，包括溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica) (Fraser, 1962)、氣單胞菌屬(Aeromonas) (Figura 禾口 Guglielmetti，1987)、 弧菌屬(Vibrio)的一些種(Kohler，1988)和 G 群鏈球菌(Soedermanto 和 Lammler，1996)。這些種中的一些種除了利用金黃色葡萄球菌毒素外，還可以利用來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的磷脂酶C( α -毒素)或來(lái)自假結(jié)核棒狀桿菌 (Corynebacterium pseudotuberculosis)的磷脂酶 D 作為溶血的輔因子(Frey 等，1989)。 胸膜月市炎方文線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)禾口乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)的CAMP因子基因已經(jīng)鑒定、克隆并在大腸桿菌中表達(dá)(Frey等，1989 Jiang等， 1996)。CAMP分子在細(xì)菌毒力中的確切作用仍然未知。很可能共溶血反應(yīng)代表著實(shí)驗(yàn)室表型，或者副現(xiàn)象，這方便于CAMP因子檢測(cè)，但是這可能與分子在建群和發(fā)病機(jī)制中的作用沒(méi)有直接相關(guān)。來(lái)自無(wú)乳鏈球菌的CAMP因子結(jié)合IgG和IgM分子的Fc區(qū)，類似于IgG與金黃色葡萄球菌蛋白A的結(jié)合(Jurgens等，1987)，并且已經(jīng)證明了無(wú)乳鏈球菌CAMP因子蛋白質(zhì)與金黃色葡萄球菌蛋白A之間的部分氨基酸序列相似性(Ruhlmarm等，1988)。

發(fā)明內(nèi)容
本公開提供用于治療或預(yù)防痤瘡丙酸桿菌感染的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法和組合物包括ASM酶抑制劑，包括例如，小分子抑制劑或抗ASM酶抗體。在另一實(shí)施方案中，組合物和方法包括包含痤瘡丙酸桿菌CAMP因子的疫苗。在又一實(shí)施方案中，方法和組合物包括抗痤瘡丙酸桿菌CAMP因子抗體。在再一實(shí)施方案中，方法和組合物包括抗 CAMP因子疫苗或抗體和ASM酶抑制劑或抗體的組合。本公開還提供免疫原性組合物，包含含有表1所指出序列的基本純的多肽、其免疫原性片段、以及上述任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAMP因子、脂肪酶、或唾液酸酶多肽或其片段用于免疫原性組合物中。在又一實(shí)施方案中，包含SEQ ID N0:2、3、7、9或11的多肽或其免疫原性片段用于制備免疫原性組合物。在又一實(shí)施方案中，包含編碼SEQ ID N0 2、3、7、9或11的多肽或其抗原性片段的多核苷酸的載體在施用至受試者的載體中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包括減毒細(xì)菌載體或減毒病毒載體。在又一實(shí)施方案中，抗原由植物或植物細(xì)胞表達(dá)。本公開還提供包含至少一種重組減毒細(xì)菌或病毒載體和ASM酶活性抑制劑的組合物，其中至少一種重組減毒細(xì)菌或病毒載體含有至少一種編碼選自CAMP因子、脂肪酶或唾液酸酶的一種或更多種痤瘡丙酸桿菌多肽的多核苷酸，由此多肽在至少一種重組減毒載體中表達(dá)。本公開還提供誘導(dǎo)受試者中保護(hù)性免疫的方法，包括向受試者施用上述組合物并使受試者與ASM酶抑制劑接觸。本公開還提供免疫保護(hù)性組合物，包含至少一種表達(dá)用于誘導(dǎo)抗痤瘡丙酸桿菌的免疫保護(hù)性反應(yīng)的抗原的減毒載體或植物制備物，包含痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞外或免疫原性蛋白質(zhì)或其免疫原性片段的所述抗原連接至轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，痤瘡丙酸桿菌蛋白質(zhì)或其片段選自CAMP因子、脂肪酶、唾液酸酶及其任意組合。本公開提供用于治療痤瘡丙酸桿菌感染的包含ASM酶抑制劑的組合物。在再一實(shí)施方案中，CAMP抗原或疫苗可用于與ASM酶抑制劑組合。在又一實(shí)施方案中，使用包含破裂的非傳染性痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞并且還包含ASM酶抑制劑的抗原性組合物。本公開提供治療痤瘡丙酸桿菌的方法，包括向受試者施用包含CAMP因子的疫苗和包含ASM酶抑制劑的組合物。


圖IA-B顯示注射痤瘡丙酸桿菌和表皮葡萄球菌(S. epidermidis)后耳炎癥和厚度。當(dāng)將ICR小鼠皮下注射25 μ 1痤瘡丙酸桿菌(IO8CFU)時(shí)觀察到耳炎癥(A)。向同一只小鼠的另一只耳內(nèi)注射25 μ 1 PBS沒(méi)有引起可見的炎癥。痤瘡丙酸桿菌(IO5至IO8CFU)和表皮葡萄球菌(108)皮下注射入小鼠皮膚內(nèi)。使用Peacock厚度計(jì)每天測(cè)量耳厚度，測(cè)量3 天(B)。測(cè)量每組兩只小鼠的耳朵。圖2A-F顯示痤瘡丙酸桿菌引起肉芽腫反應(yīng)并且寄居在毛囊根部。H&E染色表明， 向小鼠耳朵內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌(IO8CFU)I天增加耳厚度并且引起肉芽腫反應(yīng)(短箭頭) (B)0 PBS注射充當(dāng)對(duì)照(A)。肉芽腫反應(yīng)區(qū)域被Accustain革蘭氏染色劑染色(革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌染色試劑盒)(Sigma，St. Louis, MO)。在注射后1天，痤瘡丙酸桿菌(圓圈；染成紫色)被稠密填充的肉芽腫浸潤(rùn)物包圍(C)。在注射后1天毛囊中沒(méi)有積累痤瘡丙酸桿菌 (D)。然而，在注射后2天，痤瘡丙酸桿菌(圓圈和箭頭)移至毛囊并且寄居在毛囊根部(F)。 來(lái)自注射PBS 2天的小鼠的毛囊組織學(xué)用作對(duì)照(E)。標(biāo)尺100μπι。圖3A-C顯示組織室的植入以及組織室流體內(nèi)的吞噬細(xì)胞。在細(xì)菌注射前7天，將組織室(內(nèi)經(jīng)和外徑分別為1. 5和3mm，長(zhǎng)度Icm ；內(nèi)部體積80 μ 1)皮下植入至ICR小鼠的腹部皮膚(A)。組織室由閉合的聚四氟乙烯特氟隆圓筒構(gòu)成，帶有12個(gè)規(guī)則間隔的0. Imm 孔。標(biāo)尺1cm。H&E染色顯示在植入7天后，小鼠組織包住了組織室(B)。標(biāo)尺1. 0mm。 通過(guò)經(jīng)皮抽吸抽出組織室流體。離心后，浸潤(rùn)的細(xì)胞(吞噬細(xì)胞)以細(xì)胞核染料Hoechst 33258染色(C)。箭頭指示組織室內(nèi)的吞噬細(xì)胞。標(biāo)尺5μπι。圖4Α-Β顯示對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-2濃度的測(cè)定和組織室流體內(nèi)痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)。在植入組織室7天后，向組織室內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌(20μ1; IO7CFU)或PBS (20 μ 1)。在細(xì)菌注射3天后開展組織室流體取樣。對(duì)流體上清液中ΜΙΡ-2 的測(cè)量通過(guò)使用 Quantikine M mouse MIP-2 試劑盒(R&D System, Minneapolis, MN)的夾心ELISA開展(A)。通過(guò)將組織室流體涂布在MHB瓊脂平板上以定量CFU來(lái)檢測(cè)體內(nèi)的痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)(B)。圖5A-D顯示使用同位素編碼的蛋白質(zhì)標(biāo)簽(ICPL)對(duì)痤瘡丙酸桿菌蛋白質(zhì)組改變的定量分析CAMP因子和脂肪酶的鑒定。痤瘡丙酸桿菌在好氧和厭氧條件下生長(zhǎng)。來(lái)自好氧和厭氧生長(zhǎng)的痤瘡丙酸桿菌的裂解物(Img)分別以ICPL標(biāo)簽C12-N-煙酸氧基-琥珀酰亞胺(Nic-NHS)和C13-Nic-NHS標(biāo)記。裂解物中蛋白質(zhì)的所有賴氨酸側(cè)鏈被選擇性修飾。 在將C12-Nic-NHS標(biāo)記的樣品與C13-Nic-NHS標(biāo)記的樣品混合之后，用LTQ質(zhì)譜儀(Thermo Electron Corp. ffaltham,MA)對(duì)混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量。兩種標(biāo)簽的標(biāo)記引起質(zhì)譜圖中每一標(biāo)記部位6Da的質(zhì)量差異。鑒定了超過(guò)300種痤瘡丙酸桿菌蛋白質(zhì)。23種蛋白質(zhì)在厭氧或好氧條件下或者上調(diào)或者下調(diào)(表1)。顯示了具有兩倍電荷和3Da質(zhì)量差異的分泌性毒力因子(脂肪酶和CAMP因子)(A和B)。在缺氧條件下，痤瘡丙酸桿菌中兩種毒力因子均具有更高表達(dá)。兩種肽(SYSEKHLGVAFR(SEQ ID NO 1)和 DLLKAAFDLR(SEQ ID NO :2)) 被測(cè)序并分別指定為脂肪酶(C)和CAMP因子(D)的內(nèi)部肽。圖6A-G顯示通過(guò)唾液酸酶去除唾液酸提高人皮脂腺細(xì)胞對(duì)痤瘡丙酸桿菌的易感性。永生化人皮脂腺細(xì)胞(SZ%)細(xì)胞表面上的唾液酸通過(guò)與生物素化朝鮮槐(Maackia Amurensis,AA)凝集素I (10 μ g/ml)和鏈親和素-FITC綴合物反應(yīng)檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)FITC-熒光強(qiáng)度以反應(yīng)唾液酸水平(A)。以PBS (媒介物)、唾液酸酶(10 μ g/ml)(綠色， Α)或GFP (10 μ g/ml) (B)于pH 6預(yù)處理皮脂腺細(xì)胞2小時(shí)。在唾液酸酶處理的皮脂腺細(xì)胞中FITC-熒光強(qiáng)度的降低表明純的唾液酸酶是效應(yīng)酶。在唾液酸酶(10yg/ml，2小時(shí))預(yù)處理后，皮脂腺細(xì)胞與痤瘡丙酸桿菌(107CFU/106細(xì)胞)共培養(yǎng)M小時(shí)。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)在媒介物、唾液酸酶或GFP處理的皮脂腺細(xì)胞中痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(C)。在洗掉懸浮的痤瘡丙酸桿菌之后，附著在皮脂腺細(xì)胞上的痤瘡丙酸桿菌的數(shù)量通過(guò)將胰蛋白酶作用的皮脂腺細(xì)胞涂布在MHB瓊脂平板上計(jì)算，以定量CFU/細(xì)胞(D)。通過(guò)用Accustain 革蘭氏染色試劑盒進(jìn)行染色可見痤瘡丙酸桿菌向媒介物(E)、唾液酸酶(F，箭頭)或GFP(G) 處理的皮脂腺細(xì)胞內(nèi)的粘附。圖7A-C顯示當(dāng)小鼠以基于大腸桿菌載體的疫苗或者重組蛋白/弗氏(不)完全佐劑免疫時(shí)唾液酸酶是免疫原性的。通過(guò)向pEcoli-Nterm 6xHN載體(Clontech)中插入唾液酸酶的PCR產(chǎn)物構(gòu)建受照射的基于大腸桿菌載體的疫苗(大腸桿菌BL21 (DE3)T7/lac0 唾液酸酶)。通過(guò)疫苗接種后6周的western印跡分析檢測(cè)大腸桿菌載體(IO9CFU)免疫小鼠中抗體的產(chǎn)生(A)。以大腸桿菌空載體(IacZ)免疫的小鼠充當(dāng)陰性對(duì)照。還使用弗氏/ (不)完全佐劑以重組唾液酸酶-6xNH融合蛋白或GFP免疫ICR小鼠。對(duì)于第一次注射時(shí)的皮下疫苗接種，以用完全弗氏佐劑乳化的200μ g唾液酸酶-6xNH融合蛋白或GFP接種小鼠。注射兩周后開展第二次注射。以與不完全弗氏佐劑充分泥合的相同量的抗原向小鼠肌內(nèi)注射。在第二次疫苗接種一周后通過(guò)western印跡(B)和抗原微陣列(C)檢測(cè)抗唾液酸酶抗體。將0. 35 μ g純化的唾液酸酶-6xNH融合蛋白和所標(biāo)明的IgG兩次點(diǎn)在抗原微列陣上。數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)小鼠以基于大腸桿菌載體的疫苗和重組蛋白/弗氏佐劑免疫時(shí)引起唾液酸酶抗體。圖8顯示基于唾液酸酶的疫苗對(duì)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的耳厚度的保護(hù)性免疫。使用弗氏(不)完全佐劑以重組唾液酸酶-6xNH融合蛋白或GFP免疫ICR小鼠。通過(guò)western 印跡證實(shí)抗體產(chǎn)生之后，將痤瘡丙酸桿菌(IO7CFU, 25 μ 1)皮下注射入唾液酸酶和GFP免疫小鼠的耳內(nèi)。注射PBS(25yl)充當(dāng)對(duì)照。注射后測(cè)量耳厚度9天并且計(jì)算為％ PBS注射耳的耳厚度。圖9顯示體外的抗唾液酸酶抗血清。痤瘡丙酸桿菌與抗唾液酸酶抗血清預(yù)孵育2 小時(shí)。永生化的人皮脂腺細(xì)胞(SZ-%)與抗血清處理的痤瘡丙酸桿菌共培養(yǎng)18小時(shí)。在孵育之后，使用PNPP測(cè)定由痤瘡丙酸桿菌的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的皮脂腺細(xì)胞的細(xì)胞死亡。永生化人皮脂腺細(xì)胞系SZ95培養(yǎng)在96孔板上直到2 X IO5細(xì)胞/孔的密度，培養(yǎng)在補(bǔ)充有5ng/ ml人重組表皮生長(zhǎng)因子(Sigma, St. Louis, MO) ,10% (v/v)熱滅活胎牛血清(Mediatech Inc. ,Herndon,VA)的 kbomed 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Biochrom，Berlin，德國(guó))中，在空氣中 5% (ν/ ν) CO2的環(huán)境下于37°C進(jìn)行。痤瘡丙酸桿菌如上所述培養(yǎng)，通過(guò)離心法用PBS洗滌。將痤瘡丙酸桿菌懸浮于包含25% (ν/ν)抗唾液酸酶或抗GFP (對(duì)照)抗血清的Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并于37°C孵育2小時(shí)。皮脂腺細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后與包含2 X IO6CFU痤瘡丙酸桿菌和2. 5 μ 1抗血清的100 μ 1中和反應(yīng)混合物孵育18小時(shí)。作為對(duì)照，加入等量的PBS 代替痤瘡丙酸桿菌。作為背景，加入Triton-X達(dá)到0.1% (ν/ν)的終濃度以殺死皮脂腺細(xì)胞。在孵育后，使用對(duì)硝基苯磷酸二鈉(PNPP)檢測(cè)中和混合物的細(xì)胞毒性。皮脂腺細(xì)胞用 PBS洗滌3次并且與100 μ 1的ACPI中的2. 5% (w/v)pNPP于37°C孵育1小時(shí)。孵育后，加入10μ 1的IN NaOH以停止反應(yīng)并且測(cè)量405nm處的吸光度。中和混合物的細(xì)胞毒性計(jì)算為(無(wú)痤瘡丙酸桿菌組-痤瘡丙酸桿菌添加組)+ (無(wú)痤瘡丙酸桿菌組-背景組)X 100。圖10A-F顯示滅活的痤瘡丙酸桿菌疫苗的保護(hù)性免疫。ICR小鼠以熱殺死的痤瘡丙酸桿菌(IO8CFU)免疫并且以三周的間隔加強(qiáng)免疫兩次。免疫10周(第二次加強(qiáng)免疫一周)后，將活的痤瘡丙酸桿菌(IO7CFU, 25 μ 1)或PBS (25 μ 1)皮下注射入殺死的痤瘡丙酸桿菌免疫的和PBS接種的小鼠的耳內(nèi)。耳厚度計(jì)算為％ PBS注射耳的耳厚度(A)。在活的痤瘡丙酸桿菌注射M (B，C)和72小時(shí)(D，Ε)后，顯示殺死的痤瘡丙酸桿菌免疫的(B，D)和 PBS接種的(C，Ε)小鼠的耳朵發(fā)紅。通過(guò)夾心ELISA開展對(duì)流體上清液中ΜΙΡ-2的測(cè)量。 在殺死的痤瘡丙酸桿菌免疫小鼠內(nèi)，由痤瘡丙酸桿菌(20 μ 1 ；IO7CFU)注射誘導(dǎo)的ΜΙΡ-2升高被相當(dāng)大地抑制(F)。圖11顯示痤瘡丙酸桿菌CAMP因子的表征。(A)重組痤瘡丙酸桿菌CAMP因子在大腸桿菌中表達(dá)(短箭頭)。以包含編碼CAMP因子的cDNA插入片段的pEcoli-Nterm 6XHN 載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不與(泳道1)或與(泳道^IPTG孵育，被破壞并通過(guò)SDS-PAGE(10% 丙烯酰胺)分離。純化的CAMP因子顯示在右圖中。(B) CAMP因子的表達(dá)和純度通過(guò)NanoLTQ MS/MS質(zhì)譜分析法證實(shí)。呈現(xiàn)了測(cè)序的CAMP因子的內(nèi)部肽(AVLLTANPASTAK ;SEQ ID NO: 3))。(C)在綿羊血液瓊脂平板上檢查重組CAMP因子的共溶血活性。金黃色葡萄球菌菌株 113(2X105CFU/10y 1)劃線于瓊脂平板上。將IOy 1重組CAMP因子g/ml)或作為對(duì)照蛋白質(zhì)的GFPQ50yg/ml)點(diǎn)在金黃色葡萄球菌劃線的旁邊。⑶通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)CAMP因子在ICR小鼠中的免疫原性。將小鼠鼻內(nèi)接種過(guò)表達(dá)CAMP因子或GFP的UV殺死的大腸桿菌。在疫苗接種14天后將小鼠放血?？笴AMP因子(1 2000稀釋；泳道1和 2)或抗GFP抗血清(泳道3和4)與重組CAMP因子(0. 2 μ g ；泳道1和3)或GFP (泳道2 和4)反應(yīng)。使用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP綴合物檢測(cè)免疫反應(yīng)性。(E)通過(guò)ELISA測(cè)定 CAMP因子抗體的滴度。在用CAMP因子或GFP疫苗接種14和21天后將小鼠(n = 10)放血。 抗血清(1 10000稀釋)與固定在微量滴定ELISA板上的CAMP因子反應(yīng)。用山羊抗小鼠 IgG (H+L) -HRP綴合物和OptEIA 試劑盒檢測(cè)所收集的抗體。在450nm處測(cè)量每一孔的光密度。水平線表示10個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值。(F)通過(guò)Western印跡檢測(cè)痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)上清液中的CAMP因子。作為陽(yáng)性對(duì)照的重組CAMP因子(0. 2μ g ；泳道1)、10倍濃縮的痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)上清液(70 μ g總蛋白；泳道2、和作為陰性對(duì)照的10倍濃縮的RCM(70 μ g總蛋白；泳道3)通過(guò)SDS-PAGE(10%丙烯酰胺)分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上并且與小鼠抗 CAMP因子抗血清(1 1000稀釋，左圖)或抗GFP抗血清(右圖)反應(yīng)。在上樣至SDS-PAGE 內(nèi)之前，通過(guò)腸激酶去除重組CAMP因子的6 XHN標(biāo)簽。(G)在人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT) 或鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(RA\^64. 7)中檢查重組CAMP因子的細(xì)胞毒性。細(xì)胞(1X105/孔)與標(biāo)明濃度的重組CAMP因子或GFP于37°C孵育18小時(shí)。孵育后，如在方法中所描述測(cè)定細(xì)胞生存力并計(jì)算細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE (n = 6，通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)與GFP對(duì)照相比P < 0. 005"和？ < 0. 0005***)。(H)真皮內(nèi)注射CAMP因子誘導(dǎo)ICR小鼠耳內(nèi)的炎癥反應(yīng)。左耳真皮內(nèi)注射PBS中的重組CAMP因子(1(^8/2(^1)或6 (1(^8/2(^1)。右耳接受等量的PBS (20 μ 1)。在注射M小時(shí)后用微卡尺測(cè)量耳厚度并且變化記錄為％ PBS注射耳的耳厚度。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE (n = 4，通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)ρ < 0. 005，。圖12A-C顯示細(xì)菌CAMP因子和宿主ASM酶參與痤瘡丙酸桿菌的體外致病性。(A) 在與痤瘡丙酸桿菌共培養(yǎng)后，通過(guò)Wfestern印跡檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的CAMP因子和ASM 酶。HaCaT (泳道1和3)或RAW264. 7 (泳道2和4) (5 X IO5/孔)與痤瘡丙酸桿菌(5 X IO6CFU/ 孔；MOI = 1 10)(泳道1和2)或不與痤瘡丙酸桿菌(泳道3和4)在無(wú)血清培養(yǎng)基中于 37°C共培養(yǎng)14小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液的濃縮物(10 μ g總蛋白)進(jìn)行Western印跡。分別以小鼠抗CAMP因子抗血清和山羊抗ASM酶IgG檢測(cè)CAMP因子和ASM酶。(B)通過(guò)抗CMAP 因子抗血清體外中和痤瘡丙酸桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。HaCaT或7細(xì)胞(IX IO5/孔) 與痤瘡丙酸桿菌(IX IOfiCFU/孔；MOI = 1 10)在小鼠抗CAMP因子或抗GFP抗血清O. 5% ν/ν)存在下共培養(yǎng)14小時(shí)。(C)加入ASM酶抑制劑在體外減少了痤瘡丙酸桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。HaCaT或7細(xì)胞(1 X IO5/孔)不與或者與痤瘡丙酸桿菌(1 X IO6CFU/孔， MOI = 1 10)在包含選擇性ASM酶抑制劑地昔帕明(10 μ M)或者等量PBS (媒介物)的培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)14小時(shí)。孵育后，如材料與方法中所述測(cè)定細(xì)胞生存力和計(jì)算細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE (n = 10，通過(guò)Student t檢驗(yàn)ρ < 0. 05*和ρ < 0. 0005***)。圖13A-D顯示宿主ASM酶可能參與痤瘡丙酸桿菌體內(nèi)致病性。㈧在細(xì)菌刺激M 小時(shí)后，小鼠耳內(nèi)的可溶性ASM酶量增加。向ICR小鼠的耳真皮內(nèi)注射PBS中的痤瘡丙酸桿菌(lX107CFU/20l·! 1 ；左耳)或PBS (20 μ 1 ；右耳)，并在M小時(shí)后切下。使用8mm活組織檢查得到耳組織并在PBS中勻漿。將上清液(Iyg總蛋白)進(jìn)行Western印跡。用山羊抗ASM酶IgG接著用抗GAPDH IgG檢測(cè)ASM酶(上圖)和GAPDH(下圖)(左圖)。正常山羊或者小鼠IgG用作檢測(cè)的陰性對(duì)照(右圖)。(B)痤瘡丙酸桿菌在小鼠內(nèi)的刺激吸引高度表達(dá)ASM酶的⑶lib+巨噬細(xì)胞。在細(xì)菌刺激M小時(shí)后得到的小鼠耳的冰凍切片用生物素化抗小鼠⑶lib IgG,即一種常規(guī)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，和TRITC鏈親和素綴合物，然后用山羊抗ASM酶IgG和抗山羊IgG-TRITC綴合物染色。細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。標(biāo)尺 =200 μ m. (C)透射電子顯微鏡(10000X放大倍數(shù))用于呈現(xiàn)以痤瘡丙酸桿菌或PBS注射的小鼠耳中寄居的痤瘡丙酸桿菌和破裂的細(xì)胞膜。PA，痤瘡丙酸桿菌；CM，細(xì)胞膜；NC，細(xì)胞核。標(biāo)尺=Ium0 (D)用選擇性ASM酶抑制劑全身性預(yù)處理ICR小鼠減輕痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥。在細(xì)菌刺激前30分鐘向ICR小鼠腹膜內(nèi)注射地昔帕明O0mg/kg小鼠)或者等量PBS(媒介物)。在預(yù)處理之后，分別將PBS中的活痤瘡丙酸桿菌(lX107CFU/20yl)或等量的PBS (對(duì)照)真皮內(nèi)注射入左耳或右耳。在細(xì)菌刺激前和細(xì)菌刺激M小時(shí)后使用微卡尺測(cè)量耳厚度，并且將變化記錄為％ PBS注射耳的耳厚度。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE (n = 3，通過(guò) Mudent t 檢驗(yàn) ρ < 0. 005**)。圖14顯示CAMP因子疫苗和局部注射抗ASM酶IgG的組合協(xié)同抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥。ICR小鼠用UV殺死的過(guò)表達(dá)CAMP因子或GFP的大腸桿菌以3周的間隔進(jìn)行接種。在第二次加強(qiáng)接種2周后，以與上述相同的方式將痤瘡丙酸桿菌真皮內(nèi)注射入已接種疫苗小鼠的耳內(nèi)。在30分鐘內(nèi)，左耳(已接受痤瘡丙酸桿菌)注射PBS中的山羊抗ASM 酶IgGQy g/20 μ 1)或正常山羊IgG (對(duì)照)，并且右耳注射等體積的PBS (n = 8)。在細(xì)菌刺激M小時(shí)后測(cè)量耳厚度并將變化記錄為％ PBS注射耳的耳厚度。數(shù)據(jù)表示為平均值士 SE (通過(guò) Student t 檢驗(yàn) ρ < 0. 05*，ρ < 0. 005**，ρ < 0. 0005***)。圖15A-C顯示基于CAMP因子的疫苗對(duì)小鼠內(nèi)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥的影響。(A)真皮內(nèi)注射CAMP因子誘導(dǎo)ICR小鼠耳內(nèi)的炎癥反應(yīng)。左耳真皮內(nèi)注射PBS中的重組 CAMP因子(10yg/20yl)或GFP(10yg/20yl)。右耳接受相同量的PBS (20 μ 1)。在注射 24小時(shí)后使用微卡尺測(cè)量耳厚度并將變化記錄為％ PBS注射耳的耳厚度。數(shù)據(jù)表示為平均值士 SE (n = 4，通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)P < 0. 005**)。(B) CAMP因子抗體的滴度通過(guò)ELISA 測(cè)定。在以CAMP因子疫苗接種14和21天后將小鼠放血(n = 10)?？寡?1 10000稀釋度)與固定在微量滴定ELISA板上的CAMP因子反應(yīng)。用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP綴合物和OptEIA 試劑盒檢測(cè)所收集的抗體。測(cè)量各孔在450nm處的光密度。橫線表示10個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值。(C)用CAMP因子單獨(dú)免疫ICR小鼠提供了抗痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)炎癥的治療性免疫。將PBS中的活痤瘡丙酸桿菌(lX107CFU/20yl)或者等量PBS(對(duì)照)分別地真皮內(nèi)注射入稚小鼠的左耳或右耳內(nèi)。在M小時(shí)后，將小鼠以UV殺死的過(guò)表達(dá)CAMP 因子或GFP的大腸桿菌(箭頭)鼻內(nèi)免疫。在標(biāo)明的細(xì)菌刺激后的時(shí)間測(cè)量耳厚度并將變化記錄為％ PBS注射耳的耳厚度。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE (η = 10，通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)P < 0. 05*, P < 0. 005**, P < 0. 0005***)。圖16A-B顯示CAMP因子和細(xì)菌SM酶的體外共細(xì)胞毒性特性。HaCaT (A)或 RAW264. 7細(xì)胞(B)以來(lái)自金黃色葡萄球菌的SM酶(350mU/ml)或等量媒介物預(yù)處理15分鐘，洗滌三次以去除酶，然后與重組CAMP因子(25μβ/πι1)或GFP于37°C孵育18小時(shí)。孵育后，測(cè)定細(xì)胞生存力并且計(jì)算細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE(n = 6，通過(guò)Mudent t 檢驗(yàn) ρ < 0. 0005***)。圖17A-B顯示痤瘡丙酸桿菌CAMP因子施加毒力活性。ICR小鼠的耳真皮內(nèi)注射重組GFP (左耳)和CAMP因子(右耳)。(A)在注射M小時(shí)后可見誘導(dǎo)炎癥的耳發(fā)紅(箭頭)。(B)在GFP(I，iii)或CAMP因子(ii，iv)注射耳的H&E染色的冰凍組織切片中觀察到耳腫脹。放大的圖像WX(i，iii)和20X(ii，iv)]表明破裂紅細(xì)胞的沉積(短箭頭)。 標(biāo)尺(a) = Icm0 標(biāo)尺[b (I, iii) ] = 2mm。標(biāo)尺[b (ii, iv) ] = 0. 5mm。圖18A-D顯示在蘿卜葉中瞬時(shí)表達(dá)CAMP因子和⑶S。(a)蘿卜(萊菔(Raphanus sativus L.))葉以轉(zhuǎn)化:35S: GUS構(gòu)建體的根癌土壤桿菌(Atumefaciens) (LBA4404菌株) 浸潤(rùn)(右)。以非轉(zhuǎn)化的LBA4404細(xì)胞浸潤(rùn)的葉子(左)充當(dāng)陰性對(duì)照。虛線圈標(biāo)明注射浸潤(rùn)根癌土壤桿菌的部位。藍(lán)色染色區(qū)域表明GUS表達(dá)。通過(guò)(b)組織化學(xué)和(C)GUS 活性測(cè)定分析浸潤(rùn)后1至5天的蘿卜葉中的⑶S表達(dá)的動(dòng)態(tài)模式。(通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)*P < 0. 05和**P < 0. 005)。(d)通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)CAMP因子表達(dá)。磨碎的以攜帶!35S: :CAMP 因子-His (CAMP 因子-His)、35S: SCAP-MBP-His (SCAP-MBP-His)或重組 ⑶S(r⑶S)的根癌土壤桿菌浸潤(rùn)的蘿卜葉(20 μ g)在10% (w/v) SDS-PAGE分離并印跡在硝酸纖維素膜上。然后用以UV輻射的過(guò)表達(dá)CAMP因子的大腸桿菌BL21(DE3)免疫的小鼠所產(chǎn)生的抗CAMP血清探測(cè)膜。箭頭標(biāo)明在^kDa分子量處出現(xiàn)的CAMP因子。標(biāo)尺=6mm。圖19顯示以包入CAMP因子的葉免疫的小鼠產(chǎn)生CAMP因子特異性抗體。純化的 CAMP因子(65 μ g)在10% (w/v) SDS-PAGE上分離，印跡在硝酸纖維素膜上并與從以葉包封的GUS(左)或CAMP因子(右)免疫的小鼠得到的血清免疫反應(yīng)。具有^kDa的單一條帶指示與來(lái)自CAMP因子免疫小鼠的血清反應(yīng)的純化的CAMP因子，證實(shí)了 CAMP因子的免疫原性。圖20A-C顯示以抗CAMP因子的中和抗體被動(dòng)免疫小鼠減少了痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥。㈧如“材料與方法”中所述，5% (ν/ν)抗GUS(空?qǐng)A圈)或抗CAMP因子(實(shí)圓圈)血清處理的痤瘡丙酸桿菌(IXlO7CFU)接種在ICR小鼠的右耳內(nèi)以引起耳厚度增加。 作為對(duì)照，將等體積的PBS注射入同一小鼠的左耳。在細(xì)菌注射后的指定時(shí)間使用微卡尺測(cè)量耳厚度。痤瘡丙酸桿菌注射耳的耳厚度計(jì)算為％ PBS注射對(duì)照。誤差線表示4只小鼠的平均值士 SE (通過(guò)Mudent t檢驗(yàn)呷< 0. 005)。(B)在注射抗⑶S血清(i)或抗CAMP 因子(ii)血清處理的痤瘡丙酸桿菌(IO7CFU) 3天后可見耳發(fā)紅(箭頭)。標(biāo)尺=Icm0 (C) 在單獨(dú)注射PBS (i，iv)或注射以抗⑶S (ii，ν)或抗CAMP因子(iii，vi)血清處理的痤瘡丙酸桿菌的耳朵的H&E染色的冰凍組織切片中觀察到耳炎癥。在4X(i，ii, iii;標(biāo)尺= 2mm)和20X (iv, ν, vi ；標(biāo)尺=0. 5mm)放大倍數(shù)下可見肉芽腫反應(yīng)(短箭頭)。圖21A-C顯示被動(dòng)中和痤瘡丙酸桿菌CAMP因子減少促炎MIP-2細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)菌寄居，而不改變痤瘡丙酸桿菌在身體其它部位的存活。(A)通過(guò)夾心ELISA使用 Quantikine M小鼠MIP-2試劑盒開展對(duì)促炎MIP-2細(xì)胞因子的測(cè)量。與用抗⑶S血清的中和(空心柱)相比，用抗CAMP因子血清的被動(dòng)中和(實(shí)心柱)明顯抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的MIP-2增加。(B)在抗⑶S血清(空心柱)或抗CAMP因子血清(實(shí)心柱)存在下，小鼠左耳注射痤瘡丙酸桿菌(IXlO7CFU)t5 (C)右耳僅注射活的痤瘡丙酸桿菌(IXlO7CFU)t5如 “材料與方法”中所述，在瓊脂平板上定量細(xì)菌的寄居(CFU)。誤差線表示4只小鼠的平均值士 SE (*P < 0. 05，通過(guò) Mudent t 檢驗(yàn))。圖22顯示以CAMP因子進(jìn)行疫苗接種對(duì)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的耳腫脹賦予保護(hù)性作用。在接種GUS-(空心柱)和CAMP因子(實(shí)心柱)7周后，以過(guò)夜懸浮于PBS中的活痤瘡丙酸桿菌的25 μ 1量的等分試樣(IXlO7CFU)真皮內(nèi)注射入右耳以刺激小鼠。作為對(duì)照， 25μ1的PBS注射入同一小鼠的左耳。在細(xì)菌刺激后用微卡尺測(cè)量耳厚度的增加。痤瘡丙酸桿菌刺激耳的耳厚度的增加計(jì)算為％ PBS注射對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本文提供的示例性描述僅是示例性的和解釋性的并且不限制如所要求專利保護(hù)的本發(fā)明。此外，本發(fā)明不限于所描述的特定實(shí)施方案，照此本發(fā)明當(dāng)然會(huì)變化。此外，用于描述特定實(shí)施方案的術(shù)語(yǔ)不旨在是限制性的。至于數(shù)值的范圍，除非語(yǔ)境清楚地另外指出，本發(fā)明包括范圍上限和下限之間的每一間插數(shù)值至至少下限單位的十分之一。此外，本發(fā)明包括任何其他陳述的間插數(shù)值。此外，本發(fā)明還包括除了范圍上限和下限任一或者兩者的范圍，除非根據(jù)陳述的范圍明確排除。除非另外定義，本文中所使用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義是本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的那些含義。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。此外，本文提到的所有出版物通過(guò)參考并入本文。必須注意的是，如本文后附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“a”和“the”包括復(fù)數(shù)形式，除非語(yǔ)境明確另外指出。因此，例如，提到“多肽”包括多種此類多肽并且提到“細(xì)菌” 包括一種或更多種細(xì)菌和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。同樣，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外說(shuō)明。類似地，“包含”、“包含著”、“包含的”、“包括”、“包括著”和“包括的”可互換并且不旨在是限制性的。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“包含”描述多個(gè)實(shí)施方案時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員
將理解，在一些特定情況下，實(shí)施方案可以備選地使用語(yǔ)言“基本上由......組成”或
“由......組成”描述。痤瘡丙酸桿菌參與許多種人多種微生物疾病，包括尋常痤瘡、心內(nèi)膜炎、眼內(nèi)炎、 骨髓炎、關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)和顱神經(jīng)外科感染、和植入的生物材料的污染。在美國(guó)有超過(guò)五千萬(wàn)人具有尋常痤瘡。此外，尋常痤瘡是有些時(shí)候在他們的生活中影響85-100%的人的最常見皮膚病。對(duì)于痤瘡損害的全身抗生素治療非特異性地殺死大多數(shù)皮膚細(xì)菌，這影響了皮膚寄居菌落的穩(wěn)態(tài)。在本公開之前，還不能得到針對(duì)尋常痤瘡和痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)疾病的疫苗。本公開提供抗痤瘡丙酸桿菌疫苗以抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的皮膚炎癥。在微粉刺中開始痤瘡丙酸桿菌的增殖，這是痤瘡損害的前兆，痤瘡損害表征為角質(zhì)過(guò)度、角質(zhì)栓形成和皮脂腺分泌皮脂增加。微粉刺提供毛囊中的缺氧、皮脂豐富的微環(huán)境，這促進(jìn)了痤瘡丙酸桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)。痤瘡炎癥中的最初事件是毛囊上皮被這種痤瘡丙酸桿菌過(guò)度生長(zhǎng)破壞，使得細(xì)菌在粉刺中與宿主免疫系統(tǒng)接觸，觸發(fā)肉芽腫炎癥(典型的炎癥性痤瘡)。痤瘡丙酸桿菌通過(guò)toll樣受體2刺激促炎細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1 β、 白細(xì)胞介素_8、白細(xì)胞介素-12和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生。尋常痤瘡是可導(dǎo)致與痤瘡丙酸桿菌感染高度相關(guān)嚴(yán)重炎癥損害的最常見皮膚疾病之一。已經(jīng)公認(rèn)表皮葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌是導(dǎo)致形成尋常痤瘡的主要皮膚細(xì)菌。此外，這些細(xì)菌具有合成脂肪酶的能力，脂肪酶將皮脂甘油三酯降解成觸發(fā)炎癥反應(yīng)的游離脂肪酸。治療痤瘡應(yīng)該盡可能早地開始以便使結(jié)疤的風(fēng)險(xiǎn)和不利的心理影響最小化。許多抗生素已經(jīng)用于痤瘡治療，但是這些抗生素一般是非特異性的，持續(xù)時(shí)間短并且常常當(dāng)痤瘡損害已經(jīng)發(fā)生時(shí)(例如在痤瘡?fù)砥?應(yīng)用。如本文所述，抗痤瘡疫苗的開發(fā)可防止早期階段痤瘡的進(jìn)展和提高治療的特異性，如本文所述。尋常痤瘡是與多種微生物感染、激素調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)相關(guān)的多因子疾病。尋常痤瘡的炎癥階段通常是患者最憂慮的。炎癥損害可導(dǎo)致結(jié)疤和不良的心理影響。選擇性抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥的疫苗將使改變身體激素和寄生的皮膚微生物穩(wěn)態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)最小化。溶血作用是被眾多細(xì)菌病原體采用以降解、侵入宿主細(xì)胞并且抵抗宿主免疫攻擊的毒力因子。這通過(guò)靶向細(xì)胞膜的多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)酶促的、形成孔或者表面活性劑。當(dāng)痤瘡丙酸桿菌在綿羊血液瓊脂平板上與β-溶血微生物，例如金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌靠近生長(zhǎng)時(shí)，其協(xié)同性地增強(qiáng)溶血作用，類似于典型的Christie，Atkins, Munch-Peterson (CAMP)。CAMP反應(yīng)通過(guò)形成孔的毒素CAMP因子共溶血素與來(lái)自于其它細(xì)菌配偶體的鞘磷脂酶(SM酶)的組合誘導(dǎo)。CAMP因子本身對(duì)紅細(xì)胞僅具有弱的溶血活性，但是用SM酶預(yù)處理細(xì)胞增強(qiáng)其活性。SM酶最初水解紅細(xì)胞細(xì)胞膜上的鞘磷脂形成神經(jīng)酰胺，這使得細(xì)胞對(duì)CAMP因子的溶血活性易感。痤瘡丙酸桿菌的整個(gè)基因組序列包括許多其產(chǎn)物參與降解宿主分子的基因，并且已經(jīng)在基因組信息中發(fā)現(xiàn)5個(gè)編碼無(wú)乳鏈球菌 (S. agalactiae)CAMP因子同系物的基因。這種通過(guò)與NanoLC-MS分析偶聯(lián)的使用同位素編碼的蛋白質(zhì)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)痤瘡丙酸桿菌的全面分析顯示，與好氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌相比，在缺氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌以更高的濃度產(chǎn)生與無(wú)乳鏈球菌CAMP因子顯示具有42%的核苷酸序列同一性的CAMP因子同系物之一(登錄號(hào)gi/50842175，通過(guò)參考并入本文)。這些數(shù)據(jù)表明了 CAMP因子對(duì)于痤瘡丙酸桿菌的生理意義。來(lái)自無(wú)乳鏈球菌的CAMP因子結(jié)合IgG和IgM分子的Fc區(qū)，這類似于IgG與金黃色葡萄球菌蛋白A的結(jié)合(Jurgens等，1987)，并且已經(jīng)證明了無(wú)乳鏈球菌CAMP因子蛋白質(zhì)與金黃色葡萄球菌蛋白A之間的部分氨基酸序列相似性(Ruhlmarm等，1988)。證據(jù)表明痤瘡丙酸桿菌IA、IB和II型之間在與CAMP共溶血素具有序列相似性的蛋白質(zhì)表達(dá)方面具
有差異。本公開證明痤瘡丙酸桿菌分泌CAMP因子，已知其與細(xì)菌鞘磷脂酶(SM酶)協(xié)同作用溶解紅細(xì)胞。此外，本公開證明重組痤瘡丙酸桿菌CAMP因子單獨(dú)地以劑量依賴方式誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)和鼠巨噬細(xì)胞(RAW^647)細(xì)胞系的細(xì)胞死亡。例如，向小鼠耳真皮內(nèi)注射CAMP因子誘導(dǎo)明顯的耳腫脹。此外，當(dāng)細(xì)胞與痤瘡丙酸桿菌共培養(yǎng)時(shí)，宿主酸性SM酶(ASM酶)從HaCaT和7細(xì)胞釋放/分泌。通過(guò)包含選擇性ASM酶抑制劑、 抗ASM酶抗體或者抗CAMP因子抗血清可明顯中和兩種細(xì)胞系中的痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。向小鼠耳真皮內(nèi)注射活痤瘡丙酸桿菌吸引眾多強(qiáng)烈表達(dá)ASM酶的巨噬細(xì)胞，這導(dǎo)致在痤瘡丙酸桿菌刺激后耳內(nèi)的可溶性ASM酶增加。最值得注意的是，以CAMP因子疫苗接種ICR小鼠得到抗痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)炎癥和皮膚損害發(fā)展的保護(hù)性免疫。此外，疫苗接種 CAMP因子與局部注射抗ASM酶IgG的組合協(xié)同性減少痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的耳腫脹。這些數(shù)據(jù)表明，痤瘡丙酸桿菌從宿主酶中受益，這擴(kuò)大了它們的致病性；痤瘡丙酸桿菌可利用宿主 ASM酶增強(qiáng)其CAMP因子的毒性，這促成其逃避宿主免疫防御，降解宿主組織和傳播病原體。痤瘡丙酸桿菌的完整基因組序列是已知的并且其全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考并入本文。本公開鑒定了毒力因子并且提供能夠提供抗痤瘡丙酸桿菌保護(hù)性免疫的一組疫苗。其它毒力因子和抗原性組合物將是顯而易見的并且包括在本公開內(nèi)。特別地，如在表1中所鑒定的在缺氧條件下上調(diào)的抗原是基于本文技術(shù)開發(fā)疫苗的靶標(biāo)。本公開通過(guò)比較在缺氧和好氧條件下痤瘡丙酸桿菌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)建立了痤瘡丙酸桿菌的蛋白質(zhì)組(見實(shí)施例和表 1)。該分析揭示了被上調(diào)的許多基因。本公開進(jìn)一步提供了與痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞損傷和炎癥相關(guān)的三種分泌性毒力因子(CAMP因子、脂肪酶和唾液酸酶)的額外資料。本公開提供的抗痤瘡丙酸桿菌疫苗使患有多微生物痤瘡丙酸桿菌相關(guān)疾病，包括尋常痤瘡、心內(nèi)膜炎、眼內(nèi)炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)和顱神經(jīng)外科感染以及植入的生物材料污染的受試者受益。除了充當(dāng)疫苗靶標(biāo)之外，三種分泌性毒力因子(CAMP因子、脂肪酶和唾液酸酶)以及殺死的痤瘡丙酸桿菌充當(dāng)開發(fā)抗痤瘡丙酸桿菌藥物的候選物。例如，基于本公開，鑒定用于治療微生物感染的治療劑的方法可以包括從蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)鑒定至疫苗評(píng)價(jià)的方法。本公開提供了用于使用鑒定的分泌性毒力因子研究功能蛋白質(zhì)組學(xué)和疫苗/藥物產(chǎn)生的平臺(tái)。例如，本公開提供靶向分泌性CAMP因子、脂肪酶和唾液酸酶以及來(lái)自殺死的痤瘡丙酸桿菌的抗原的抗痤瘡丙酸桿菌疫苗。體外和體內(nèi)均證明了本公開的疫苗。疫苗減少痤瘡丙酸桿菌引起的炎癥。本公開進(jìn)一步證明，靶向分泌性毒力因子是減少痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥的有效策略。
本公開的疫苗可以單獨(dú)使用或者與全身性抗生素治療一起使用?！岸嗪塑账帷蓖ǔＶ溉魏味嗪颂呛塑账?RNA)或者多脫氧核糖核苷酸(DNA)，其可以是未修飾的或者修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA、以及為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的RNA。多核苷酸還包括包含DNA和RNA的雜合分子，DNA和RNA是單鏈的或者更有代表性的是雙鏈的或者單鏈和雙鏈區(qū)泥合物。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或者RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。多核苷酸還包括包含一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的多個(gè)DNA或RNA和帶有為了穩(wěn)定性原因或者其它原因修飾的主鏈的多個(gè)DNA或RNA?！靶揎椀摹眽A基包括，例如，三苯甲基化堿基和稀有堿基例如肌苷?？梢詫?duì)DNA和RNA進(jìn)行多種修飾；因此，“多核苷酸”包含化學(xué)、酶促或代謝修飾形式的多核苷酸，如有代表性地在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣，以及化學(xué)形式的DNA和RNA特征性的病毒和細(xì)胞。寡核苷酸是相對(duì)短的多核苷酸。用于本公開方法產(chǎn)生抗原以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的多核苷酸實(shí)例包括表1中那些，包括編碼抗原性表位的其片段。
權(quán)利要求
1.免疫原性組合物，包含基本上純化的包括表1中所指出序列的多肽、其免疫原性片段和前述的任何組合。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，包含CAMP因子、脂肪酶或唾液酸酶多肽或其片段。
3.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中多肽包括SEQID NO :2、3、7、9和11或其免疫原性片段。
4.權(quán)利要求1、2或3的免疫原性組合物，其中多肽在載體中表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的免疫原性組合物，其中載體包括減毒細(xì)菌載體或減毒病毒載體。
6.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中載體包括大腸桿菌或腺病毒。
7.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中組合物包含至少一種減毒細(xì)菌載體，所述減毒細(xì)菌載體表達(dá)或含有至少一種選自CAMP因子、脂肪酶或唾液酸酶的多肽。
8.包含至少一種重組減毒細(xì)菌或病毒載體和ASM酶活性抑制劑的組合物，所述載體包含至少一種編碼選自CAMP因子、脂肪酶或唾液酸酶的一種或更多種痤瘡丙酸桿菌 (Propionibacterium acnes)多肽的多核苷酸，使得多肽在至少一種重組減毒載體中表達(dá)。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中ASM酶活性抑制劑包括抗體。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中ASM酶抑制劑包括小分子抑制劑。
11.誘導(dǎo)受試者中保護(hù)性免疫的方法，包括向受試者施用權(quán)利要求1-3或8中任一項(xiàng)的組合物和使受試者與ASM酶抑制劑接觸。
12.權(quán)利要求10或11的方法，還包括加強(qiáng)免疫受試者，包括施用包含相同組成成分或者含有相同抗原多肽的不同組成成分的免疫原性組合物。
13.免疫保護(hù)性組合物，包含至少一種表達(dá)用于誘導(dǎo)抗痤瘡丙酸桿菌的免疫保護(hù)性反應(yīng)的抗原的減毒載體，所述抗原包括與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止信號(hào)相連的痤瘡丙酸桿菌的細(xì)胞外或免疫原性蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
14.權(quán)利要求13的免疫保護(hù)性組合物，其中痤瘡丙酸桿菌蛋白質(zhì)或其片段選自CAMP因子、脂肪酶、唾液酸酶及其任何組合。
15.權(quán)利要求10或11的免疫保護(hù)性組合物，其中組合物包含選自空腸彎曲菌 (Campylobacter jejuni)、結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、小腸結(jié)腸炎耳口爾森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耳口爾森菌(Yersinia pestis)、假結(jié)核病耳口爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis) > 大腸桿菌(Escherichia coli)、福氏志賀菌(Shigella flexneri)、痤瘡丙酸桿菌 (Propionibacterium acnes) > ^i]雙志賀菌(Shigella dysenteriae) > 鮑氏志賀菌 (Shigella boydii)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、貓胃螺桿菌(Helicobacter felis)> 人胃螺方寵菌(Gastrospiri1Ium hominus)、霍舌匕弧菌(Vibrio cholerae)、 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、難辨梭菌(Clostridium difficile)、鼠傷寒沙門菌 (Salmonella typhimurium) > ^ ^ ^ Π ^ (Salmonella typhi) > ^ Π ^ (Salmonella gallinarum)、雞白病沙門菌(Salmonella pullorum)、豬霍舌L 沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、乳酸桿菌屬(Lactobacillis sp.)、月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、 陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)禾口糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的減毒載體。
16.權(quán)利要求13的免疫保護(hù)性組合物，還包含藥物稀釋劑。
17.權(quán)利要求13的免疫保護(hù)性組合物，其中組合物還提供抗肺炎克雷伯菌 (K. pneumonia)、金黃色葡萄球菌(S. Aureus)和/或化膿性鏈球菌(S. pyogenes)感染的保護(hù)性免疫。
18.保護(hù)易感宿主抗痤瘡丙酸桿菌感染的方法，包括向所述宿主施用足以引起宿主免疫保護(hù)性反應(yīng)的量的權(quán)利要求1或權(quán)利要求13的免疫保護(hù)性組合物和施用ASM酶抑制劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中組合物在可藥用載體中。
20.重組減毒細(xì)菌載體或病毒載體，包含編碼選自來(lái)自痤瘡丙酸桿菌的CAMP因子、脂肪酶或唾液酸酶的至少一種抗原性多肽的多核苷酸。
21.向受試者提供保護(hù)性免疫的方法，包括向受試者施用權(quán)利要求18的重組減毒載體。
22.用于治療痤瘡丙酸桿菌感染的組合物，包含ASM酶抑制劑。
23.權(quán)利要求22的組合物，還包含CAMP抗原或疫苗。
24.抗原性組合物，包含經(jīng)破壞的非感染性痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞并且還包含ASM酶抑制劑。
25.治療痤瘡丙酸桿菌的方法，包括向受試者施用包含CAMP因子的疫苗和包含ASM酶抑制劑的組合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中疫苗和組合物同時(shí)施用。
全文摘要
本公開提供用于抗痤瘡丙酸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌或化膿性鏈球菌免疫的抗原性組合物。本公開提供用于產(chǎn)生預(yù)防感染的疫苗和用于預(yù)防感染的篩選試劑的方法。
文檔編號(hào)A61K8/64GK102307562SQ200980156214
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者R·L·伽羅, 黃俊銘 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)