專利名稱：一種提高產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸能力的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸能力的方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著化石原料(如石油、煤炭)等不可再生資源、能源的日漸枯竭以及環(huán)境污染的日益加劇，我國經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重制約。以可再生生物質(zhì)資源為原料大規(guī)模生產(chǎn)人類所需的能源、化工、醫(yī)藥、食品及農(nóng)用原材料的工業(yè)生物技術(shù)無疑是解決資源、能源及環(huán)境危機的有效手段。由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)成本較高，丙酸目前主要是由化學(xué)合成法生產(chǎn)。大幅提高發(fā)酵的產(chǎn)量、生產(chǎn)強度和底物轉(zhuǎn)化率，是實現(xiàn)發(fā)酵法替代化學(xué)合成法生產(chǎn)丙酸 的必要途徑。在發(fā)酵過程中，隨著丙酸的不斷積累，丙酸對細胞生長和產(chǎn)物合成的反饋抑制作用逐漸增強，細胞的代謝活力不斷降低，最終導(dǎo)致丙酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強度較低，生產(chǎn)成本較高。雖然通過流加一定量的強堿溶液如NaOH或Ca(OH)2可以維持pH值的穩(wěn)定，但會增加發(fā)酵液的滲透壓，也會增加環(huán)境負(fù)荷和下游提取成本。因此，如何有效地消除或減輕丙酸對微生物的反饋抑制作用是提高丙酸生產(chǎn)效率的重要科學(xué)問題之一，其中提高微生物對丙酸的耐受性能是一項重要的策略。本發(fā)明針對丙酸發(fā)酵的問題,公開了一種提高P. acidipropionici耐酸性能的方法。應(yīng)用該方法可提高產(chǎn)酸丙酸桿菌P. acidipropionici耐酸性能,并顯著提高了丙酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸能力的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案為在產(chǎn)酸丙酸桿菌(P. acidipropionici)發(fā)酵過程中添加精氨酸和/或天冬氨酸。所述P. acidipropionici 購自 CGMCC，編號為 CGMCC1. 2230。所述P.acidipropionici 種子培養(yǎng)基(g/L H2O):酵母粉，10 ;tryptic soy broth,
5；KH2PO4,1. 5 ；K2HP04, 2. 5 ；pH 7. 0 ；所述基本培養(yǎng)基組成為(g/LH20):酵母粉，10 ;蛋白胨，5 ；KH2PO4,1. 5 ；K2HPO4, 2. 5 ；甘油，25 ；CoCl2,0. 01 ；CaCO3, 30 ；pH 7. O ；為了測定耐酸性，在耐酸培養(yǎng)基中丙酸添加量為2. 5_5g/L。 所述精氨酸添加量為0_30mM。所述天冬氨酸添加量為0_30mM。對本發(fā)明進一步描述,在產(chǎn)酸丙酸桿菌(P. acidipropionici)發(fā)酵過程中單獨添加精氨酸0_30mM或天冬氨酸0-30mM ;在產(chǎn)酸丙酸桿菌(P. acidipropionici)發(fā)酵過程中添加0-30mM精氨酸和0_30mM天冬氨酸。
優(yōu)選將精氨酸和/或天冬氨酸添加于產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案選擇添加精氨酸和/或天冬氨酸的時間，通過測定丙酸產(chǎn)量即可知道精氨酸和/或天冬氨酸的效果。本發(fā)明有益效果如下采用本發(fā)明的方法提高了 P. acidipropionici的丙酸耐受性及丙酸產(chǎn)量，具有方法簡單、成本低的優(yōu)點。


圖1.外源添加氨基酸對P. acidipropionici丙酸耐受性的影響。(A)外源添加30mM精氨酸時P. acidipropionici對4g/L丙酸 的耐受性；(B)外源添加30mM天冬氨酸時P. acidipropionici對3g/L丙酸的耐受性；(C)外源添加30mM天冬氨酸和30mM精氨酸時P. acidipropionici對4g/L丙酸的耐受性。(■，未添加氨基酸; ，添加氨基酸)圖2.外源添加不同濃度的氨基酸對P. acidipropionici發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的影響。(A)精氨酸(IOmM, 20mM, 30mM) ； (B)天冬氨酸(lOmM, 20mM, 30mM) ； (C)精氨酸和天冬氨酸(IOmM, 20mM, 30mM)。C，未添加氨基酸;+，添加氨基酸)。
具體實施例方式實施例1 :初始培養(yǎng)基中外源添加精氨酸提高P. acidipropionici的丙酸耐受性將冷凍甘油管保藏的P. acidipropionici接種到種子培養(yǎng)基,接種量1%，裝液量lOO/lOOmL厭氧瓶，30°C靜置培養(yǎng)60h后，轉(zhuǎn)接到新鮮的種子培養(yǎng)基中，接種量1%，同樣條件培養(yǎng)40h，完成活化培養(yǎng)。將經(jīng)活化培養(yǎng)好的P. acidipropionici以接種量5%轉(zhuǎn)接到耐酸培養(yǎng)基,裝液量lOO/lOOmL厭氧瓶，30°C靜置培養(yǎng)。每12h取培養(yǎng)液，適當(dāng)稀釋后使用紫外分光光度計測定吸光值0D_，設(shè)未添加精氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，結(jié)果如表I和圖1所示。通過添加不同精氨酸P. acidipropionici在酸性條件下的生長狀況可以看出，在添加20mM精氨酸的條件下，P. acidipropionici分別可在最高含4g/L丙酸的培養(yǎng)基中生長良好,其耐受丙酸的濃度提高了 60%,同時添加20mM精氨酸和天冬氨酸時，P. acidipropionici可在最高含4g/L丙酸的培養(yǎng)基中生長良好。表I添加氨基酸提高產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸性及丙酸產(chǎn)量
權(quán)利要求
1.一種提高產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸能力的方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中添加精氨酸和/或天冬氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中添加0_30mM 精氨酸或天冬氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中添加30mM精氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中添加0_30mM天冬氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中添加20mM天冬氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求書I所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中分別添加0-30mM精氨酸和天冬氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求書8所述方法，其特征在于，在產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵過程中分別添加 20mM精氨酸和20mM天冬氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求書I所述方法，其特征在于，是在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加精氨酸和/或大冬氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過外源添加氨基酸提高產(chǎn)酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)對丙酸的耐受性及丙酸產(chǎn)量的方法。通過在培養(yǎng)基中添加精氨酸或天冬氨酸，實現(xiàn)P.acidipropionici耐受丙酸的濃度分別提高了60%和20%，丙酸產(chǎn)量分別提高36%和26%，并通過同時添加20mM的兩種氨基酸實現(xiàn)了丙酸產(chǎn)量的最大提高，本發(fā)明為提高丙酸桿菌耐酸的研究和丙酸發(fā)酵生產(chǎn)提供了有效的方法。
文檔編號C12N1/20GK103013882SQ201210566749
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者陳堅, 堵國成, 劉龍, 李江華, 管寧子 申請人:江南大學(xué)