本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及氮運輸基因osnpf7.4在水稻選育中的應用。

背景技術：

植物通過吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來獲得氮素；氮的吸收和轉運主要依靠銨根運輸?shù)鞍祝╝mt）、硝酸根運輸?shù)鞍祝╪rt）、氨基酸運輸?shù)鞍祝╝at）、肽運輸?shù)鞍祝╬tr）等運輸?shù)鞍讈硗瓿桑╳illiamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.）。銨通過植物amt吸收后再通過谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.）。植物可通過高親和轉運系統(tǒng)（hats）的nrt2和低親和轉運系統(tǒng)（lats）的nrt1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（nr）和亞硝酸還原酶（nir）還原形成銨，再進一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.）。

氮運輸npf家族包括nrt1和ptr亞家族，不同成員在植株不同部位運輸硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生長發(fā)育上起不同的作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。osnpf2.2介導了木質部硝酸根的卸載，影響水稻生長和種子灌漿結實（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2對硝酸根有低親和運輸，能夠影響植株生長（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。

雖然已知氮營養(yǎng)可以促進植物生長發(fā)育，但是氮營養(yǎng)影響了植株什么類型的生長發(fā)育目前還沒有系統(tǒng)的了解。另外水稻npf家族有80多個成員，氮營養(yǎng)是通過npf基因家族什么成員進行響應，在什么部位介導了氮營養(yǎng)運輸，從而影響了植株什么類型的生長發(fā)育，目前也幾乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效運輸基因，特別是能夠控制水稻株型的氮運輸關鍵基因，將有利于水稻高產(chǎn)品種的培育。本發(fā)明通過長期研究后發(fā)現(xiàn)，npf家族osnpf7.4基因對水稻分蘗有重要的負調控作用，該基因通過干擾和基因敲除后，可培育出無轉基因標記的水稻，直接應用于植物株型改良，從而使水稻增產(chǎn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術中存在的問題，提供氮運輸基因osnpf7.4在水稻選育中的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的氮運輸基因osnpf7.4為對象，從水稻中花11中克隆了osnpf7.4的cdna序列。通過rnai技術構建osnpf7.4基因干擾表達載體，采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將干擾表達載體導入正常粳稻品種中花11中，得到osnpf7.4基因表達量下降的干擾植株，干擾植株的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)與對照野生型中花11相比顯著提高。同時構建了osnpf7.4基因超表達載體，將超表達載體導入中花11中，得到osnpf7.4基因超表達植株，其分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)與中花11相比顯著降低。這些結果表明，通過降低osnpf7.4基因表達，可以使正常的水稻分蘗數(shù)、每株有效穗數(shù)增加，每株灌漿粒數(shù)增加，從而提高水稻產(chǎn)量。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的osnpf7.4基因的功能，其可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)，從而提高水稻產(chǎn)量。具體可通過rnai技術降低osnpf7.4基因的表達或用crispr等基因編輯技術敲除osnpf7.4基因，使水稻分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)增加，達到提高水稻產(chǎn)量的目的。所述的osnpf7.4基因編碼的osnpf7.4蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf7.4基因的cdna序列優(yōu)選如seqidno.2所示。

應該理解為，在不影響osnpf7.4蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領域技術人員可對seqidno.1所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf7.4蛋白還包括seqidno.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

（1）本發(fā)明克隆的osnpf7.4基因干擾表達后使水稻分蘗能力增強，說明osnpf7.4基因對提高水稻分蘗數(shù)有明顯影響，因此，通過基因工程技術降低osnpf7.4基因的表達能夠提高植物產(chǎn)量。這不僅有助于通過正常施氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過結合基因編輯技術和分子育種進行植物的品種改良。

（2）osnpf7.4基因的成功克隆，進一步證實了npf家族在氮吸收過程中的重要作用，對闡明氮運輸家族的生物學功能有重要的意義，另外對進一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些提高植物產(chǎn)量的基因，但對植物增產(chǎn)的分子機制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的osnpf7.4基因能夠提高水稻的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)，對確定植物增產(chǎn)的關鍵因素有極大的推動作用。

附圖說明

圖1是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系的整株表型圖。

圖2是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系分蘗數(shù)的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別星號（*）表示與對照相比具有差異顯著。

圖3是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系有效穗數(shù)的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別星號（*）表示與對照相比具有差異顯著。

圖4是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系的每株種子灌漿粒數(shù)表型圖。

圖5是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系的每株種子灌漿粒數(shù)統(tǒng)計圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別星號（*）表示與對照相比具有差異顯著。

圖6是對照中花11、osnpf7.4基因超表達植株2個株系和osnpf7.4基因干擾植株2個株系表達量的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別星號（*）表示與對照相比具有差異顯著。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，下述實施例所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實驗方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術（參見分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1osnpf7.4基因干擾植株的構建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉錄成cdna，利用引物對：

f1：5'-ggtaccacgccatggagagaggccagca-3'（kpni），

r1：5'-ggatccaggtgaccagcaccatgccca-3'（bamhi）；

f2：5'-actagtacgccatggagagaggccagca-3'（spei），

r2：5'-gagctcaggtgaccagcaccatgccca-3'（saci）；

各自pcr擴增出osnpf7.4基因的cdna片段，通過相應的限制性內切酶酶切后連入ptck303載體，構建出osnpf7.4基因的干擾表達載體osnpf7.4-ptck303。采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將干擾表達載體導入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，種于大田中，待苗長大后，提取基因組dna通過pcr對轉基因植株進行檢測，檢測引物對為：

f3：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r3：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴增出517bp的片段，則說明轉基因植株為陽性植株。陽性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉基因植株，即得到osnpf7.4基因干擾植株。osnpf7.4基因干擾植株的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)遠多于對照中花11植株，差異顯著，如圖1、2、3所示；且干擾植株的每株灌漿粒數(shù)比對照顯著增加，如圖4和圖5所示。

取osnpf7.4基因干擾植株葉片，提取葉片rna并將其反轉錄成cdna，通過實時熒光定量pcr檢測osnpf7.4基因在干擾植株的表達量，結果顯示（圖6）干擾植株中osnpf7.4基因的表達量比對照中花11降低。實時熒光定量pcr所用引物對：

f4：acgccatggagagaggccagca，

r4：accaggttcgtggcaatgccgt。

實施例2osnpf7.4基因超表達植株的構建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉錄成cdna，利用引物對：

f5：5'-ggtaccatggacgccggcgacgccatggag-3'（kpni），

r5：5'-tctagatgacacgaccgtcttcaccttgta-3'（xbai）；

通過pcr擴增osnpf7.4基因的cdna后，通過kpni和xbai連入pcambia-1306載體（pcambia-1306載體購自cambia公司），構建出osnpf7.4基因的超表達載體osnpf7.4-p1306。采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將超表達載體導入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，種于大田中，待苗長大后，提取基因組dna通過pcr對轉基因植株進行檢測，檢測引物對為：

f3：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r3：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'；

若擴增出517bp的片段，則說明轉基因植株為陽性植株。陽性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉基因植株，即得到osnpf7.4基因超表達植株。osnpf7.4基因超表達植株的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)遠少于對照中花11植株，差異顯著，如圖1、2、3所示；且超表達植株的每株灌漿粒數(shù)比對照顯著減少，如圖4和圖5所示。

取osnpf7.4基因超表達植株葉片，提取rna并將其反轉錄成cdna，通過實時熒光定量pcr檢測osnpf7.4基因在超表達植株的表達量，操作同實施例1，結果顯示（圖6）超表達植株中osnpf7.4基因的表達量遠遠高于對照中花11。

上述結果表明，osnpf7.4基因可以通過表達量的降低，提高水稻的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)及灌漿粒數(shù)，最終提高水稻產(chǎn)量。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學院

<120>氮運輸基因osnpf7.4在水稻選育中的應用

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