專利名稱：水稻硝酸還原酶基因nr2及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及水稻硝酸還原酶基因NR2及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為單子葉模式植物的水稻是我國一半以上人口的主食，同時(shí)也是氮肥用量最多的糧食作物之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，水稻氮肥用量我國占全球的1/3以上。而氮素是水稻所有必需營養(yǎng)元素中植株生長的首要成分和產(chǎn)量形成的限制因素，因此對水稻氮素營養(yǎng)的研究和改善不僅能為水稻栽培中氮肥的合理利用提供必要依據(jù)，而且具有潛在的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。氮素以各種不同的分子形態(tài)存在，如硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和尿素等。水稻是喜銨作物， 因?yàn)樵谘退畻l件下土壤硝化作用被強(qiáng)烈抑制，銨態(tài)氮是主要的存在形態(tài)。但值得注意的是， 水稻根系的泌氧作用能滿足好氧微生物的需要，在根際或根表將銨態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮；而且，隨著我國目前水稻節(jié)水栽培技術(shù)的興起，水稻根系的通氣條件有了很大改善，肥料氮和土壤有機(jī)氮礦化釋放出的銨態(tài)氮被硝化。因此，硝態(tài)氮對水稻的生長也起到重要的作用。作物對氮素的利用效率一方面取決于根系對氮素的吸收，另一方面在很大程度上取決于作物的氮代謝水平。水稻不僅能夠吸收硝態(tài)氮(楊肖娥，孫羲.不同水稻品種NH4+和NO3吸收的動力學(xué).土壤通報(bào)，1991，22 (5) :222-224;段英華，張亞麗，沈其榮.水稻根際的硝化作用與水稻的硝態(tài)氮營養(yǎng).土壤學(xué)報(bào)，2004，41 (5) :803-809)，而且在一定條件下硝態(tài)氮對水稻生長具有促進(jìn)作用表現(xiàn)為促進(jìn)水稻莖桿伸長，增加每穗粒數(shù)。目前已經(jīng)在多種植物中克隆了與硝態(tài)氮吸收和還原有關(guān)的基因，水稻中有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsNRTl (Lin CM, Koh S, Stacey G, Yu SM, Lin TY, Tsay YF. Cloning and functional characterization of a constitutively expressed nitrate transporter gene, OsNRTl, from Rice. Plant Physiology，2000，122 :379_388)、NADH 型硝酸還原酶基因 nia(Choi HK,Kleinhofs A,An GH. Nucleotide sequence of rice nitrate reductase genes. Plant Mol Biol, 1989,13(6) :731_733)和亞硝酸還原酶基因 nii (Terada Y, Aoki H, Tanaka Τ, Morikawa H, Ida S. Cloning and nucleotide sequence of a leaf ferredoxin-nitrite reductase cDNA of rice.Biosci Biotechnol Biochem,1995, 59(11) :2183-2185)。硝酸還原酶依據(jù)電子供體可歸為3種類型NADH特異型(對還原型輔酶I專一的硝酸還原酶)、NAD(P)H型(對還原型輔酶I/II專一的硝酸還原酶)和NADPH 特異型(對還原型輔酶Π專一的硝酸還原酶)(Guerrero MG, Vega JM, Losada Μ. The assimilatory nitrate-reducing system and its regulation. Ann Rev Plant Physiol, 1981，32 169-204)。水稻中除了已克隆的NADH型硝酸還原酶基因NRl外，編碼NAD⑵H特異型硝酸還原酶的NR2基因的分離尚未見報(bào)道。作為除草劑和落葉劑的氯酸鹽是硝酸鹽的類似物，可被硝酸還原酶還原為有毒性的亞氯酸鹽。Aberg(1947)首次研究小麥抗氯酸鹽的機(jī)制時(shí)就認(rèn)為，氯酸鹽的毒性在于硝酸還原酶將其催化還原為有毒化合物——亞氯酸鹽，對植物產(chǎn)生毒害，抑制了植物生長(Aberg B. On the mechanism of the toxic action of chlorates and some related substances upon young wheat plants. Annu Rev Agri Coll Sweden,1947,15 37-107)。因此，氯酸鉀敏感性一定程度上反映了硝酸還原酶的活性。氯酸鉀抗性已廣泛應(yīng)用于植物硝態(tài)氮吸收同化缺陷突變體的篩選，分離得到的擬南芥氯酸鉀抗性突變體就包括了硝酸還原酶基因的突變(Crawford NM. Study of chlorate-resistant mutants of Arabidopsis :Insights into nitrate assimilation and ion metabolism of plants. In :Genetic Engineering Principles and Methods, Vol. 14. Setlow JK, ed. Plenum Press, ISBN0-306-44234-5, New York. 1992，pp.89-99)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的之一在于提供一種能調(diào)控水稻氮素吸收和利用的水稻硝酸還原酶基因 NR2 (Nitrate Reductase 2)。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下本發(fā)明的水稻硝酸還原酶基因NR2，具有(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示的序列(a) Seq ID No 1所示的基因組核苷酸序列；(b) Seq ID No 2所示的cDNA核苷酸序列；(c)在(a)或(b)所限定的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸而生成的可編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物；(d)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)所限定的核苷酸序列雜交且編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；所述的嚴(yán)格條件是指在0. 1XSSC、0. 1%SDS的溶液中，65°C 條件下雜交并洗膜。(e)與(a)或(b)所限定的核苷酸序列至少有70%同源性且編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。其中Seq ID No 1所示的廣陸矮基因組核苷酸序列共有3039個(gè)核苷酸，Seq IDNo 2所示的廣陸矮cDNA序列共有2682個(gè)核苷酸(包括終止子TGA)，其中保守序列為 409-516 位(GGGCTCGTCAAGCGCCCCGCGAGGCTCACCATGGAGCAGCTCGTGACCGGGTTCGAGGCCGTGGAGCT CCCCGTCACGCTGGTGTGCGCGGGCAACCGGCGCAAGGAG)，對保守區(qū)域之外的區(qū)域進(jìn)行核苷酸的取代、缺失和添加也可以編碼得到硝酸還原酶功能類似物，不會對蛋白的功能產(chǎn)生影響。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述基因編碼的蛋白質(zhì)，具有(A)或(B)所示的序列(A)Seq ID No 3所示的氨基酸序列；(B)在(A)所限定的的氨基酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硝酸還原酶活性的由(A)衍生的蛋白質(zhì)。其中的Seq ID No :3所示的蛋白質(zhì)屬于含硝酸還原酶結(jié)構(gòu)域的新蛋白，具有893 個(gè)氨基酸，其中保守氨基酸為 137-172位(Gly Leu val Lys Arg Pro Ala Arg Leu Thr Met Glu Gln Leu Val Thr Gly Phe Glu Ala Val Glu Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu)，對保守區(qū)域之外的非結(jié)構(gòu)域區(qū)域進(jìn)行氨基酸的取代、缺失和添加也可以得到硝酸還原酶功能類似物，不會對蛋白的功能產(chǎn)生影響。
本發(fā)明的目的還包括提供含有上述水稻硝酸還原酶基因NR2的重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為PCAMBIA1300，如圖3所示的pCAMBIA1300_NR2，該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。本發(fā)明的目的還包括提供含有上述水稻硝酸還原酶基因NR2的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。本發(fā)明的目的還包括利用上述水稻硝酸還原酶基因NR2調(diào)控水稻氮吸收和利用的方法，包括用具有上述水稻硝酸還原酶基因NR2所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。上述水稻硝酸還原酶基因NR2可用于調(diào)控植物氮吸收和利用、尤其是用于調(diào)控單子葉植物水稻。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、NR2基因的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位由于氯酸鉀敏感性一定程度上反映了硝酸還原酶的活性，我們用0. 氯酸鉀溶液處理水稻F2群體的兩親本廣陸矮4號和日本晴，發(fā)現(xiàn)兩者差異顯著(圖1)，在F2群體中表現(xiàn)為連續(xù)正態(tài)分布，說明水稻對氯酸鉀的敏感性是數(shù)量遺傳性狀，可以進(jìn)行QTL分析。利用構(gòu)建的該F2群體的水稻SSR連鎖圖譜進(jìn)行QTL定位分析，結(jié)果顯示，在水稻第2號染色體短臂上存在一主效QTL，LOD值為5. 51，位于SSR標(biāo)記RM240和RM250之間。為了精細(xì)定位該主效QTL，本發(fā)明構(gòu)建了以廣陸矮4號和日本晴為親本的重組自交系群體，并對冊240和RM250兩個(gè)分子標(biāo)記之間的BAC序列進(jìn)行分析，發(fā)展新的簡單序列重復(fù)(SSR)和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)標(biāo)記，最終將該主效QTL精確定位于一 BAC克隆 AP004058 (0J1353_F08)的P2-3和P2-5標(biāo)記之間6. 4kb的物理距離內(nèi)(圖2)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測得候選基因NR2。二、NR2基因的鑒定和功能分析通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了在氯酸鉀敏感性上轉(zhuǎn)變?yōu)閺V陸矮4號表型的轉(zhuǎn)基因日本晴水稻植株(圖4)，證明了本發(fā)明正確克隆了主效QTL;氨基酸序列分析表明NR2編碼一個(gè)含硝酸還原酶結(jié)構(gòu)域的蛋白，對T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株硝酸還原酶II的酶活測定(圖5)以及地上部和種子的總含氮量的檢測(圖6)，證明該基因編碼NAD (P) H型硝酸還原酶II，在一定的外界氮水平下促進(jìn)氮素的吸收和利用。本發(fā)明采用圖位克隆技術(shù)利用水稻F2群體和重組自交系群體，通過QTL精細(xì)定位技術(shù)首次在水稻中克隆到NAD (P)H型硝酸還原酶基因NR2并通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)鑒定了基因的功能。NR2基因的克隆和應(yīng)用，可有效調(diào)控水稻氮素的吸收和利用，提高氮的利用效率， 最終提高水稻的產(chǎn)量，NR2基因也可應(yīng)用于其它單子葉植物中用于調(diào)控氮素的吸收和利用。 同時(shí)本發(fā)明有助于水稻氮素利用分子機(jī)理的闡明，并為氮高效育種奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。


圖1是水稻品種廣陸矮4號和日本晴經(jīng)0. 氯酸鉀溶液處理前后的對照表型； 其中a、b-廣陸矮4號處理前、后表型，c、d-日本晴處理前、后表型，e-5cm標(biāo)尺；圖2是NR2基因的精細(xì)定位圖；其中豎線上方標(biāo)注分子標(biāo)記，豎線下方數(shù)字代表交換個(gè)體數(shù)，橫線右側(cè)標(biāo)注BAC克隆號，ATG和TGA分別表示NR2基因的起始密碼子和終止密碼子；圖 3 是 pCAMBIA1300-NR2 載體圖譜；圖4是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株經(jīng)0. 1 %氯酸鉀溶液處理前后的對照表型；其中A、B-日本晴處理前表型；C、D-轉(zhuǎn)NR2基因株系T2-1處理前、后表型；E、F_轉(zhuǎn)NR2 基因株系T2-2處理前、后表型，e-5cm標(biāo)尺；圖5是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株硝酸還原酶II的酶活；平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3)；圖6是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株地上部和種子的總含氮量；平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1、水稻材料粳稻品種為(Oryza sativa L. japonica) “日本晴”，秈稻品種(Oryza sativa L. indica) “廣陸矮 4 號，，。2、定位群體的氯酸鉀敏感性檢測利用廣陸矮4號和日本晴的F2群體(720個(gè)株系)和重組自交系F7群體(646個(gè)株系)作為定位群體。種子于28°C培養(yǎng)箱中發(fā)芽5天后(每天換一次單蒸水)，從每個(gè)株系中取10粒發(fā)芽一致的種子，一半用發(fā)芽紙包好后放入裝有單蒸水的試管中作為對照，另一半用發(fā)芽紙包好后放入裝有0. 氯酸鉀溶液的試管中作為處理，然后放入28°C光照培養(yǎng)箱，光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí)。培養(yǎng)7天后，用直尺測量每一株水稻莖底部到葉稍的總長度。氯酸鉀敏感度=[(對照的平均株高-處理的平均株高)/對照的平均株高]X100%3、SSR和STS標(biāo)記定位NR2基因采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組 DNA。取0. 2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于150 μ 1超純水中。每一個(gè)PCR反應(yīng)用2 μ 1 DNA樣
P
ΡΠ ONR2基因的QTL定位由720個(gè)株系構(gòu)成的廣陸矮4號和日本晴組合的F2群體作為QTL定位群體，依據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于12條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性。QTL定位分析發(fā)現(xiàn)，在水稻第2號染色體上SSR 標(biāo)記RM240和RM250之間存在一主效QTL，LOD值為5. 51。NR2基因的精細(xì)定位利用以廣陸矮4號和日本晴為親本構(gòu)建的重組自交系群體為精細(xì)定位群體，對RM240和RM250兩個(gè)SSR標(biāo)記之間的BAC序列進(jìn)行分析，依據(jù)已發(fā)表的粳稻日本晴和秈稻9311的序列發(fā)展了 8個(gè)STS標(biāo)記和1個(gè)SSR標(biāo)記(如表1)，最終將該主效 QTL 精確定位于一 BAC 克隆 ΑΡ004058 (0J1353_F08)的 STS 標(biāo)記 P2-3 和 P2-5 之間 6. 4kb 的物理距離內(nèi)(圖2)，且與SSR標(biāo)記P2-4完全連鎖。
4、基因預(yù)測和比較分析通過分析此區(qū)段ORF的基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)一編碼硝酸還原酶II的NR2基因極有可能?；蚪MDNA和cDNA的比對顯示，該基因含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物與大麥和玉米的硝酸還原酶[NAD(P)H]同源性高。與日本晴全基因組序列的比對發(fā)現(xiàn)，該基因?yàn)閱慰截?。我們設(shè)計(jì)了該基因的測序引物，采用PCR方法分別從廣陸矮4號和日本晴基因組中擴(kuò)增出候選基因NR2進(jìn)行測序分析。序列比對發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)中引起氨基酸發(fā)生改變的4 個(gè)位點(diǎn)在日本晴中編碼區(qū)615位4個(gè)丙氨酸缺失，其余3個(gè)位點(diǎn)為天冬胺酸146組氨酸248色氨酸779 ；在廣陸矮4號中編碼區(qū)615位4個(gè)丙氨酸保留，其余3個(gè)位點(diǎn)為蘇氨酸146精氨酸
248 ItMSI 783°表1精細(xì)定位發(fā)展的分子標(biāo)記
權(quán)利要求
1.水稻硝酸還原酶基因NR2，具有(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示的序列(a)Seq ID No 1所示的基因組核苷酸序列；(b)SeqID No 2所示的cDNA核苷酸序列；(c)在(a)或(b)所限定的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸而生成的可編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物；(d)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)所限定的核苷酸序列雜交且編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；(e)與(a)或(b)所限定的核苷酸序列至少有70%同源性且編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有(A)或(B)所示的序列(A)Seq ID No 3所示的氨基酸序列；(B)在(A)所限定的的氨基酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有硝酸還原酶活性的由(A)衍生的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體為 PCAMBIA1300。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的宿主細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
8.利用權(quán)利要求1所述基因調(diào)控水稻氮吸收和利用的方法，其特征在于，包括用具有權(quán)利要求1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
9.權(quán)利要求1所述基因在調(diào)控植物氮吸收和利用中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻硝酸還原酶基因NR2，其基因序列為(a)Seq ID No1所示的基因組核苷酸序列；(b)Seq ID No2所示的cDNA核苷酸序列；或(c)在(a)或(b)所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸而生成的可編碼具有硝酸還原酶活性的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物等。本發(fā)明還公開了上述基因編碼的蛋白質(zhì)(Seq ID No3所示的氨基酸序列)及上述基因在調(diào)控氮素吸收和利用中的應(yīng)用。NR2基因的克隆和應(yīng)用，可有效調(diào)控水稻氮素的吸收和利用，提高氮的利用效率，最終提高水稻的產(chǎn)量。
文檔編號C12N1/21GK102260691SQ201110130620
公開日2011年11月30日 申請日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者滕勝, 郭龍彪, 錢前, 高振宇 申請人:中國水稻研究所