本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用于檢測肝癌的核酸適配體及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(selex)篩選得到的，能特異結(jié)合靶物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸(單鏈dna或rna)。核酸適體具有與抗體相媲美的親和力與特異性，而且與抗體相比具有更多的優(yōu)勢，如分子量小，無免疫原性；容易化學(xué)合成，成本低；易修飾，且可以對不同部位進(jìn)行修飾和取代；性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存等。核酸適體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標(biāo)擴(kuò)展至完整的病毒顆粒及細(xì)胞等復(fù)合物靶標(biāo)。因此，核酸適體具有廣泛的應(yīng)用前景。肝癌是目前發(fā)病率及致死率最高的癌癥之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2012年全球肝癌新發(fā)78.2萬例，死亡74.6萬例，其中死亡病例數(shù)目在所有類型的癌癥中排名第二。肝癌主要發(fā)生在欠發(fā)達(dá)地區(qū)，特別值得一提的是中國的肝癌發(fā)病數(shù)約占全球50％，嚴(yán)重危害了國民的身體健康。如果能及早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，則癌癥的病情往往容易得到控制，降低肝癌發(fā)病引起的死亡風(fēng)險。因此，開發(fā)一種更加靈敏、簡便、高效和具有特異性的肝癌檢測手段，對于肝癌的臨床治療將具有十分重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學(xué)合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標(biāo)記的可用于檢測檢測人臨床肝癌組織切片的核酸適體及其衍生物，還提供包括前述核酸適配體的檢測試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，提供了一種用于檢測肝癌的核酸適配體，所述核酸適配體為核酸適配體sw1，所述核酸適配體sw1的核苷酸序列為seqidno.1所示的dna片段。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體還包括在核酸適配體sw1的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化的核酸適配體。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述氨基化具體為在所述核酸適配體sw1核苷酸序列的5’端標(biāo)記氨基基團(tuán)-nh2。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述巰基化具體為在所述核酸適配體sw1核苷酸序列的5’端標(biāo)記巰基基團(tuán)-sh。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體的核苷酸序列上結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述熒光物質(zhì)為fam熒光基團(tuán)或cy5熒光基團(tuán)；所述納米發(fā)光材料為量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換納米顆粒；所述酶標(biāo)記為辣根過氧化物酶或蔗糖酶。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種；(1)與所述核酸適配體sw1的核苷酸序列的同源性在60％以上；(2)與所述核酸適配體sw1的核苷酸序列進(jìn)行雜交的序列；或者(3)所述核酸適配體sw1的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的rna序列。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體還包括所述核酸適配體sw1的衍生物，所述衍生物為由所述核酸適配體sw1的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。上述的用于檢測肝癌的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體還包括所述核酸適配體sw1的衍生物，所述衍生物為由所述核酸適配體sw1改造而成的相應(yīng)肽核酸。作為本發(fā)明的同一技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種用于檢測人臨床肝癌組織切片的檢測試劑盒，包括上述的核酸適配體。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述檢測試劑盒還包括結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供了一種用于檢測人臨床肝癌組織切片的核酸適配體，通過selex篩選得到的核酸適配體與蛋白抗體相比具有更好的親和力與特異性；免疫原性?。荒軌蝮w外化學(xué)合成，分子量小，可以對不同部位進(jìn)行修飾和取代，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存；便于標(biāo)記等特點(diǎn)。(2)本發(fā)明提供了一種用于檢測人臨床肝癌組織切片的核酸適配體的檢測試劑盒，由于核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好，采用本發(fā)明的核酸適配體進(jìn)行人臨床肝癌組織切片的檢測時，操作更為簡單、迅速。本發(fā)明的可識別人臨床肝癌組織切片的核酸適配體結(jié)合能力強(qiáng)，解離常數(shù)均在納摩爾范圍以內(nèi)。利用本發(fā)明的核酸適配體對其結(jié)合的靶分子進(jìn)行釣取，可能得到其腫瘤標(biāo)志物，這對于肝癌的早期診斷具有重要意義，在肝癌的診斷方面有良好的應(yīng)用前景。附圖說明為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。圖1為本發(fā)明實施例1的核酸適配體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)模擬所得的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明實施例1的核酸適配體對人臨床肝癌組織切片的激光共聚焦表征圖。圖3為本發(fā)明實施例1的核酸適配體對固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞結(jié)合效果的流式表征圖。圖4為流式細(xì)胞術(shù)測定核酸適配體sw1與多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的解離常數(shù)繪制曲線。圖5為本發(fā)明實施例1的核酸適配體對多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞結(jié)合情況的激光共聚焦表征圖。具體實施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。實施例1一種可用于檢測人臨床肝癌組織切片的核酸適配體，主要采用以下篩選方法得到：(1)合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈dna文庫和引物。隨機(jī)文庫lib：5’-atccattgccactgactacc-n40-gaagtcagtcggtcgttagt-3’；5’引物：5’-atccattgccactgactacc-3’；3’引物：5’-actaacgaccgactgacttc-3’。n代表a、t、g、c中任一堿基。(2)通過selex技術(shù)篩選人臨床肝癌組織切片的核酸適配體(正篩選)。2.1.組織切片的處理：石蠟包埋的肝癌組織切片進(jìn)行篩選之前先進(jìn)行常規(guī)脫臘至水和抗原修復(fù)。然后將組織切片先置于烤箱中于50℃下烘烤30min，隨后立馬在二甲苯中浸泡2次，每次浸泡15min。接著將組織切片先后在無水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各浸泡4min；再浸入蒸餾水2次，每次2min；再用pbs浸泡5min。之后進(jìn)行微波抗原熱修復(fù)，具體操作為：將組織切片放入盛有ph為6.0的0.01m檸檬酸鈉緩沖液的燒杯中，置于微波爐中，調(diào)節(jié)活力控制燒杯內(nèi)液體溫度在92℃～98℃之間，15min后取出燒杯置于室溫下冷卻30min。用pbs洗滌組織切片兩次后，向組織切片上滴加200μl封閉液(封閉液的制備方法為：在0.01mph為7.4的磷酸緩沖液中加入1mg/mlbsa、0.1mg/ml酵母trna和0.5mg/ml鮭魚精dna；以下所使用的封閉液均一致)在濕盒中孵育30min，封閉組織對dna的非特異性吸附。2.2.文庫預(yù)處理：將隨機(jī)文庫lib于12000rmp下離心5min，然后加入適量超純水，于95下℃加熱10min破壞隨機(jī)文庫lib的二級結(jié)構(gòu)后，轉(zhuǎn)移至冰上，然后加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(結(jié)合緩沖液的制備方法為：0.01mph為7.4的磷酸緩沖液中加入5mmmg2+、1mg/mlbsa、0.1mg/ml酵母trna和0.1mg/ml鮭魚精dna，以下使用的結(jié)合緩沖液均一致)使總體積為100μl得到預(yù)處理的文庫溶液。2.3.正篩選：將步驟2.2中預(yù)處理的文庫溶液滴加到步驟2.1中封閉的組織切片表面，置于濕盒中孵育。第一輪篩選的孵育時間為60min，隨篩選輪數(shù)的增加，孵育時間逐輪遞減至30min。孵育后將孵育溶液輕輕用洗滌緩沖液沖(洗滌緩沖液的制備方法為：0.01mph為7.4的磷酸緩沖液中加入5mmmg2+和1mg/mlbsa，以下使用的洗滌緩沖液成分一致)洗掉，重復(fù)浸潤洗滌三次，去除組織表面未結(jié)合的單鏈dna。用刮刀將玻片表面的組織刮下來收集到ep管中，隨后向ep管中加入1ml超純水。將ep管置于95℃水浴鍋中加熱10min，之后迅速將ep管于4℃、12000rpm離心10min，上清即為含有ssdna的溶液。將含有ssdna的溶液冷凍保存，待下一步操作。(3)pcr擴(kuò)增：取100μl由2.3步驟所得的含有ssdna的溶液進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增條件為：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，經(jīng)過合適循環(huán)輪數(shù)(每輪篩選中pcr擴(kuò)增的輪數(shù)都要經(jīng)過優(yōu)化，以保證pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的量足夠下一輪篩選的同時不至于產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增)，72℃3min。(4)制備dna單鏈文庫：將擴(kuò)增產(chǎn)物與瓊脂糖微球在室溫下孵育30min，借助生物素與鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合能力將標(biāo)記有生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈dna被捕獲到鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球表面，得到修飾有擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖微球。隨后將修飾有擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖微球于5000rpm離心棄上清，用pbs溶液離心洗滌兩次。于洗滌后的沉淀中加入500μl濃度為200mm的naoh溶液，室溫下反應(yīng)15min；然后于5000rpm離心5min，收集上清至ep管中。脫鹽柱用10mlddh2o洗滌后，加入ep管中的上清液，待上清液自然滴完后，再往脫鹽柱中加入1mlddh2o，收集此時滴下的液體，此中即含有ssdna。(5)重復(fù)篩選：將步驟(4)得到的dna單鏈文庫重復(fù)上述步驟(2)～(4)過程3次。(6)反篩選：自第四輪篩選開始引入反篩選以提高核酸適配體對肝癌組織的特異性。以癌旁正常肝組織為對照，將步驟(5)重復(fù)篩選后得到的dna單鏈文庫進(jìn)行反篩選，反篩選的具體操作為：石蠟包埋的癌旁正常肝組織切片進(jìn)行篩選之前先進(jìn)行常規(guī)脫臘至水和抗原修復(fù)，隨后用pbs洗滌組織兩次后，向組織上滴加含有隨機(jī)序列的封閉液在濕盒中孵育以封閉組織對dna的非特異性吸附。隨后將步驟(5)中第四輪篩選得到的dna單鏈文庫溶液滴加到組織切片表面，置于濕盒中孵育；孵育完成后收集組織表面的溶液。(7)多輪篩選：將步驟(6)所收集的溶液染繼續(xù)進(jìn)行上述步驟(2)～(4)的過程，然后再一次重復(fù)步驟6、步驟2、步驟3、步驟4的過程；重復(fù)篩選過程中基于組織免疫熒光技術(shù)用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡考察文庫對人臨床肝癌組織切片的結(jié)合情況，直至文庫對人臨床肝癌組織切片的結(jié)合能力滿足要求后，將所得文庫經(jīng)測序分析，最終得到可用于檢測人臨床肝癌組織切片的核酸適配體sw1。在核酸適配體sw1的5’端標(biāo)記cy5，記為核酸適配體cy5-sw1，其dna片段為：5’-cy5-atccattgccactgactaccagccgggtgggtgggggggtttgctggtatcgcattgtgcgaagtcagtcggtcgttagt-3’。本發(fā)明中，核酸適配體sw1的核苷酸序列上結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記，均能達(dá)到與實施例1相同或相似的技術(shù)效果。對比例1陰性探針，其核苷酸序列為：cy5-random：5’-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’(5’端標(biāo)記有cy5)。n代表a、t、g、c中任一堿基。考察1：用mfold服務(wù)對本實施例核酸適配體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)模擬。用mfold服務(wù)對本實施例核酸適配體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)模擬后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，可見sw1的模擬結(jié)構(gòu)呈明顯的莖環(huán)結(jié)構(gòu)?？疾?：激光共聚焦掃描顯微鏡檢測核酸適配體cy5-sw1和cy5-random對人臨床肝癌組織切片的結(jié)合情況和特異性。先將石蠟包埋的肝癌組織以及癌旁正常肝組織進(jìn)行脫蠟至水和抗原修復(fù)處理，隨后用含有隨機(jī)探針的封閉液封閉組織對核酸探針的非特異性吸附。然后分別滴加體積100μl濃度為250nm的核酸適配體cy5-sw1和cy5-random與肝癌組織室溫孵育半小時，之后用洗滌緩沖液浸潤洗滌3次，每次3min。隨后滴加100μl濃度為10μg/ml的dapi溶液對細(xì)胞核染色，洗滌緩沖液洗滌1次，滴加適量甘油封片劑，蓋上蓋玻片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下，檢測結(jié)果如圖2所示(圖中的兩組圖片，一組是cy5熒光通道的成像，一組是cy5熒光通道與細(xì)胞核染料dapi熒光通道的疊加成像，是同一個照片不同通道的信息)。同時按照同樣的方法將核酸適配體cy5-sw1和cy5-random于正常肝組織進(jìn)行孵育，作為對照。從圖2的檢測結(jié)果表明：本實施例的核酸適配體cy5-sw1能結(jié)合人臨床肝癌組織切片，而且不識別癌旁正常肝組織切片。陰性探針(即上述的陰性探針：cy5-random)與靶細(xì)胞和對照細(xì)胞也均無識別?？疾?：流式細(xì)胞術(shù)檢測核酸適配體cy5-sw1和cy5-random對固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的結(jié)合效果。將生長狀態(tài)良好的肝癌smmc-7721細(xì)胞消化下來，加rimp1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度為106個/ml。再加400μl預(yù)冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs輕輕吹打，2000rpm離心洗滌3次去除固定液。然后加入200μl的透化液(透化液為0.1％tritonx-100)處理細(xì)胞10min，pbs洗滌一次后，加入400μl封閉液處理細(xì)胞30min。配置濃度為250nm的核酸適配體cy5-sw1和cy5-random，分別將核酸適配體cy5-sw1和cy5-random與肝癌smmc-7721細(xì)胞在室溫下避光孵育30min，之后用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min。加200μl結(jié)合緩沖液重懸后用流式細(xì)胞儀收集信號，檢測結(jié)果如圖3所示。從圖3的檢測結(jié)果表明：核酸適配體cy5-sw1能與多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞結(jié)合，其結(jié)合強(qiáng)度明顯高于cy5-random與固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的結(jié)合強(qiáng)度。考察4：流式細(xì)胞術(shù)測定核酸適配體cy5-sw1與多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的解離常數(shù)。平行配置濃度分別為1000nm，500nm，125nm，62.5nm，15.625nm，4nm，1nm，0.5nm的核酸適配體cy5-sw1的探針溶液。將生長狀態(tài)良好的肝癌smmc-7721細(xì)胞消化下來制成細(xì)胞懸浮液，加預(yù)冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs輕輕吹打，2000rpm離心洗滌3次去除固定液。細(xì)胞經(jīng)過透化處理以及用封閉液封閉組織的非特異性吸附后，分別取上述不同濃度的核酸適配體cy5-sw1的探針溶液與肝癌smmc-7721細(xì)胞在室溫下孵育30min，之后用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min。加200μl結(jié)合緩沖液重懸后用流式細(xì)胞儀收集信號。實驗中每種濃度均設(shè)置了三個平行樣，收集fl4通道的信號。利用sigmaplot軟件，把核酸適配體濃度和凈熒光強(qiáng)度的數(shù)值代入單點(diǎn)吸附模型由y＝bmax×x/(kd+x)即可模擬核酸適配體的解離常數(shù)kd值。解離常數(shù)的曲線圖如圖4所示，由此可得到解離平衡常數(shù)kd如下表1所示。表1：解離常數(shù)結(jié)果序列名kd(nm)sw1123.62±17.53圖4及表1的檢測結(jié)果表明：本實施例的核酸適配體sw1對多聚甲醛固定的smmc-7721細(xì)胞的結(jié)合能力很強(qiáng)，解離常數(shù)在納摩爾級別。考察5：激光共聚焦掃描顯微鏡檢測核酸適配體cy5-sw1和cy5-random對多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的結(jié)合情況。將生長狀態(tài)良好的肝癌smmc-7721細(xì)胞消化下來制成細(xì)胞懸浮液，取適量細(xì)胞懸浮液移至激光共聚焦專用的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h左右，至細(xì)胞密度適中，狀態(tài)良好，加入pbs洗滌2次，隨后滴加400μl預(yù)冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs輕輕吹打后棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次去除固定劑。加入200μl的透化液處理細(xì)胞10min，pbs洗滌一次后，加入400μl封閉液處理細(xì)胞30min。隨后滴加200μl濃度為250nm的cy5標(biāo)記的ssdna溶液室溫孵育30min，之后用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min。隨后滴加100μl濃度為10μg/ml的dapi溶液對細(xì)胞核染色，洗滌緩沖液洗滌1次，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，檢測結(jié)果如圖5所示(圖中的兩組圖片，一組是cy5熒光通道的成像，一組是cy5熒光通道與細(xì)胞核染料dapi熒光通道的疊加成像，是同一個照片不同通道的信息)。圖5的檢測結(jié)果表明：本實施例的核酸適配體sw1對多聚甲醛固定的smmc-7721細(xì)胞有很明顯的結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)位于細(xì)胞核，其結(jié)合強(qiáng)度明顯高于cy5-random與固定的肝癌smmc-7721細(xì)胞的結(jié)合強(qiáng)度。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>湖南大學(xué)<120>用于檢測肝癌的核酸適配體及檢測試劑盒<130>無<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>80<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(80)<223>根據(jù)實驗要求而設(shè)計，作為用于檢測肝癌的核酸適配體sw1。<400>1atccattgccactgactaccagccgggtgggtgggggggtttgctggtatcgcattgtgc60gaagtcagtcggtcgttagt80當(dāng)前第1頁12