本發(fā)明涉及一種dna片段，特別涉及一種枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)有價(jià)值的外源蛋白質(zhì)是當(dāng)今生物技術(shù)研究與開發(fā)的熱點(diǎn)之一。細(xì)菌具有生長快、易培養(yǎng)、表達(dá)量高以及分子操作簡單的特點(diǎn)，這使得它們已廣泛地開發(fā)應(yīng)用于異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。其中，枯草芽抱桿菌由于其安全無毒、遺傳背景清晰、分泌表達(dá)水平高等諸多優(yōu)點(diǎn)，而成為工業(yè)用理想的宿主細(xì)胞。

枯草芽抱桿菌中表達(dá)異源蛋白需要各種元件，其中啟動(dòng)子對(duì)于表達(dá)水平的影響至關(guān)重要。通常有兩種思路進(jìn)行啟動(dòng)子的遺傳改造：一種方式是對(duì)目的基因本身的啟動(dòng)子進(jìn)行突變改造，從而提高啟動(dòng)子的活性；另一種方式是將原有的啟動(dòng)子替換成其他的天然或人工構(gòu)建的啟動(dòng)子，從而徹底改變下游基因的表達(dá)譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的人為控制。目前成功用于枯草芽抱桿菌表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子主要有p43、pamyq、pspac、pxyla等，這些啟動(dòng)子在實(shí)驗(yàn)室的富集培養(yǎng)基中表現(xiàn)良好，但鮮見它們被用于酶蛋白的工業(yè)放大生產(chǎn)。因此，有必要找到更高效的、適合于工業(yè)培養(yǎng)基生產(chǎn)表達(dá)的啟動(dòng)子，以適應(yīng)發(fā)酵對(duì)表達(dá)水平越來越高的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段，所述dna片段為如下任一序列：

(a)如seqidno.1所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列；

(b)對(duì)如seqidno.1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、缺失或添加所獲得的，具有與seqidno.1所示的核苷酸序列相同的作為啟動(dòng)子功能的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列；

(c)對(duì)如seqidno.1所示的核苷酸序列添加一個(gè)或多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列。

所述的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列為如seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述的枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段在蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

一種載體，包含如seqidno.1所示的核苷酸序列和如seqidno.2所示的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列。

所述的載體優(yōu)選為質(zhì)粒載體，含有如seqidno.7所示的核苷酸序列。

一種表達(dá)質(zhì)粒，包含上述載體以及與該載體可操作連接的位于所述具有啟動(dòng)子功能的dna片段下游編碼異源蛋白質(zhì)核苷酸序列。

所述的異源蛋白質(zhì)核苷酸序列為好熱地芽孢桿菌(geobacilluskaustophilus)編碼的耐熱β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，或?yàn)槊溍咕?streptomycesmobaraensia)編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的核苷酸序列。

一種重組工程細(xì)胞，為上述載體或者上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞得到的細(xì)胞株。

所述的宿主細(xì)胞為芽孢桿菌。

所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

1、本發(fā)明涉及運(yùn)用rna-seq技術(shù)測定枯草芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長后期的全基因轉(zhuǎn)錄組，篩選高表達(dá)的基因，在枯草芽孢桿菌中找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄活性高的基因?？寺∷Y選的高表達(dá)基因?qū)?yīng)的啟動(dòng)子序列，并應(yīng)用于耐熱β-半乳糖苷酶基因(bgab)的表達(dá)，通過測定bgab的活性，證明篩選的啟動(dòng)子在枯草芽孢桿菌中具有高活性。應(yīng)用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mtg)的表達(dá)，通過sds-page電泳圖驗(yàn)證其蛋白表達(dá)。

2、本發(fā)明提供了一種dna片段，該dna是一啟動(dòng)子，具有很強(qiáng)的特異表達(dá)活性，在不需要添加誘導(dǎo)物的條件下即能實(shí)現(xiàn)外源基因的高表達(dá)，將其運(yùn)用于耐熱β-半乳糖苷酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)，特別是為枯草芽孢桿菌表達(dá)外源基因提供了有效的工具。

附圖說明

圖1是實(shí)施例2中生長對(duì)數(shù)后期的枯草芽孢桿菌提取總rna電泳圖；其中，泳道1和2分別為生長對(duì)數(shù)后期的枯草芽孢桿菌提取總rna。

圖2是實(shí)施例3中擴(kuò)增pydza的pcr產(chǎn)物電泳圖；其中，泳道m(xù)為dnamarker，泳道1和2為pydza的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3是實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-bgab的構(gòu)建示意圖。

圖4是實(shí)施例5中擴(kuò)增pydza+samyq片段電泳圖；其中，泳道m(xù)為dnamarker，泳道1和2為pydza+samyq擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖5是實(shí)施例5表達(dá)質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-promtg的構(gòu)建示意圖。

圖6是實(shí)施例6b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)轉(zhuǎn)化子mtg表達(dá)的sds-page電泳膠圖；其中，泳道m(xù)為蛋白marker，泳道1為枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051胞外分泌蛋白，泳道2為b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)胞外分泌蛋白，箭頭表示目的蛋白mtg的位置。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括pcr擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、dna片段酶切、連接、凝膠電泳等具體參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(sambrookj,russelldw,janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)。

從一株枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168，購于廣東省微生物菌種保藏中心)培養(yǎng)的生產(chǎn)對(duì)數(shù)后期階段提取細(xì)菌rna。對(duì)細(xì)菌rna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序建庫，去掉核糖體rna，對(duì)mrna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄建立cdna文庫。對(duì)細(xì)菌全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,根據(jù)代表基因轉(zhuǎn)錄水平的rpkm值判斷其表達(dá)量水平較高的基因，然后分析其啟動(dòng)子區(qū)。將所選的啟動(dòng)子接入載體，測定啟動(dòng)子在枯草芽孢桿菌中的活性。

實(shí)施例1

細(xì)菌的培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168)從-80℃甘油管取出劃線于lb固體平板上37℃培養(yǎng)16～24h，挑取單菌落于10ml的1％終濃度玉米淀粉的lb液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)至od60020～25(分光光度計(jì),日本hitachi公司)。

實(shí)施例2

細(xì)菌總rna的提取、轉(zhuǎn)錄組文庫的建立及rna-seq測序：收集實(shí)施例1得到的細(xì)胞培養(yǎng)液1ml于8000g快速離心1min，用于提取細(xì)菌總rna(見圖1)。具體的提取方法參考o(jì)megabio-tek公司的細(xì)菌總rna提取試劑盒。用于rna-seq測序文庫制備的樣品經(jīng)agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測合格，經(jīng)過dnasei(rnasefree)處理混入的dna分子，用ribo-zero(gram-positivebacteria)kit(usa)去掉占總rna絕大多數(shù)的rrna，純化得到的mrna。將mrna先打斷為合適大小的片段，以片段化的mrna為模板，加入反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物，合成雙鏈cdna，然后用試劑盒qiaquickpcrpurificationkit(qiagen)純化合成的cdna。補(bǔ)平cdna的粘性末端，然后在一條鏈上加上一個(gè)腺嘌呤核苷酸，以這個(gè)突出的a配對(duì)含有突出的t的一級(jí)接頭序列。在分別能配對(duì)一級(jí)接頭兩端的引物存在的條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增，經(jīng)過多次循環(huán)，將pcr結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳并切膠回收預(yù)定大小的膠帶，這時(shí)得到的加上二級(jí)接頭的序列組成的文庫進(jìn)行上機(jī)測序(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一種具有啟動(dòng)子功能的dna片段與應(yīng)用.cn201510074949.0[p].2015.方法)。rna-seq文庫的測序由廣州基迪奧生物科技有限公司提供測序服務(wù)。測序時(shí)分別將兩端向中心的100bp的序列信息讀出(pe100)，稱為reads，將這些reads比對(duì)到細(xì)菌基因組上就可以進(jìn)行注釋及表達(dá)量計(jì)算等后續(xù)生物信息學(xué)分析。

實(shí)施例3

篩選并克隆啟動(dòng)子片段：通過rna-seq測序數(shù)據(jù)分析枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及全基因組分析含有轉(zhuǎn)錄起始位置的基因，通過rpkm量化，篩選一株表達(dá)量高的基因，其核苷酸序列如下所示：

cgttctgttacagatggaggcgacagcttaatttttctgcctaattccctcatcgacaaacggctgtccttcttcagctcctcaatgatattcagatcaatctggtcaagtttcatttcaacatccttcttttttgattttgtacacattatctcgggtatttttgtaaatgacaagtacagttccctagaaaaggcatgtaaaaatgaatgttttccgaacattttttgaaagctgtcatatgcccccccggattgtttatagtataaaatgaaaacgtgtccacaaggagggcgattt。

以菌株枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168)的基因組dna為模板，引物f-pydza(5’-cggaattccgttctgttacagatggagg-3’)和r-pydza(5’-ggactagtaaatcgccctccttgtggac-3’)進(jìn)行擴(kuò)增300bp大小的dna片段，即pydza啟動(dòng)子片段(見圖2)，與目的產(chǎn)物大小相符。引入酶切位點(diǎn)ecori，spei。

實(shí)施例4

構(gòu)建bgab表達(dá)質(zhì)粒：以質(zhì)粒pbe-rbs-samyq-bgab(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一種具有啟動(dòng)子功能的dna片段及其應(yīng)用.cn201610430767.7[p].2016.構(gòu)建)為表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ecori和spei在酶切位點(diǎn)切開成線性質(zhì)粒，將實(shí)施例3中得到帶ecori，spei酶切位點(diǎn)的pydza啟動(dòng)子片段經(jīng)過酶切、純化后插入該線性質(zhì)粒構(gòu)建得到目的啟動(dòng)子的bgab基因胞外表達(dá)質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-bgab(見圖3)。

實(shí)施例5

構(gòu)建mtg表達(dá)質(zhì)粒：以質(zhì)粒pbep43-promtg(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一株重組的枯草芽孢桿菌及其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.構(gòu)建)為表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和bamhⅰ的酶切位點(diǎn)。以pbe-pydza-samyq-bgab質(zhì)粒為模板，引物f-pydza(5’-cggaattccgttctgttacagatggagg-3’)、r-samyq(5’-aaggatccggctgatgtttttgtaatcg-3’)擴(kuò)增5’端帶有ecorⅰ酶切位點(diǎn)，3’端帶有bamhⅰ酶切位點(diǎn)的約450bppydza-samyq片段(見圖4)。用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和bamhⅰ消化pydza-samyq片段，回收，純化后插入用相同內(nèi)切酶酶切位置的質(zhì)粒pbep43-promtg，構(gòu)建得到mtg表達(dá)胞外質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-promtg(見圖5)。其中：pydza-samyq核苷酸序列為：

cgttctgttacagatggaggcgacagcttaatttttctgcctaattccctcatcgacaaacggctgtccttcttcagctcctcaatgatattcagatcaatctggtcaagtttcatttcaacatccttcttttttgattttgtacacattatctcgggtatttttgtaaatgacaagtacagttccctagaaaaggcatgtaaaaatgaatgttttccgaacattttttgaaagctgtcatatgcccccccggattgtttatagtataaaatgaaaacgtgtccacaaggagggcgatttcaattataggtaagagaggaatgtcgacatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcc。

實(shí)施例6

啟動(dòng)子表達(dá)水平的檢測：將構(gòu)建好的目的啟動(dòng)子的bgab表達(dá)質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-bgab和mtg表達(dá)質(zhì)粒pbe-pydza-samyq-promtg以及質(zhì)粒pbep43-promtg(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一株重組的枯草芽孢桿菌及其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.構(gòu)建)先用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(e.colijm110)，得到陽性克隆子，經(jīng)測序后提取質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051，具體方法參考非專利文獻(xiàn)記錄nataliap，zakataeva，oksanavetal.asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationintochromosomeofnaturallynontransformablebacillusamyloliquefaciensstrains[j].applmicrobiolbiotechnol.2010,85:1201-1209)，得轉(zhuǎn)化菌株b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)。

將得到的轉(zhuǎn)化子b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-pydza-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)培養(yǎng)于10mllb培養(yǎng)基中(卡那霉素20μg/ml)，37℃，200rpm活化12h，將活化的種子液接種于50mllb培養(yǎng)基中(卡那霉素20μg/ml，1％(w/w)玉米淀粉)，接種量為1％(體積比)，37℃，200rpm總發(fā)酵48h，每隔12小時(shí)取樣。

β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的測定：將32μl發(fā)酵上清液與288μl0.25％onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside，鄰硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷)混合，55℃下溫育15min，反應(yīng)終止加入320μl的10％(w/w)na2co3。反應(yīng)呈顯色反應(yīng)，在405nm波長下測定吸光值。對(duì)照菌株b.subtilisatcc6051(pbe-rbs-samyq-bgab)無顯色反應(yīng)，在405nm波長下測定吸光值與空白對(duì)照(lb)差不多，無β-葡萄糖半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明啟動(dòng)子pydza啟動(dòng)β-葡萄糖半乳糖苷酶表達(dá)，36h達(dá)到最高酶活44.3u/ml。

sds-page：將36h發(fā)酵液離心取上清，上清液跑sds-page電泳，與野生型枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051作為對(duì)照，蛋白膠圖顯示在44-46kda有條帶和mtg蛋白大小一致，而野生型對(duì)照在此大小范圍內(nèi)無條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明mtg蛋白酶原得到表達(dá)(見圖6)。

mtg酶活的測定：取0.2ml發(fā)酵上清液，加入50μl0.1％的胰蛋白酶，混勻后37℃水浴10min，即得到成熟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。酶活測定采用crossowicz比色法，以n-α-cbz-gln-gly作為底物，將150μl的底物與50μl激活后的成熟酶混勻后37℃反應(yīng)10min，然后迅速加入200μl的反應(yīng)終止劑鹽酸-氯化鐵-三氯乙酸(3moll/的鹽酸、12％(v/v)三氯乙酸和5％(w/v)氯化鐵按1:1:1的比例混合。)，同時(shí)以l-谷氨酸-γ-單羥肟酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀測量反應(yīng)液在525nm下的吸光值。酶活力單位定義為：37℃時(shí)1min催化n-α-cbz-gln-gly生成1μmoll-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。野生菌株b.subtilisatcc6051無顯色反應(yīng)，吸光值與空白對(duì)照(lb)差不多，沒有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。結(jié)果表明啟動(dòng)子pydza表達(dá)mtg，36h達(dá)到最高酶活82.68u/ml，相比傳統(tǒng)強(qiáng)啟動(dòng)子p43表達(dá)mtg在36h的酶活61.59u/ml高了1.3倍。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>一種枯草芽孢桿菌具有啟動(dòng)子功能的dna片段及其應(yīng)用

<130>1

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>300

<212>dna

<213>枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）

<400>1

cgttctgttacagatggaggcgacagcttaatttttctgcctaattccctcatcgacaaa60

cggctgtccttcttcagctcctcaatgatattcagatcaatctggtcaagtttcatttca120

acatccttcttttttgattttgtacacattatctcgggtatttttgtaaatgacaagtac180

agttccctagaaaaggcatgtaaaaatgaatgttttccgaacattttttgaaagctgtca240

tatgcccccccggattgtttatagtataaaatgaaaacgtgtccacaaggagggcgattt300

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列

<400>2

caattataggtaagagaggaatgtcgac28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-pydza

<400>3

cggaattccgttctgttacagatggagg28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-pydza

<400>4

ggactagtaaatcgccctccttgtggac28

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-samyq

<400>5

aaggatccggctgatgtttttgtaatcg28

<210>6

<211>421

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pydza-samyq

<400>6

cgttctgttacagatggaggcgacagcttaatttttctgcctaattccctcatcgacaaa60

cggctgtccttcttcagctcctcaatgatattcagatcaatctggtcaagtttcatttca120

acatccttcttttttgattttgtacacattatctcgggtatttttgtaaatgacaagtac180

agttccctagaaaaggcatgtaaaaatgaatgttttccgaacattttttgaaagctgtca240

tatgcccccccggattgtttatagtataaaatgaaaacgtgtccacaaggagggcgattt300

caattataggtaagagaggaatgtcgacatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgtt360

cagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagc420

c421

<210>7

<211>328

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>dna片段+核糖體結(jié)合序列

<400>7

cgttctgttacagatggaggcgacagcttaatttttctgcctaattccctcatcgacaaa60

cggctgtccttcttcagctcctcaatgatattcagatcaatctggtcaagtttcatttca120

acatccttcttttttgattttgtacacattatctcgggtatttttgtaaatgacaagtac180

agttccctagaaaaggcatgtaaaaatgaatgttttccgaacattttttgaaagctgtca240

tatgcccccccggattgtttatagtataaaatgaaaacgtgtccacaaggagggcgattt300

caattataggtaagagaggaatgtcgac328