本發(fā)明涉及基因工程及農(nóng)業(yè)類畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用乳腺生物反應(yīng)器提高乳汁中褪黑素含量的方法。

背景技術(shù)：

褪黑素(n-acetyl-5-methoxytryptamine)是一種生物鐘的調(diào)節(jié)激素，參與神經(jīng)和外周組織細(xì)胞時(shí)鐘基因的表達(dá)調(diào)控。褪黑素是兩親分子，容易進(jìn)入所有的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)空間，包括細(xì)胞膜膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中。在各種各樣復(fù)雜的生理活動中，褪黑素是一種強(qiáng)效的活性氧(ros)和活性氮(rns)的自由基清除劑。乙?；D(zhuǎn)移酶(aanat)和羥基吲哚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(hiomt)被證明是合成褪黑素的關(guān)鍵限速酶。血液褪黑素主要合成器官在松果體中，5-羥色胺(5-ht)來自血液中的色氨酸的脫羧反應(yīng)，在aanat的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰基-五羥色胺(nas)；在乙酰血清素-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(hiomt)的催化下，合成褪黑素。松果體中aanat酶的活力受光的抑制，表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，其活力與血液及松果體褪黑素水平一致；hiomt在褪黑素周期中發(fā)揮重要作用，其活力與褪黑素的產(chǎn)生呈正相關(guān)。研究表明這兩種酶是褪黑素合成途徑中的重要催化劑，直接影響褪黑素的合成產(chǎn)量。

褪黑素在不同組織中具有多種生物活性。褪黑素的代謝產(chǎn)物n-acetyl-n-formyl-5-methoxykynuramine(afmk)和n-acetyl-5-methoxykynuramine(amk)也是高效的抗氧化劑。褪黑素與自由基發(fā)生的反應(yīng)是一種不可逆的氧化反應(yīng)，不能被循環(huán)利用，它在氧化過程中形成的各級中間代謝產(chǎn)物都具有顯著的抗氧化能力，有的作用甚至超過褪黑素本身，形成褪黑素級聯(lián)放大的抗氧化機(jī)制。褪黑素被認(rèn)為是一種抗衰老的激素，它還具有提高睡眠質(zhì)量和發(fā)展免疫的功能。其中，已知褪黑素可以影響胃腸道平滑肌，具有放松平滑肌和催眠的效果。它可能有助于嬰兒更好的夜間睡眠，從而促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)展和早期的晝夜節(jié)律建立。外源低濃度的褪黑素可以迅速吸收，發(fā)揮抗氧化、抗炎癥作用從而影響并調(diào)節(jié)免疫功能。例如，國外已有高褪黑素含量牛奶“nightmilk”等上市，有更好的促進(jìn)睡眠效果和提高免疫力的功能。在綿羊乳腺中高表達(dá)褪黑素合成限速酶aanat和hiomt，催化5-羥色胺合成高水平褪黑素，使乳汁中褪黑素含量進(jìn)一步提高，不僅可以使羔羊增強(qiáng)免疫力，提高成活率；同時(shí)對于褪黑素功能乳的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，提高東弗利生等乳用羊的產(chǎn)品附加值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用乳腺生物反應(yīng)器提高乳汁中褪黑素含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供過表達(dá)褪黑素關(guān)鍵合成酶aanat和hiomt基因的原核胚的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)分別將褪黑素關(guān)鍵合成酶aanat和hiomt的cdna插入表達(dá)載體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體；

(2)cas9cdna及sgrna的制備：將經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的cas9序列及sgrna序列分別構(gòu)建到包含t7啟動子的載體上，然后通過體外轉(zhuǎn)錄分別得到cas9cdna及sgrna產(chǎn)物并純化；

其中，sgrna的作用位點(diǎn)位于羊mstn基因第三外顯子區(qū)，sgrna作用位點(diǎn)的核苷酸序列為5’-gacatctttgtaggagtacagcaa-3’；

cas9cdna的核苷酸序列如seqidno:1所示；

(3)將(1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體線性化，然后與cas9cdna及sgrna一起導(dǎo)入哺乳動物的原核期胚胎細(xì)胞中，即得。

本發(fā)明所述褪黑素關(guān)鍵合成酶aanat和hiomt的cdna來自羊松果體細(xì)胞。優(yōu)選杜泊羊松果體細(xì)胞。

前述方法中，步驟(1)所述表達(dá)載體為pbc1(攜帶有酪蛋白啟動子)。分別將aanat和hiomt的cdna插入載體pbc1的xhoi多克隆位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)載體pbc1-aanat和pbc1-hiomt(質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖9和圖10，載體pbc1-aanat的全序列如seqidno:2所示，將seqidno:2中第8614～9240位堿基替換成seqidno:3所示序列即為載體pbc1-hiomt的全序列)。

前述的方法，步驟(3)是將重組表達(dá)載體pbc1-aanat、pbc1-hiomt分別用sali和noti限性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，分別回收大片段(長度分別為16391bp和16795bp)，然后與cas9cdna及sgrna一起通過原核顯微注射直接注入羊原核胚的細(xì)胞質(zhì)中。

進(jìn)行顯微注射時(shí)，大片段的注射濃度為80ng/μl；cas9cdna的注射濃度為838ng/μl；sgrna的注射濃度為38.7ng/μl；單枚原核胚注射總體積為10pl。

本發(fā)明還提供按照上述方法制備的過表達(dá)褪黑素關(guān)鍵合成酶aanat和hiomt基因的原核胚。

本發(fā)明還提供所述原核胚在制備動物乳腺反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因動物以及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種利用乳腺生物反應(yīng)器提高乳汁中褪黑素含量的方法，其是將所述原核胚移入受體羊的輸卵管中，經(jīng)過妊娠、分娩，獲得陽性轉(zhuǎn)基因羊，獲得的轉(zhuǎn)基因羊的原代或后代母羊在泌乳期的乳汁中產(chǎn)生褪黑素，從而提高乳汁中褪黑素含量。

其中，用于鑒定陽性轉(zhuǎn)基因羊的特異性pcr引物包括：

a8-f5’-gtccagcacttcctgaccct-3’

mlt-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’；

h4-f5’-atacgctgtttcctcatcttcc-3’

mlt-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’；

pbc1-f5’-gattgacaagtaatacgctgtttcctc-3’

pbc1-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’。

所述泌乳期包括人工誘導(dǎo)泌乳期和自然分泌泌乳期；所述人工誘導(dǎo)泌乳期和自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。

本發(fā)明所述羊?yàn)榫d羊。

本發(fā)明進(jìn)一步提供按照上述方法制備的褪黑素功能乳。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明利用羊乳腺反應(yīng)器合成褪黑素限速酶，從而生產(chǎn)天然褪黑素和褪黑素功能乳。在將羊自身的褪黑素合成酶cdna連接酪蛋白啟動子整合到羊基因組中，最大程度地減少了轉(zhuǎn)基因動物自身的外來蛋白的影響。轉(zhuǎn)入的基因中無標(biāo)記、無抗性基因、也無細(xì)菌載體片段，不僅避免了密碼子偏好的問題，更符合轉(zhuǎn)基因安全的要求。

(二)通過高效的crispr/cas9系統(tǒng)，制作褪黑素乳腺生物反應(yīng)器，獲得的羊aanat和hiomt基因拷貝數(shù)增加1個(gè)以上，aanat和hiomt蛋白表達(dá)上升。利用乳腺生產(chǎn)高水平天然褪黑素，不僅可以提高乳腺健康水平、生產(chǎn)高質(zhì)量的乳汁，增強(qiáng)羔羊免疫力，提高羔羊成活率；還可以解決目前褪黑素主要依賴化學(xué)合成，造成微量雜質(zhì)殘留的問題，又可以規(guī)避生物提取潛在的病原物質(zhì)感染的風(fēng)險(xiǎn)。而且羊乳腺反應(yīng)器和產(chǎn)品均具有重要的研究價(jià)值和商業(yè)前景。

(三)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的陽性轉(zhuǎn)基因羊乳腺細(xì)胞褪黑素合成酶的表達(dá)量顯著提高。在催乳素誘導(dǎo)下，陽性乳腺細(xì)胞可合成高水平褪黑素，并且陽性羊血液中的褪黑素水平也顯著高于普通羊。轉(zhuǎn)基因羊整個(gè)泌乳期階段都具有分泌褪黑素合成酶的能力，并且通過育種選擇，能進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因羊的褪黑素表達(dá)量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中線性化pbc1-aanat/hiomt載體結(jié)構(gòu)示意圖。其中，線性化的pbc1-aanat為16391bp，pbc1-hiomt為16795bp；pβ-casein為羊β-casein啟動子；e1為羊β-casein外顯子1；ivs1為羊β-casein內(nèi)含子1。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因后代的aanat、hiomt基因southern檢測結(jié)果。其中，aanat基因陽性條帶約為5.2kb，1-5為pcr陽性個(gè)體，wt為陰性對照，p為表達(dá)載體質(zhì)粒。hiomt基因陽性條帶約為700bp，內(nèi)源條帶約為11kb，1-10為pcr陽性個(gè)體，wt為陰性對照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞系中aanat和hiomt基因相對表達(dá)量。其中，*表示差異顯著，p<0.05，**表示差異極顯著，p<0.01，n＝4。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞勻漿中褪黑素含量。其中，*表示差異顯著，p<0.05，n＝4。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因陽性羊早晚血清中褪黑素濃度。其中，*表示差異顯著，p<0.05，**表示差異極顯著，p<0.01，n＝14。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加5-ht(10^-4mol/l)后，隨時(shí)間變化的褪黑素合成量。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因后代乳腺上皮細(xì)胞aanat和hiomt相對表達(dá)量。其中，**表示差異極顯著，p<0.01，n＝4。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中乳腺細(xì)胞合成酶表達(dá)量及奶中褪黑素的濃度。其中，a中1-4為轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體，5-8為野生型個(gè)體；b中**表示差異極顯著，p<0.01，n＝4。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)載體pbc1-aanat的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)載體pbc1-hiomt的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1利用羊乳腺生物反應(yīng)器提高乳汁中褪黑素含量的方法

1.基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

從杜泊羊松果體中提取總rna(ovisaries)，合成cdna第一鏈。分別擴(kuò)增出aanat和hiomt完整的開放閱讀框(orf)和部分上下游非編碼區(qū)(引物見表1)。aanat和hiomt的pcr產(chǎn)物單酶切后連接到pmd^tm19-t載體中測序,基因片段的大小分別為634bp和1048bp。測序驗(yàn)證后的cdna片段連接到乳腺特異性表達(dá)載體pbc1(invitrogen)上。重組載體命名為pbc1-aanat和pbc1-hiomt(seqidno:1和2，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖9和圖10)。兩者均由β-酪蛋白啟動子驅(qū)動生產(chǎn)重組蛋白。線性化pbc1-aanat/hiomt載體結(jié)構(gòu)見圖1。

表1基因克隆引物

2.cas9cdna及sgrna的制備

將經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的cas9序列及sgrna序列分別構(gòu)建到包含t7啟動子的載體pcdna3.1(+)(invitrogen)上，然后通過體外轉(zhuǎn)錄分別得到cas9cdna及sgrna產(chǎn)物并純化。

其中，sgrna的作用位點(diǎn)位于羊mstn基因第三外顯子區(qū)，sgrna作用位點(diǎn)的核苷酸序列為5’-gacatctttgtaggagtacagcaa-3’。

cas9cdna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

3.原核胚細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊

乳腺表達(dá)載體pbc1-aanat和pbc1-hiomt進(jìn)行線性化處理。利用sali和noti限性內(nèi)切酶可以釋放5.9kb的細(xì)菌質(zhì)粒部分與線性dna大片段，dna大片段長度分別為16391bp和16795bp。線性dna為表達(dá)構(gòu)件、包含調(diào)控元件和插入的目的基因cdna。

以杜泊羊?yàn)楣w進(jìn)行超數(shù)排卵。通過等量混合pbc1-aanat和pbc1-hiomt兩個(gè)表達(dá)載體，以及cas9cdna和sgrna，采用原核顯微注射直接注入羊原核胚的細(xì)胞質(zhì)中，生產(chǎn)過表達(dá)褪黑素合成基因的綿羊后代。

大片段的注射濃度為80ng/μl；cas9cdna的注射濃度為838ng/μl；sgrna的注射濃度為38.7ng/μl；單枚原核胚注射總體積為10pl。

從62只供體羊中共獲得593枚原核注射胚胎，移植到所有150個(gè)受體母羊輸卵管內(nèi)，21天超聲檢查后77只妊娠，妊娠率為51.33％(表2)。我們共獲得98只胚胎移植綿羊后代，其中包括經(jīng)測序鑒定的34只轉(zhuǎn)基因陽性羔羊，產(chǎn)羔率和轉(zhuǎn)基因pcr測序鑒定陽性率分別為65.33％和34.69％(表2)。其中，有7只攜帶外源aanat基因，2只攜帶外源hiomt基因，其余25羔羊同時(shí)攜帶aanat和hiomt兩種基因。

表2原核注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊統(tǒng)計(jì)

表3轉(zhuǎn)基因后代鑒定引物

*a8-f、h4-f分別鑒定轉(zhuǎn)入的aanat、hiomt基因，與mlt-r共同使用；利用pbc1-f/r鑒定轉(zhuǎn)aanat基因后代，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為765bp，利用pbc1-f/r鑒定轉(zhuǎn)hiomt基因后代，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1169bp。

通過southern印跡雜交法進(jìn)一步驗(yàn)證pcr測序結(jié)果(圖2)。使用dig標(biāo)記aanat基因的探針分別與個(gè)體基因組及載體質(zhì)粒雜交?；蚪M與載體質(zhì)粒均用hindⅲ單酶切徹底消化，獲得陽性條帶約為5.2kb。wt為野生型個(gè)體，p為表達(dá)載體。重復(fù)驗(yàn)證個(gè)體共5個(gè)，標(biāo)號分別為1-5號陽性個(gè)體。

4.細(xì)胞系中aanat和hiomt基因表達(dá)水平

從整合外源aanat和hiomt基因的母羊乳腺處取得上皮細(xì)胞，經(jīng)催乳素誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便通過β-酪蛋白啟動子啟動外源基因的表達(dá)。q-pcr檢測發(fā)現(xiàn)在陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中，與轉(zhuǎn)染空白載體和對照組細(xì)胞系相比，24h至48h范圍內(nèi)aanat和hiomt基因在mrna水平表達(dá)差異極顯著(n＝4，p＜0.01；圖3)。

轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞勻漿中褪黑素含量見圖4。

5.轉(zhuǎn)基因后代aanat和hiomt基因表達(dá)水平

獲得轉(zhuǎn)aanat和hiomt雙基因群體后，分別在早晨4：00和下午16:00對其血清中褪黑素水平進(jìn)行了測定。轉(zhuǎn)基因組與野生型組羊相比4:00和16:00褪黑素濃度差異不顯著(n＝10，p>0.05)(圖5)。

取泌乳期轉(zhuǎn)基因和野生型羊乳腺上皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)下并檢測基因表達(dá)情況。褪黑素的測定表明，通過培養(yǎng)基添加底物5-ht(10^-4mol/l)，2小時(shí)后發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞之間差異顯著(n＝4，p＜0.01。圖6)。q-pcr顯示轉(zhuǎn)基因個(gè)體與陰性或是野生型個(gè)體相比，mrna轉(zhuǎn)錄水平的差異極顯著(n＝4，p＜0.01)，高出約10倍(圖7)。western印記雜交法測定活性受調(diào)控的合成限速酶aanat表達(dá)水平。轉(zhuǎn)基因合成限速酶aanat(23kd)表達(dá)水平明顯高于野生型(1-4為轉(zhuǎn)基因個(gè)體，4-8為野生型個(gè)體。內(nèi)參actin-β43kd，圖8a)。分別在4：00和16:00對轉(zhuǎn)基因組羊奶中褪黑素水平進(jìn)行了測定。轉(zhuǎn)基因組羊奶中夜間褪黑素含量極顯著地高于野生型組(n＝4，p＜0.01，圖8b)，提高3倍左右。

本發(fā)明利用原核注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊，快速引入新的基因——褪黑素合成限速酶基因，產(chǎn)生期望的生產(chǎn)性狀——乳中高含量天然褪黑素。并在此基礎(chǔ)上建立育種群體，進(jìn)一步選育表達(dá)性狀優(yōu)良的個(gè)體，為家畜新品種培育打下良好基礎(chǔ)。同時(shí)能提高羔羊的健康狀況、提高存活率，為羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)服務(wù)。在新品種培育的基礎(chǔ)上，該技術(shù)用于開發(fā)褪黑素功能乳產(chǎn)品，發(fā)揮其保健功能的作用以便人類利用，具有積極的社會效益。

羊奶營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)良，經(jīng)濟(jì)效益高，隨著國內(nèi)消費(fèi)水平的提高，羊奶的市場前景非常廣闊。通過乳腺特異表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)褪黑素合成酶在綿羊乳腺中高效表達(dá)，使乳腺分泌高水平褪黑素，改善母羊乳腺功能和羊奶品質(zhì)，進(jìn)一步獲得具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的褪黑素功能乳轉(zhuǎn)基因羊，可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

與傳統(tǒng)的原核顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法(轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率約10％，轉(zhuǎn)基因羊陽性率約2～10％)相比，本發(fā)明具有很高的陽性率達(dá)到34.69％。同時(shí)，相比傳統(tǒng)的原核注射技術(shù)，本方法可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合，可控性和安全性高。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>利用乳腺生物反應(yīng)器提高乳汁中褪黑素含量的方法

<130>khp171110979.6

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>4263

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aagcttgccaccatggactataaggaccacgacggcgactacaaggatcacgacattgat60

tataaagacgacgacgataagcccaagaaaaaacggaaggtcgataaaaaatatagcatc120

gggctcgacattggcaccaactccgtgggctgggctgtgatcacagacgagtacaaagtc180

cccagcaagaagttcaaggtcctcgggaacaccgataggcactccatcaagaagaatctg240

attggcgccctgctctttgacagcggcgagacagccgaagctacccggctgaaaaggaca300

gctcggcggaggtatacaaggcggaagaatcggatttgctacctgcaggaaatcttttcc360

aacgaaatggctaaggtggacgacagcttcttccacaggctcgaggagtccttcctggtg420

gaagaggataagaagcatgagcggcaccccatctttggcaacatcgtcgatgaagtggcc480

tatcatgagaagtaccccaccatctaccacctccggaagaaactcgtcgacagcaccgac540

aaggccgatctgaggctgatttacctcgctctggcccacatgattaagtttcgggggcat600

tttctcattgaaggcgacctgaaccccgacaattccgatgtcgacaagctgttcatccag660

ctggtccagacctataaccagctcttcgaggagaaccccatcaacgcctccggggtcgac720

gccaaagctatcctgtccgccaggctgagcaagtccaggcggctcgaaaacctcattgcc780

cagctccccggcgagaagaagaatggcctgtttgggaacctgattgctctcagcctcggg840

ctcacccctaacttcaagtccaacttcgacctggctgaggacgccaaactccagctgtcc900

aaggatacctacgacgatgacctcgataacctgctggcccagatcggcgaccagtacgcc960

gatctgtttctcgctgccaaaaacctgagcgacgccattctgctgtccgacatcctccgg1020

gtcaacaccgagatcacaaaagcccctctgagcgcctccatgatcaagcggtatgatgag1080

catcaccaggacctgaccctgctcaaggccctggtcaggcagcagctgcctgaaaagtac1140

aaggagatcttctttgatcagtccaagaacggctacgctgggtatatcgacggcggggcc1200

tcccaggaggagttttataagttcatcaaacccattctggaaaagatggacggcacagaa1260

gagctgctggtgaagctcaacagggaggatctcctccggaagcaacggaccttcgacaat1320

ggctccattccccaccagattcacctgggggaactccacgccattctgaggaggcaggaa1380

gacttctatcccttcctgaaggacaacagggaaaaaatcgagaagattctgacattccgg1440

atcccctattatgtggggcccctggcccgggggaactcccggtttgcttggatgaccagg1500

aaatccgaagagacaatcacaccctggaatttcgaggaggtggtcgataaaggcgcttcc1560

gcccaatcctttatcgagcggatgaccaattttgataagaacctgcctaacgagaaggtc1620

ctccccaagcactccctcctctatgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaggtg1680

aagtatgtcaccgaagggatgcggaaacctgccttcctgagcggggagcagaaaaaagcc1740

attgtggacctcctgttcaagaccaacaggaaagtgaccgtcaagcaactgaaggaagat1800

tacttcaaaaaaattgaatgctttgattccgtggagatctccggggtggaagatcggttt1860

aacgctagcctgggcacataccacgacctcctcaagattatcaaggataaagactttctc1920

gacaacgaagaaaatgaagatatcctggaggacattgtcctgaccctcacactgtttgag1980

gaccgggagatgattgaagagcggctcaagacatacgcccatctcttcgacgacaaggtg2040

atgaagcagctgaagaggaggcggtacacaggctgggggcggctgagcaggaaactgatc2100

aacgggatccgggataagcaatccggcaagacaatcctggacttcctgaaaagcgacggc2160

ttcgccaacaggaatttcatgcagctcattcacgacgatagcctgaccttcaaggaagat2220

atccagaaggcccaggtctccggccagggggatagcctgcacgaacatatcgccaacctg2280

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