本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

哮喘是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其致殘、致死率一直呈上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但氣道炎癥和氣道重塑是目前哮喘公認(rèn)的兩個(gè)主要特征。氣道重塑會(huì)導(dǎo)致氣道不可逆性痙攣，這是部分哮喘患者難以用哮喘藥物控制癥狀的主要原因。

現(xiàn)有的大量研究證實(shí)，氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmoothmusclecell，asmc)才是導(dǎo)致氣道狹窄的主要效應(yīng)細(xì)胞，是哮喘發(fā)病機(jī)制中一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，無(wú)論有無(wú)氣道炎癥存在，其異常增殖、凋亡、遷移均能引起氣道壁增厚，并能通過(guò)釋放多種活性介質(zhì)加重氣道炎癥。因此，asmc在哮喘氣道重塑中處于中心地位，如能有效抑制asmc異常增殖、凋亡及炎性分泌等，將對(duì)減輕哮喘氣道重塑產(chǎn)生重要影響。

整合素(integrin)作為一種異源二聚體，由α、β兩個(gè)不同亞單位經(jīng)由非共價(jià)鍵連接而成。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)18種不同的α亞單位(150-210kd)和9種β亞單位(90-110kd)，它們按不同組合構(gòu)成20余種integrin。integrin內(nèi)不同亞單位的功能存在顯著差異：(1)α亞單位：氨基端具有結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子的結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)integrin與配體之間的結(jié)合作用，其胞質(zhì)區(qū)近膜處的保守序列(kxgffkr)與integrin活性調(diào)節(jié)密切相關(guān)；(2)β亞單位：β1亞單位主要介導(dǎo)細(xì)胞與ecm間的粘附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用；β2亞單位主要存在于多種白細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用；β3亞單位主要存在于血小板表面，介導(dǎo)血小板聚集、參與形成血栓；β4與α6亞單位結(jié)合，參與形成半橋粒。

rnai技術(shù)的重要成員——sirna雖能高效、特異地抑制靶基因表達(dá)，但其易降解、作用時(shí)間短，難以發(fā)揮穩(wěn)定的基因沉默作用；而小發(fā)夾rna(smallhairpinrna，shrna)具有一個(gè)重要的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞內(nèi)同期表達(dá)的sirna相比較，往往具有更高的靶基因抑制效率。小發(fā)夾rna基因載體分為非病毒載體和病毒載體兩大類(lèi)，其中，非病毒載體無(wú)免疫原性，但其轉(zhuǎn)染效率往往較低；而病毒載體雖有較高的轉(zhuǎn)染效率，但其生物安全性及免疫原性問(wèn)題往往難以解決。由于轉(zhuǎn)染的目的基因、表達(dá)系統(tǒng)及組裝的空間位置不同，轉(zhuǎn)染后的基因表達(dá)水平及陽(yáng)性克隆篩選率也會(huì)出現(xiàn)較大的差異，故而構(gòu)建一個(gè)合理、高效、穩(wěn)定的shrna表達(dá)載體是細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵。篩選出針對(duì)特定靶基因的shrna有望發(fā)揮靶向高效的基因抑制作用，具有理想的轉(zhuǎn)染效率且不引起非特異性反應(yīng)。

有報(bào)道認(rèn)為integrin的β1亞單位能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ecm之間等的相互作用，并對(duì)包括哮喘在內(nèi)的多種疾病的病理生理過(guò)程發(fā)揮重要影響，但現(xiàn)有技術(shù)并無(wú)能靶向高效抑制整合素β1的小發(fā)夾rna重組表達(dá)載體。因此，提供一種靶向高效抑制整合素β1的小發(fā)夾rna重組表達(dá)載體，有望對(duì)干預(yù)哮喘氣道重塑和哮喘的基因治療產(chǎn)生重要影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體，通過(guò)篩選rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1作為基礎(chǔ)載體(中等大小，攜帶真核細(xì)胞啟動(dòng)子和綠色熒光基因，在固定部位進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄，安全性好)，篩選整合素β1mrna編碼區(qū)第425位核苷酸作為干擾起始的靶位點(diǎn)構(gòu)建寡核苷酸鏈(seqidno：1和seqidno：2)，進(jìn)而構(gòu)建得到的小發(fā)夾rna重組載體可靶向抑制整合素β1的表達(dá)，具有特異性好、高效穩(wěn)定表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的目的將通過(guò)下面的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明提供一種靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體，包括rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點(diǎn)序列、啟動(dòng)子序列和靶向整合素β1基因的寡核苷酸鏈；所述多克隆位點(diǎn)包括bamhi酶切位點(diǎn)和ecori酶切位點(diǎn)，所述寡核苷酸鏈由bamhi酶切位點(diǎn)+靶序列正義鏈+莖環(huán)結(jié)構(gòu)+靶序列反義鏈+ecori酶切位點(diǎn)組成，所述寡核苷酸鏈正向插入所述多克隆位點(diǎn)中。

優(yōu)選地，所述寡核苷酸鏈的正義鏈為：gatccggcagggccaaattgtgggtttcaagagaacccacaattggccctgcacgcgtg，即seqidno：1；所述寡核苷酸鏈的反義鏈為：aattcacgcgtgcagggccaaattgtgggttctcttgaaacccacaatttggccctgccg，即seqidno：2。

優(yōu)選地，所述抗性基因序列包括氨芐青霉素抗性基因。

優(yōu)選地，所述rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體購(gòu)自美國(guó)clontech公司。

相應(yīng)地，本發(fā)明還提供靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

s1寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)：根據(jù)整合素β1mrna基因序列，經(jīng)同源性比對(duì)證實(shí)特異性后，應(yīng)用小發(fā)夾rna設(shè)計(jì)軟件選取整合素β1mrna靶序列，設(shè)計(jì)并合成靶向整合素β1基因的寡核苷酸鏈；

s2小發(fā)夾rna重組載體的構(gòu)建：將rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體進(jìn)行bamhi和ecori酶切，將合成的靶向整合素β1基因的寡核苷酸鏈正向插入酶切后的rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體多克隆位點(diǎn)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜后挑取陽(yáng)性克隆，在培養(yǎng)液中擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，得到靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體。

優(yōu)選地，所述寡核苷酸鏈的正義鏈為：gatccggcagggccaaattgtgggtttcaagagaacccacaattggccctgcacgcgtg，即seqidno：1；所述寡核苷酸鏈的反義鏈為：aattcacgcgtgcagggccaaattgtgggttctcttgaaacccacaatttggccctgccg，即seqidno：2。

優(yōu)選地，所述感受態(tài)細(xì)胞為dh-5а感受態(tài)細(xì)胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括：提供一種靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體，使用rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1作為基礎(chǔ)載體，使用seqidno：1和seqidno：2作為靶向抑制整合素β1基因表達(dá)的寡核苷酸鏈，具有特異性好、安全性好、高效穩(wěn)定表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，有望在干預(yù)哮喘氣道重塑和哮喘的基因治療中發(fā)揮重要作用。此外，本發(fā)明提供的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單、高效、重復(fù)性好。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明小發(fā)夾rna重組載體的構(gòu)建示意圖。

圖2本發(fā)明小發(fā)夾rna重組載體的部分測(cè)序圖。

圖3干預(yù)處理組的體外轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)圖。

圖4rt-pcr法檢測(cè)不同組別asmc整合素β1的mrna表達(dá)結(jié)果圖；其中a為空白對(duì)照組，b為空載體對(duì)照組，c為陰性對(duì)照組，d為干預(yù)處理組。

圖5western-blot法檢測(cè)不同組別asmc整合素β1的蛋白表達(dá)結(jié)果圖；其中a為空白對(duì)照組，b為空載體對(duì)照組，c為陰性對(duì)照組，d為干預(yù)處理組。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明中，所涉及的載體、試劑和試劑盒均為常規(guī)市售產(chǎn)品，或可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段獲得，如rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體購(gòu)自美國(guó)clontech公司。

實(shí)施例一寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)整合素β1mrna基因序列(nm_16412)，經(jīng)blast同源性比對(duì)證實(shí)特異性后，排除shrna非特異性抑制其他基因片段的可能，應(yīng)用小發(fā)夾rna設(shè)計(jì)軟件選取整合素β1mrna靶序列，篩選整合素β1mrna編碼區(qū)第425位核苷酸作為干擾起始的靶位點(diǎn)，由bamhi酶切位點(diǎn)+靶序列正義鏈+莖環(huán)結(jié)構(gòu)+靶序列反義鏈+ecori酶切位點(diǎn)組成寡核苷酸鏈(seqidno：1和seqidno：2)。

同時(shí)，建立陰性對(duì)照(錯(cuò)義rna鏈)、空載體對(duì)照(質(zhì)粒載體)及空白對(duì)照(pbs)。陰性對(duì)照的正義鏈：gatcccgactaccgttgtataggtgttcaagagacacctatacaacggtagtttttttg，即seqidno：3；陰性對(duì)照的反義鏈：caaaaaaactaccgttgtataggtgtctcttgaacacctatacaacggtagtcgggatc，即seqidno：4。寡核苷酸鏈及陰性對(duì)照等序列均由上海舜田生物技術(shù)公司合成。

實(shí)施例二小發(fā)夾rna重組載體的構(gòu)建

將rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體進(jìn)行bamhi和ecori酶切使其線性化，將實(shí)施例一合成的靶向整合素β1基因的寡核苷酸鏈制備退火雙鏈dna，正向插入酶切后的rnai-readypsiren-retroq-zsgreen1載體多克隆位點(diǎn)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh-5а感受態(tài)細(xì)胞，之后菌液均勻涂布在含氨芐青霉素(100μg/ml)瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)過(guò)夜后挑取陽(yáng)性克隆，在含氨芐青霉素(100μg/ml)的lb培養(yǎng)液中擴(kuò)增菌液，取部分菌液進(jìn)行測(cè)序，部分測(cè)序圖如圖2所示，測(cè)序結(jié)果顯示插入正確。從擴(kuò)增菌液中提取質(zhì)粒，得到靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體。

陰性對(duì)照(錯(cuò)義rna鏈)重組載體的構(gòu)建方法同上，所有重組載體均由上海舜田生物技術(shù)公司進(jìn)行酶切、pcr鑒定及測(cè)序分析，從而確定插入片段的正確性。

實(shí)施例三asmc體外轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的asmc消化、離心、去上清，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液重懸，以每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80％，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清的dmem培養(yǎng)液，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，隨后按lipofectine2000操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為以下5個(gè)組并分別處理：①空白對(duì)照組：僅加入pbs；②空載體對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體；③陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染錯(cuò)義rna鏈重組載體；④干預(yù)處理組：轉(zhuǎn)染本發(fā)明小發(fā)夾rna重組載體。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的具體過(guò)程如下：配制細(xì)胞轉(zhuǎn)染a液和b液：a液為15μl重組載體加入250μldmem培養(yǎng)液，b液為10μllipofectine加入250μldmem培養(yǎng)液；將a、b液混勻，室溫孵育20min，加入培養(yǎng)板各孔內(nèi)，混勻，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，吸去轉(zhuǎn)染液，更換為含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

分別收集轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞，將其接種于預(yù)先置有無(wú)菌蓋玻片的12孔板內(nèi)，每孔加入1ml4％多聚甲醛固定20min，吸去多聚甲醛后用pbs沖洗三遍，用5μg/mldapi染色2min，pbs沖洗三遍，甘油磷酸緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察。干預(yù)處理組的轉(zhuǎn)染效率約為75％，如圖3所示。

實(shí)施例四rt-pcr法檢測(cè)靶向抑制效果

收集待測(cè)asmc細(xì)胞，進(jìn)行rna抽提，使用quantcdna第一鏈合成試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna模板，使用2×powertaqpcrmastermix試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr結(jié)果，結(jié)果如圖4所示。

整合素β1的pcr上游引物為tgggggacaaaaagggggaagg，即seqidno：5，pcr下游引物為ttccgcctctggatgacta，即seqidno：6；β-actin的pcr上游引物為ctggcaccacaccttctacaatg，即seqidno：7，pcr下游引物為aatgtcacgcacgatttcccgc，即seqidno：8。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下所示：

從圖4可知，體外干預(yù)48h后，與陰性對(duì)照組、空載體對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，干預(yù)處理組的整合素β1mrna表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明本發(fā)明提供的小發(fā)夾rna重組載體能顯著抑制整合素β1的mrna表達(dá)。

實(shí)施例五western-blot法檢測(cè)靶向抑制效果

收集待測(cè)asmc細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行sds-page電泳，轉(zhuǎn)膜、免疫雜交后顯影曝光，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可知，體外干預(yù)48h后，與陰性對(duì)照組、空載體對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，干預(yù)處理組的整合素β1蛋白表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明本發(fā)明提供的小發(fā)夾rna重組載體能顯著抑制整合素β1的蛋白表達(dá)。

綜上所述，本發(fā)明提供的小發(fā)夾rna重組載體能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且轉(zhuǎn)染效率高，可顯著抑制整合素β1的mrna表達(dá)和蛋白表達(dá)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>深圳市人民醫(yī)院

<120>靶向抑制整合素β1表達(dá)的小發(fā)夾rna重組載體及其構(gòu)建方法

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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