本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年07月27日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?01180039653.5、發(fā)明名稱為“微生物核酸的定性和定量檢測(cè)”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用至少第一對(duì)照核酸，或不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸來定性和定量檢測(cè)微生物核酸的新的方法和用途。該方法基于核酸的擴(kuò)增，優(yōu)選地，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。進(jìn)一步提供了包含用于實(shí)施所述方法和用途的組分的試劑盒。

發(fā)明背景

在分子診斷學(xué)領(lǐng)域中，使用核酸擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)微生物核酸進(jìn)行檢測(cè)和量化發(fā)揮重要的作用。針對(duì)丙肝病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、和/或乙肝病毒(hbv)的存在的獻(xiàn)血常規(guī)篩選是核酸擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)大規(guī)模應(yīng)用的一個(gè)例子。后者包含多種不同技術(shù)，最常使用的技術(shù)是由karymullis在1984年引入的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。基于pcr的分析的自動(dòng)化系統(tǒng)經(jīng)常利用pcr過程期間對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)。這類方法的關(guān)鍵是使用攜帶報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記物的經(jīng)修飾的寡核苷酸。

生物學(xué)樣品中微生物核酸的定性檢測(cè)對(duì)于例如識(shí)別個(gè)體感染是至關(guān)重要的。由此，用于檢測(cè)微生物感染的測(cè)定法的一項(xiàng)重要的要求是避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，因?yàn)檫@類結(jié)果幾乎會(huì)不可避免地導(dǎo)致就相應(yīng)患者的治療而言的嚴(yán)重后果。因此，特別是在基于pcr的方法中，向檢測(cè)混合物添加定性內(nèi)部對(duì)照核酸。所述對(duì)照對(duì)于確定測(cè)試結(jié)果的有效性是特別重要的：至少在就微生物核酸而言陰性結(jié)果的情況中，定性內(nèi)部對(duì)照反應(yīng)在給定背景內(nèi)必須表現(xiàn)為反應(yīng)性的，即必須檢測(cè)出定性內(nèi)部對(duì)照，否則認(rèn)為該測(cè)試自身是不起作用的。然而，在定性設(shè)置中，在陽(yáng)性結(jié)果的情況中沒有必要必須檢出所述定性內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于定性測(cè)試，特別重要的是，保證反應(yīng)的靈敏度，并且因此對(duì)其嚴(yán)格控制。因此，定性內(nèi)部對(duì)照的濃度必須相對(duì)較低，從而即使在例如略微抑制的情況中，沒有檢測(cè)出定性內(nèi)部對(duì)照，并且因此該測(cè)試是無效的。

在另一方面并且在僅檢測(cè)樣品中微生物核酸的存在或缺乏外，測(cè)定所述核酸的量也經(jīng)常是重要的。舉例而言，病毒性疾病的階段和嚴(yán)重性可以基于病毒載量評(píng)估。此外，任何療法的監(jiān)測(cè)需要關(guān)于個(gè)體中存在的病原體量的信息以估計(jì)療法的成功與否。對(duì)于定量測(cè)定法，必需引入定量標(biāo)準(zhǔn)核酸，其充當(dāng)用于測(cè)定微生物核酸的絕對(duì)量的參照物?？梢酝ㄟ^參照外部校準(zhǔn)物或通過執(zhí)行內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品來實(shí)行定量。

在外部校準(zhǔn)物的情況中，使用已知量的相同或相當(dāng)?shù)暮怂嵩诜珠_的反應(yīng)中創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，通過比較用分析樣品獲得的結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)來確定微生物核酸的絕對(duì)量。然而，外部校準(zhǔn)具有的缺點(diǎn)在于，可能的提取規(guī)程、其變化的效力、和抑制擴(kuò)增和/或檢測(cè)反應(yīng)的媒介物的可能的且經(jīng)常不可預(yù)測(cè)的存在在對(duì)照中沒有得到反映。

此情況適用于任何樣品相關(guān)效應(yīng)。因此，可能的情況是，樣品由于不成功的提取規(guī)程或其它基于樣品的因素而判斷為呈陰性，而要檢測(cè)并量化的微生物核酸實(shí)際上存在于該樣品中。

出于這些和其它原因，向測(cè)試反應(yīng)自身添加的內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品具有優(yōu)點(diǎn)。內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品在定量測(cè)試中至少具有下列兩項(xiàng)功能：

i)其監(jiān)測(cè)反應(yīng)的有效性。

ii)其在滴度計(jì)算中充當(dāng)參照物，如此補(bǔ)償抑制效應(yīng)，并且控制制備和擴(kuò)增過程以容許更準(zhǔn)確的定量。因此，與定性測(cè)試中僅必須在靶物陰性反應(yīng)中呈陽(yáng)性的定性內(nèi)部對(duì)照核酸形成對(duì)比，定量測(cè)試中的定量標(biāo)準(zhǔn)核酸具有兩項(xiàng)功能：反應(yīng)控制和反應(yīng)校準(zhǔn)。因此，它在靶物陰性和靶物陽(yáng)性反應(yīng)中都必須呈陽(yáng)性且是有效的。

此外，它必須適合于為高核酸濃度的計(jì)算提供可靠的參照值。因此，內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的濃度需要是相對(duì)較高的。

定性內(nèi)部對(duì)照核酸和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸可以是競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性或部分競(jìng)爭(zhēng)性的。競(jìng)爭(zhēng)性定性內(nèi)部對(duì)照核酸和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸攜帶與靶物基本上相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，并且如此與靶物競(jìng)爭(zhēng)相同引物。競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)之一是例如必須在測(cè)定法中引入的不同引物組較少，如此降低其成本和總體復(fù)雜性。此外，監(jiān)測(cè)引物的功能性，亦監(jiān)測(cè)靶物引物特異性的抑制效應(yīng)。非競(jìng)爭(zhēng)性定性內(nèi)部對(duì)照核酸和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸與靶物具有不同引物結(jié)合位點(diǎn)，并且如此結(jié)合不同引物。這類設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)包含如下的事實(shí)，即反應(yīng)混合物中不同核酸的單一擴(kuò)增事件可以在沒有任何競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)的情況中彼此獨(dú)立發(fā)生，等等。在使用部分競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的pcr中，相應(yīng)的對(duì)照核酸和至少一種靶核酸競(jìng)爭(zhēng)相同引物，而至少一種其它靶核酸結(jié)合不同引物。

由于如上文所描述的定量和定性測(cè)定法的原理在彼此比較時(shí)展示不同的要求，又考慮到各個(gè)國(guó)家的規(guī)章要求，在本領(lǐng)域中使用的常見辦法是對(duì)同一靶核酸開發(fā)不同定量和定性測(cè)定法，參見例如yang等,jagrfoodchem2005,53,6222-6229。

本發(fā)明提供了一種展示數(shù)種優(yōu)點(diǎn)的備選解決辦法。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及用于同時(shí)定性和定量檢測(cè)微生物核酸的新的方法和用途。該方法基于核酸的擴(kuò)增，優(yōu)選地，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。簡(jiǎn)言之，使用一種或多種特異性引物對(duì)來擴(kuò)增并檢測(cè)微生物核酸和至少第一對(duì)照核酸的特定序列部分。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是：

用于同時(shí)檢測(cè)并量化生物學(xué)樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括：

a)分離并純化所述微生物核酸，

b)提供反應(yīng)混合物，其包含至少第一對(duì)照核酸、與所述微生物核酸的獨(dú)特序列部分以及所述對(duì)照核酸的獨(dú)特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對(duì)、和與由所述一種或多種引物對(duì)擴(kuò)增的每種序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述對(duì)照核酸與不同探針雜交，

c)向所述反應(yīng)混合物添加所述生物學(xué)樣品，

d)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且生成自所述對(duì)照核酸衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對(duì)擴(kuò)增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應(yīng)的接受熒光模塊標(biāo)記，且每種探針攜帶不同的熒光染料，

e)檢測(cè)并測(cè)量由所述擴(kuò)增產(chǎn)物生成并與所述對(duì)照核酸和所述微生物核酸的濃度成比例的熒光信號(hào)，其中所述對(duì)照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況中也指示所述反應(yīng)混合物中發(fā)生擴(kuò)增。

本發(fā)明展示了與現(xiàn)有技術(shù)相比的許多優(yōu)點(diǎn)。特別地，如此，本發(fā)明容許使用相同試劑進(jìn)行的針對(duì)任何給定微生物核酸的定性和定量測(cè)定法的常見設(shè)計(jì)。

在一些實(shí)施方案中，上文所描述的第一對(duì)照核酸可以充當(dāng)內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸和定性內(nèi)部對(duì)照核酸兩者。因此，它分別消除了對(duì)兩次分開的測(cè)試或測(cè)試試劑盒的需要。實(shí)施兩次分開的測(cè)試由于額外的抽血而給患者帶來負(fù)擔(dān)，并且在定量和定性測(cè)試都報(bào)銷的情況下，潛在地給健康護(hù)理系統(tǒng)強(qiáng)加額外的成本。此外，在與連續(xù)的定性和定量實(shí)驗(yàn)相比時(shí)，既定性又定量的測(cè)試的獲得結(jié)果時(shí)間縮短。

優(yōu)選地，依照不同標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估所述第一對(duì)照核酸以獲得定性和定量結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，針對(duì)兩種不同測(cè)試參數(shù)設(shè)置分析實(shí)時(shí)pcr期間獲得的一組相同的原始數(shù)據(jù)。與應(yīng)用于定量結(jié)果輸出所需要的內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品的參數(shù)設(shè)置相比，應(yīng)用于有效定性對(duì)照核酸的定性測(cè)試參數(shù)設(shè)置是更嚴(yán)格的。在定量反應(yīng)中用于內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的設(shè)置不能如此嚴(yán)格，因?yàn)榘形锏拇嬖诳赡苡绊憙?nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的相應(yīng)增長(zhǎng)曲線(參見圖1a)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是上文所描述的方法，其中依照不同標(biāo)準(zhǔn)分析第一對(duì)照核酸以充當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸或充當(dāng)定性內(nèi)部對(duì)照核酸。

在其它實(shí)施方案中，由于以下原因以不同濃度采用第一和第二對(duì)照核酸可以是有利的：通常，定量測(cè)試中的一種或多種內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸具有相當(dāng)高的濃度，從而使得它們?cè)诰哂懈邼舛劝泻怂岬臉悠分腥匀坏玫綌U(kuò)增并檢出。因此，有時(shí)沒有給予其作為對(duì)照用于檢測(cè)接近檢測(cè)限(lod)的低陽(yáng)性樣品的可用性，特別是若擴(kuò)增反應(yīng)受到部分抑制的話。在該情況中，高度濃縮的對(duì)照核酸的檢出不能充當(dāng)相應(yīng)測(cè)定法的足夠靈敏性的度量。

因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面如下：

用于同時(shí)檢測(cè)并量化生物學(xué)樣品中的微生物核酸的方法，所述方法包括：

a)分離并純化所述微生物核酸，

b)提供反應(yīng)混合物，其包含不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸、與所述微生物核酸的獨(dú)特序列部分以及所述對(duì)照核酸的獨(dú)特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對(duì)、和與由所述一種或多種引物對(duì)擴(kuò)增的每種序列特異性雜交的探針，其中所述微生物核酸和所述第一對(duì)照核酸以及所述第二對(duì)照核酸與不同探針雜交，

c)向所述反應(yīng)混合物添加所述生物學(xué)樣品

d)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增步驟包括若所述微生物核酸存在于所述樣品中，則生成一種或多種自所述微生物核酸衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且生成自所述第一對(duì)照核酸和所述第二對(duì)照核酸衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物，且其中循環(huán)步驟包括雜交步驟，所述雜交步驟包括使由所述引物對(duì)擴(kuò)增的序列與所述探針雜交，其中所述探針用供體熒光模塊和相應(yīng)的接受熒光模塊標(biāo)記，且每種探針攜帶不同熒光染料，

e)檢測(cè)并測(cè)量由所述第一對(duì)照核酸和所述微生物核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物生成并與其濃度成比例的熒光信號(hào)，和/或同時(shí)檢測(cè)由所述第二對(duì)照核酸的所述擴(kuò)增產(chǎn)物生成的熒光信號(hào)，其中所述第二對(duì)照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況中也指示反應(yīng)混合物中發(fā)生擴(kuò)增。

依照本發(fā)明在同一對(duì)照試劑內(nèi)采用不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸克服了上文所述的問題。具有較低或最低濃度的核酸對(duì)應(yīng)于用于定性測(cè)定法的定性內(nèi)部對(duì)照核酸，并且確保判斷陰性結(jié)果有效與否的能力，即在未檢測(cè)到內(nèi)部對(duì)照核酸的情況中，陰性結(jié)果不是有效的。

依照本發(fā)明，技術(shù)人員可以如下利用開發(fā)定量和定性設(shè)置之間的協(xié)同，即在單個(gè)測(cè)定法中實(shí)施這兩者，如此降低開發(fā)成本、需要較少的材料和勞動(dòng)力、降低制造成本，而且還縮短建立測(cè)定法需要的時(shí)間。此外，避免由于額外的抽血給患者帶來負(fù)擔(dān)的患者雙重測(cè)試，以及降低健康護(hù)理系統(tǒng)的成本(在定量和定性測(cè)試都報(bào)銷的情況下)。

定性內(nèi)部對(duì)照核酸和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸可以是競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性或部分競(jìng)爭(zhēng)性的。

“競(jìng)爭(zhēng)性”意味著，在包含引物的擴(kuò)增反應(yīng)中，相應(yīng)的對(duì)照核酸和一種或多種靶核酸至少具有基本上相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，并且如此競(jìng)爭(zhēng)相同引物。競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)之一是，例如必須在測(cè)定法中引入的不同引物組較少，如此降低其成本和總體復(fù)雜性。此外，監(jiān)測(cè)引物的功能性，亦監(jiān)測(cè)靶物引物特異性的抑制效應(yīng)。

“非競(jìng)爭(zhēng)性”意味著相應(yīng)的對(duì)照核酸和一種或多種靶核酸具有不同引物結(jié)合位點(diǎn)，并且如此結(jié)合不同引物。這類設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)包含如下的事實(shí)，即反應(yīng)混合物中不同核酸的單一擴(kuò)增事件可以在沒有任何競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)的情況中彼此獨(dú)立發(fā)生，等等。

“部分競(jìng)爭(zhēng)性”意味著相應(yīng)的對(duì)照核酸和至少一種靶核酸競(jìng)爭(zhēng)相同引物，而至少一種其它靶核酸結(jié)合不同引物。

依照本發(fā)明的一種或多種方法通過使用內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸作為第一對(duì)照核酸，使可能同時(shí)干擾定量標(biāo)準(zhǔn)核酸和微生物核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)的樣品特異性，而且還有樣品非特異性抑制效應(yīng)(不依賴于靶區(qū)的抑制)相等，從而得到更準(zhǔn)確的滴度。“內(nèi)部”意味著與微生物核酸在同一反應(yīng)混合物內(nèi)，而不是在分開的實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增、檢測(cè)并量化第一對(duì)照核酸。

本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面是上文所描述的方法，其中所述第一對(duì)照核酸是定量標(biāo)準(zhǔn)核酸，而所述第二對(duì)照核酸是定性內(nèi)部對(duì)照核酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中提取可靠的定性，而且任選地還有同樣可靠的定量信息。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容：

上文描述的方法，進(jìn)一步包括

在步驟e)中通過比較由所述微生物核酸和所述第一對(duì)照核酸生成的信號(hào)來測(cè)定所述生物學(xué)樣品中所述微生物核酸的量。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一對(duì)照核酸和第二對(duì)照核酸具有基本上相同的序列。優(yōu)選地，它們具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，但不同的探針結(jié)合位點(diǎn)。

這具有的優(yōu)點(diǎn)在于，用于定性和定量測(cè)量的對(duì)照核酸可以基于相同的選定結(jié)合序列，并且就測(cè)定法性能而言并考慮一種或多種分析物序列共享相同的有利特性。

在文獻(xiàn)中解釋了本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)。參見，例如sambrookj等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989,gait,m.j.編，1984；nucleicacidhybridization,hames,b.d.和higgins,s.j.編，1984；以及叢書，methodsinenzymology,academicpress,inc.

“同時(shí)”在本發(fā)明的意義中意味著在同一反應(yīng)或反應(yīng)混合物內(nèi)實(shí)施兩種行為，諸如例如檢測(cè)并量化核酸。

如本發(fā)明中使用的，“反應(yīng)混合物”至少包含促進(jìn)生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)的所有組分。它是沒有任何分開區(qū)室的單一體積，即存在于所述“反應(yīng)混合物”中的所有組分彼此直接接觸。

“生物學(xué)樣品”可以是天然起源的任何樣品。優(yōu)選地，“生物學(xué)樣品”自人衍生，并且是體液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“生物學(xué)樣品”是血液。

如本領(lǐng)域中已知的，“核苷”是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見的這類雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。

“核苷酸”是進(jìn)一步包含與核苷的糖部分共價(jià)連接的磷酸根基團(tuán)的“核苷”。對(duì)于那些包含呋喃戊糖基糖的“核苷”，磷酸根基團(tuán)可以與糖的2’、3’或5’羥基模塊連接?！昂塑账帷笔恰肮押塑账帷?本文中更一般稱為“寡聚化合物”)，或“多核苷酸”(更一般稱為“多聚化合物”)的“單體單元”。前述物質(zhì)的另一種一般表述是脫氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。

依照本發(fā)明，“寡聚化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述“單體單元”可以是單獨(dú)的“核苷酸”或單獨(dú)的“非天然化合物”(見下文)，更特別地是“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)或“非核苷酸化合物”，或其組合。“寡核苷酸”和“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)在本發(fā)明的背景中是“寡聚化合物”的亞組。

在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指自多個(gè)作為“單體單元”的“核苷酸”形成的“多核苷酸”，即“寡核苷酸”屬于具有“單體單元”的核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特定亞組。磷酸根基團(tuán)通常稱為形成“寡核苷酸”的核苷間主鏈。rna和dna的正常連接或主鏈?zhǔn)?’至5’磷酸二酯連接。

可以合成依照本發(fā)明的“寡核苷酸”和“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(見下文)，如主要在本領(lǐng)域中描述的且本領(lǐng)域中熟練人員已知的。用于制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括例如合適序列的克隆和限制以及直接化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成方法可以包括例如由narangs.a.等,methodsinenzymology68(1979)90-98描述的磷酸三酯方法、由browne.l.等,methodsinenzymology68(1979)109-151披露的磷酸二酯方法、在beaucage等,tetrahedronletters22(1981)1859中披露的亞磷酰胺方法、在garegg等,chem.scr.25(1985)280-282中披露的h-膦酸鹽方法以及在us4,458,066中披露的固體支持物方法。

對(duì)于上文描述的方法，核酸可以以雙鏈或者單鏈形式存在，其中在實(shí)施該方法前通過加熱(即熱變性)使雙鏈核酸變性，即變成單鏈。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，引物/探針可以是經(jīng)化學(xué)修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。

“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)與天然“核苷酸”相差一些修飾，但是仍然由堿基、呋喃戊糖基糖、磷酸根部分、堿基樣、呋喃戊糖基糖樣和磷酸根樣部分或其組合組成。例如，可以將“標(biāo)記物”附著于“核苷酸”的堿基部分，由此獲得“經(jīng)修飾的核苷酸”?！昂塑账帷敝械奶烊粔A基也可以用例如7-脫氮嘌呤替換，由此也獲得“經(jīng)修飾的核苷酸”。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的核苷酸”或“核苷酸類似物”在本申請(qǐng)中可以互換使用?！敖?jīng)修飾的核苷”(或“核苷類似物”)以如上文對(duì)“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)所概述的方式與天然核苷相差一些修飾。

“非核苷酸化合物”不同于天然“核苷酸”，但是在本發(fā)明的意義中仍然能夠(類似于“核苷酸”)是“寡聚化合物”的“單體單元”。因此，“非核苷酸化合物”必須能夠與“核苷酸”形成“寡聚化合物”。然而，即使“非核苷酸化合物”可以含有堿基樣、呋喃戊糖基糖樣或磷酸根樣部分，它們并不都同時(shí)存在于“非核苷酸化合物”中。

“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)，屬于另一特定亞組的“寡聚化合物”，擁有一種或多種“核苷酸”、一種或多種“非核苷酸化合物”或“經(jīng)修飾的核苷酸”作為“單體單元”。因此，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)指以與“寡核苷酸”基本上相似的方式發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)，并且貫穿本申請(qǐng)可以互換使用。從合成觀點(diǎn)來看，可以例如通過對(duì)磷酸根主鏈、核糖單元或核苷酸堿基的適當(dāng)修飾通過化學(xué)修飾“寡核苷酸”來生成“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)(uhlmann和peyman,chemicalreviews90(1990)543；vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134)。代表性修飾包括用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷間連接替換磷酸二酯核苷間連接；用脫氮或氮雜嘌呤和嘧啶替換天然的嘌呤和嘧啶堿基，在第5位或第6位具有取代基基團(tuán)的嘧啶堿基；在第2位、第6位或第8位或第7位(如7-脫氮嘌呤)具有改變的取代基基團(tuán)的嘌呤堿基；攜帶烴基/烷基(alkyl)、烯基、炔基或芳基模塊，例如低級(jí)烴基/烷基(alkyl)基團(tuán)諸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，或芳基基團(tuán)如苯基、芐基、萘基的堿基；在例如其2’位置具有取代基基團(tuán)的糖；或碳環(huán)或無環(huán)糖類似物。與本發(fā)明的精神一致的其它修飾是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這類“經(jīng)修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)最好描述為與天然“寡核苷酸”(或沿天然路線的合成“寡核苷酸”)在功能上可互換，但在結(jié)構(gòu)上不同。更為詳細(xì)地，例示性修飾披露于vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134或wo02/12263中。另外，可以做出如下的修飾，其中核苷單元經(jīng)由取代核苷間磷酸酯或糖磷酸酯連接的基團(tuán)連接。這類連接包括那些披露于vermas.和ecksteinf.,annu.rev.biochem.67(1998)99-134中的。當(dāng)利用磷酸酯以外的連接來連接核苷單元時(shí)，這類結(jié)構(gòu)也已經(jīng)描述為“寡核苷”。

“核酸”以及“靶核酸”或“微生物核酸”是“核苷酸”的多聚化合物，如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。“靶核酸”或“微生物核酸”在本文中用于指樣品中應(yīng)該分析，即應(yīng)該測(cè)定樣品中其存在、不存在和/或量的“核酸”。因此，在此情況中，核酸是靶物，并且因此也可以稱為“靶核酸”。依照本發(fā)明，因?yàn)榘泻怂崾俏⑸锲鹪吹?，所以靶核酸也稱為“微生物核酸”。例如，如果必須測(cè)定血液是否含有hcv，那么“靶核酸”或“微生物核酸”是hcv的核酸。

“微生物”意指任何病毒、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌或任何單細(xì)胞真核生物體。

“微生物的”意味著自“微生物”衍生或?qū)儆凇拔⑸铩薄?/p>

“檢測(cè)”意味著測(cè)定特定對(duì)象諸如靶物或信號(hào)的存在或缺乏。

“量化”意味著測(cè)定特定對(duì)象諸如靶物或信號(hào)的量。

“測(cè)量”意味著至少測(cè)定特定對(duì)象諸如靶物或信號(hào)的相對(duì)值。

在使用第一和第二對(duì)照核酸的本發(fā)明的某些實(shí)施方案的意義中，所述第一對(duì)照核酸充當(dāng)“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”?！皟?nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”是“核酸”，并且如此是“核苷酸”的多聚化合物，如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。在“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的情況中，核酸往往是并且同時(shí)用作反應(yīng)有效性的對(duì)照及參照以“量化”靶核酸，即測(cè)定“靶核酸”或“微生物核酸”的量。出于此目的，“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”與“靶核酸”或“微生物核酸”一起經(jīng)歷所有可能的樣品制備步驟。此外，它貫穿整個(gè)方法在同一反應(yīng)混合物內(nèi)加工?！皟?nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”必須在存在或沒有靶核酸的這兩種情況中都直接或間接地生成可檢測(cè)信號(hào)。出于此目的，在每項(xiàng)測(cè)試中必須仔細(xì)優(yōu)化“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的濃度，以不干擾靈敏度，而且以例如在非常高的靶物濃度也生成可檢測(cè)信號(hào)。優(yōu)選地，“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”，即第一對(duì)照核酸的濃度范圍會(huì)包含每個(gè)反應(yīng)100個(gè)拷貝至每個(gè)反應(yīng)100000個(gè)拷貝的范圍?！皟?nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的可能濃度可以是例如對(duì)于hiv：1000個(gè)拷貝/反應(yīng)，對(duì)于hcv：7500個(gè)拷貝/反應(yīng)，但是可以對(duì)特定測(cè)定法改變這些濃度，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。就相應(yīng)測(cè)定法的檢測(cè)限(lod)而言，優(yōu)選地，“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的濃度范圍是20-5000倍lod，更優(yōu)選地，20-1000倍lod，最優(yōu)選地，20-500倍lod。反應(yīng)混合物中“內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”的終濃度取決于實(shí)現(xiàn)的定量測(cè)量范圍?！皟?nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”可以是例如dna、rna或pna、裝甲的(armored)dna或裝甲的rna及其經(jīng)修飾形式。

此外，在本發(fā)明的意義中，所述第二對(duì)照核酸充當(dāng)“定性內(nèi)部對(duì)照核酸”?！岸ㄐ詢?nèi)部對(duì)照核酸”對(duì)于確定定性檢測(cè)測(cè)定法的測(cè)試結(jié)果的有效性是特別重要的：至少在陰性結(jié)果的情況中，必須檢測(cè)出定性內(nèi)部對(duì)照核酸，否則認(rèn)為該測(cè)試自身是不起作用的。然而，在定性設(shè)置中，在陽(yáng)性結(jié)果的情況中沒有必要必須檢出定性內(nèi)部對(duì)照核酸。對(duì)于定性測(cè)試，重要的是反應(yīng)的靈敏度得到保證，并且如此受到嚴(yán)格控制。因此，定性內(nèi)部對(duì)照核酸的濃度必須相對(duì)較低，從而即使在略微抑制的情況中，認(rèn)為測(cè)試是無效的。必須注意使其適應(yīng)相應(yīng)的測(cè)定法及其靈敏度。優(yōu)選地，“定性內(nèi)部核酸”，即第二對(duì)照核酸的濃度范圍包含每個(gè)反應(yīng)1個(gè)拷貝至每個(gè)反應(yīng)1000個(gè)拷貝的范圍。就相應(yīng)測(cè)定法的檢測(cè)限(lod)而言，優(yōu)選地，其濃度在測(cè)定法的lod和lod的25倍數(shù)值之間。更優(yōu)選地，其在2倍和20倍lod之間、或在2倍和15倍lod之間、或在2倍和10倍lod之間。甚至更優(yōu)選地，其在3倍和7倍lod之間。

“檢測(cè)限”或“l(fā)od”意指在預(yù)先規(guī)定的命中率的情況中樣品中可檢出的最低的核酸量或濃度。低“l(fā)od”對(duì)應(yīng)于高靈敏度，反之亦然?！發(fā)od”通常依靠單位“cp/ml”(特別是在核酸是病毒核酸時(shí))，或者以iu/ml表示。“cp/ml”意指“每毫升的拷貝”，其中“拷貝”是相應(yīng)核酸的拷貝。iu/ml代表“國(guó)際單位/ml”，指who標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)靶物，臨床分子診斷測(cè)定法中的lod值通常低于1000cp/ml。優(yōu)選地，在本發(fā)明背景中實(shí)施的測(cè)定法中的lod在1和500cp/ml之間。

一種廣泛用于計(jì)算lod的方法是“probit(概率單位)分析”，其是一種分析刺激物(劑量)和可數(shù)性(quantal)(全有或全無)響應(yīng)之間關(guān)系的方法。在典型的可數(shù)性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)物組給予不同劑量的藥物。記錄每個(gè)劑量水平的百分比瀕死。然后，可以使用probit分析來分析這些數(shù)據(jù)。probit模型假定百分比響應(yīng)與對(duì)數(shù)劑量的關(guān)系呈累積正態(tài)分布。也就是說，可以使用對(duì)數(shù)劑量作為變量來從累積法線(cumulativenormal)中讀出百分比瀕死。使用正態(tài)分布而不是其它概率分布，影響在可能的劑量的高和低末端處的預(yù)測(cè)響應(yīng)率，但是接近中間具有很少的影響。

“probit分析”可以以獨(dú)特的“命中率”應(yīng)用。如本領(lǐng)域中已知的，“命中率”通常以百分比[％]表示，并且指示在特定濃度的分析物時(shí)陽(yáng)性結(jié)果的百分比。因此，例如，lod可以以95％命中率測(cè)定，這意味著對(duì)95％有效結(jié)果呈陽(yáng)性的背景計(jì)算lod。

術(shù)語(yǔ)“引物”在本文中如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的那樣使用，指能夠通過模板依賴性dna聚合酶“引發(fā)”dna合成的“寡聚化合物”，主要指“寡核苷酸”，但也指“經(jīng)修飾的寡核苷酸”，即例如寡核苷酸的3’端提供游離的3’-oh基團(tuán)，可以通過建立3’至5’磷酸二酯連接的模板依賴性dna聚合酶對(duì)所述游離的3’-oh基團(tuán)附著其它“核苷酸”，其中使用三磷酸脫氧核苷且其中釋放焦磷酸。

術(shù)語(yǔ)“探針”在本發(fā)明上下文中也是寡核苷酸，但是具有特定功能：其與反應(yīng)混合物中的其它核酸雜交，優(yōu)選地，以實(shí)現(xiàn)其檢出。因此，優(yōu)選地，探針特異性結(jié)合某些核酸。優(yōu)選地，探針攜帶至少一種標(biāo)記物。例如，可以用不同染料標(biāo)記探針，從而可以彼此獨(dú)立地檢測(cè)并測(cè)量相應(yīng)的探針。

“標(biāo)記物”，經(jīng)常稱為“報(bào)告基團(tuán)”，一般是使核酸，特別是“寡聚化合物”或“經(jīng)修飾的寡核苷酸”，以及任何與其結(jié)合的核酸與樣品的剩余部分可區(qū)別的基團(tuán)(已經(jīng)附著“標(biāo)記物”的核酸也可以稱作經(jīng)標(biāo)記的核酸結(jié)合化合物、經(jīng)標(biāo)記的探針或僅探針)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其是例如“熒光染料”，如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料。依照本發(fā)明的優(yōu)選的“熒光染料”是fam、hex、cy5、ja270、cyan、cy5.5、lc-紅640、lc-紅705。

對(duì)于上文描述的方法，核酸可以以雙鏈或者單鏈形式存在，其中在實(shí)施該方法前通過加熱(即熱變性)使雙鏈核酸變性，即變成單鏈。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物和/或探針可以是經(jīng)過化學(xué)修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。

“可檢測(cè)信號(hào)”是由化合物諸如“微生物核酸”、“內(nèi)部對(duì)照核酸”或“定量標(biāo)準(zhǔn)核酸”“生成”的信號(hào)，其使所述化合物與樣品的剩余部分可區(qū)別。依照本發(fā)明，可以以定性方式量化或分析所述“可檢測(cè)信號(hào)”?！翱蓹z測(cè)信號(hào)”可以是例如放射性或光學(xué)諸如發(fā)光信號(hào)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的“可檢測(cè)信號(hào)”是由“熒光染料”發(fā)射的熒光信號(hào)。

pcr反應(yīng)的“抑制”或“阻抑”指與大多數(shù)樣品中觀察到的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)相比不太有效的pcr反應(yīng)?？梢栽趯?duì)照和/或靶物增長(zhǎng)曲線的熒光水平降低中、在延遲的ct值中、在增長(zhǎng)曲線的斜率變化中、在轉(zhuǎn)折點(diǎn)或反應(yīng)特征的其它特征的變化中看到“抑制”或“阻抑”效應(yīng)?！耙种啤被颉白枰帧毙?yīng)可以源自變化的樣品制備效力、樣品相關(guān)效應(yīng)、抑制擴(kuò)增和/或檢測(cè)反應(yīng)的媒介物的可能的且經(jīng)常不可預(yù)測(cè)的存在、和其它原因。因此，可能的情況是，樣品由于不成功的提取規(guī)程或其它基于樣品的因素而判斷為呈陰性，而要檢測(cè)并量化的微生物核酸實(shí)際上存在于該樣品中。

“生成”意味著直接或間接地產(chǎn)生。因此，在“可檢測(cè)信號(hào)”的上下文中，“生成”可以意指“直接產(chǎn)生”(例如在發(fā)射熒光信號(hào)的熒光染料的情況中)，或者“間接產(chǎn)生”(在“引發(fā)”或“誘導(dǎo)”的意義中)，諸如“微生物核酸”經(jīng)由“標(biāo)記物”(諸如“熒光染料”)，或者經(jīng)由攜帶“標(biāo)記物”(諸如“熒光染料”)的核酸探針“生成”“可檢測(cè)信號(hào)”。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，術(shù)語(yǔ)“特異性”或“特異性雜交”在引物和探針的上下文中暗指對(duì)獨(dú)特的核酸“特異性”的引物或探針在嚴(yán)格條件下結(jié)合所述核酸。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的方法中使用的引物和探針與微生物核酸和/或第一和第二對(duì)照核酸的序列部分至少80％相同。

“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(pcr)披露于美國(guó)專利no.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188等等，并且是用于本發(fā)明方法的最優(yōu)選的核酸擴(kuò)增技術(shù)。pcr通常采用兩種或更多種結(jié)合選擇的核酸模板(例如dna或rna)的寡核苷酸引物。在本發(fā)明中有用的引物包括能夠在微生物核酸或定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的核酸序列內(nèi)充當(dāng)核酸合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸。可以通過常規(guī)方法從限制性消化物純化引物，或者其可以合成生成。優(yōu)選地，引物是單鏈以在擴(kuò)增中實(shí)現(xiàn)最大效率，但是引物也可以是雙鏈。首先，將雙鏈引物變性，即處理以將鏈分開。使雙鏈核酸變性的一種方法通過加熱進(jìn)行?！盁岱€(wěn)定性聚合酶”是熱穩(wěn)定的酶聚合酶，即其是催化形成與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物，并且在受到升高的溫度處理達(dá)實(shí)現(xiàn)雙鏈模板核酸變性必需的時(shí)間時(shí)沒有不可逆地變性的酶。一般地，合成在每條引物的3’端起始，并且沿著模板鏈以5’到3’方向進(jìn)行。熱穩(wěn)定性聚合酶已經(jīng)例如自黃色棲熱菌(thermusflavus)、紅色棲熱菌(t.rubber)、嗜熱棲熱菌(t.thermophilus)、水生棲熱菌(t.aquaticus)、乳棲熱菌(t.lacteus)、紅色棲熱菌(t.rubens)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(bacillusstearothermophilus)和熾熱甲烷嗜熱菌(methanothermusfervidus)分離。不過，非熱穩(wěn)定性聚合酶也可以在pcr測(cè)定法中采用，只要該酶得到補(bǔ)充。如果模板核酸是雙鏈的，那么有必要在可以使用其作為pcr中的模板前將兩條鏈分開?？梢酝ㄟ^任何合適的變性方法，包括物理、化學(xué)或酶手段來實(shí)現(xiàn)鏈分開。一種分開核酸鏈的方法牽涉加熱核酸，直至其變性占優(yōu)勢(shì)(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％變性)。使模板核酸變性必需的加熱條件會(huì)取決于例如緩沖鹽濃度和變性的核酸的長(zhǎng)度和核苷酸組成，但是范圍通常為約90℃至約105℃達(dá)某個(gè)時(shí)間，該時(shí)間取決于反應(yīng)特征諸如溫度和核酸長(zhǎng)度。變性通常實(shí)施約3秒至4分鐘(例如5秒至2分30秒，或10秒至1.5分鐘)。如果通過加熱來使雙鏈模板核酸變性，那么允許反應(yīng)混合物冷卻至如下的溫度，該溫度促進(jìn)每條引物在微生物核酸和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)核酸上與其靶序列退火。用于退火的溫度通常是從約35℃至約75℃(例如約40℃至約70℃、約45℃至約66℃)。退火時(shí)間可以是從約5秒至約1分鐘(例如約10秒至約50秒；約15秒至約40秒)。然后，將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)至促進(jìn)或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以自退火引物發(fā)生延伸以生成與微生物核酸和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)核酸互補(bǔ)的產(chǎn)物的溫度。溫度應(yīng)該足以從與核酸模板退火的每條引物合成延伸產(chǎn)物，但是不應(yīng)高得以致于延伸產(chǎn)物從其互補(bǔ)模板變性(例如，一般地，用于延伸的溫度范圍為約35℃至約80℃(例如約40℃至約75℃；約45℃至約72℃)。延伸時(shí)間可以是約5秒至約5分鐘(例如約10秒至3分鐘；約15秒至約2分鐘；約20秒至約1分鐘)。新合成的鏈形成雙鏈分子，其可以在反應(yīng)的隨后步驟中使用?？梢愿鶕?jù)需要經(jīng)常重復(fù)鏈分開、退火、和延伸步驟以產(chǎn)生期望量的與微生物核酸和/或定量標(biāo)準(zhǔn)核酸對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)中的限制因素是反應(yīng)中存在的引物、熱穩(wěn)定性酶、和三磷酸核苷的量。優(yōu)選地，將循環(huán)步驟(即變性、退火、和延伸)至少重復(fù)一次。為了在檢測(cè)中使用，循環(huán)步驟數(shù)目會(huì)取決于例如樣品的性質(zhì)。如果樣品是核酸的復(fù)雜混合物，那么將需要更多的循環(huán)步驟來擴(kuò)增足以檢出的靶序列。一般地，將循環(huán)步驟至少重復(fù)約20次，但是可以重復(fù)多達(dá)40、60或甚至100次。

除pcr以外的核酸擴(kuò)增反應(yīng)包含連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr；wud.y.和wallacer.b.,genomics4(1989)560-69；及baranyf.,proc.natl.acad.sci.usa88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(baranyf.,pcrmethodsandapplic.1(1991)5-16)；缺口-lcr(wo90/01069)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(repairchainreaction)(ep0439182a2)、3sr(kwohd.y.等,proc.natl.acad.sci.usa86(1989)1173-1177；guatellij.c.等,proc.natl.acad.sci.usa87(1990)1874-1878；wo92/08808)、以及nasba(us5,130,238)。此外，有鏈置換擴(kuò)增(sda)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)和q-beta-擴(kuò)增(關(guān)于綜述，參見例如whelena.c.和persingd.h.,annu.rev.microbiol.50(1996)349-373；abramsonr.d.和myerst.w.,curropinbiotechnol4(1993)41-47)。

合適的核酸檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且記載于標(biāo)準(zhǔn)教科書如sambrookj.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989及ausubelf.等:currentprotocolsinmolecularbiology1987,j.wileyandsons,ny。在實(shí)施核酸檢測(cè)步驟前也可以有進(jìn)一步的純化步驟，如例如沉淀步驟。檢測(cè)方法可以包括但不限于結(jié)合或插入特定的染料如溴化乙啶，其插入雙鏈dna中，此后改變其熒光。也可以任選地在限制性消化后通過電泳方法分離純化的核酸，此后將其顯現(xiàn)。還有基于探針的測(cè)定法，其采用寡核苷酸與特定序列的雜交及隨后對(duì)雜合物的檢測(cè)。也有可能在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟后對(duì)核酸測(cè)序。優(yōu)選的模板依賴性核酸聚合酶是z05dna聚合酶及其突變。在本發(fā)明中有用的其它模板依賴性核酸聚合酶是taq聚合酶和tth聚合酶?？捎糜谝勒毡景l(fā)明方法的其它核酸聚合酶是熟練技術(shù)人員已知的。

在本發(fā)明的上下文中，微生物核酸和每種對(duì)照核酸結(jié)合攜帶不同標(biāo)記物的不同探針，從而使其在檢測(cè)期間彼此可區(qū)別。因此，優(yōu)選地，所述不同探針攜帶不同熒光染料，其發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光?？梢栽跓晒鈾z測(cè)器的不同通道中彼此獨(dú)立地有利地檢測(cè)這些不同的熒光信號(hào)，如用于實(shí)施實(shí)時(shí)pcr的大多數(shù)裝置中使用的。

還優(yōu)選地，在一個(gè)顯示器上在不同蔽片(mask)中，或在不同顯示器中顯現(xiàn)微生物核酸、第一對(duì)照核酸和第二對(duì)照核酸的結(jié)果。

在本發(fā)明的意義中，核酸的“純化”、“分離”或“提取”指如下的情況：在可以在上文提及的測(cè)定法之一中分析核酸前，必須從含有不同組分的復(fù)雜混合物的生物學(xué)樣品純化、分離或提取它們。經(jīng)常，對(duì)于第一步，使用允許核酸富集的方法。為了釋放細(xì)胞或病毒顆粒的內(nèi)容物，可以用酶或化學(xué)品處理它們以溶解、降解或變性細(xì)胞壁或病毒顆粒。此過程通常稱為裂解。所得的含有這類裂解材料的溶液稱為溶胞物。在裂解過程中經(jīng)常遇到的問題是降解感興趣組分的其它酶，例如降解核酸的脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在裂解規(guī)程的過程中與感興趣的組分接觸。這些降解酶也可以存在于細(xì)胞外部或者可以在裂解前已經(jīng)在不同細(xì)胞區(qū)室中空間分開。當(dāng)發(fā)生裂解時(shí)，感興趣的組分變得暴露于所述降解酶。在此過程期間釋放的其它組分可以例如是屬于脂多糖類家族的內(nèi)毒素，其對(duì)細(xì)胞有毒性，并且可以對(duì)意圖用于人或動(dòng)物療法的產(chǎn)品引起問題。

有多種手段來處理上文提及的問題。當(dāng)意圖釋放核酸時(shí)，常見的是使用離液劑諸如硫氰酸胍或陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解先前描述的酶或不想要的蛋白質(zhì)的蛋白酶也是一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。然而，這可能產(chǎn)生另一個(gè)問題，因?yàn)樗鑫镔|(zhì)或酶在隨后的步驟中可以干擾試劑或組分。

可以在上文提及的這類裂解或樣品制備過程中有利地使用的酶是如下的酶，其切割蛋白質(zhì)底物中的酰胺連接，并且分類為蛋白酶，或(互換地)肽酶(參見walsh,1979,enzymaticreactionmechanisms.w.h.freemanandcompany,sanfrancisco，第3章)?，F(xiàn)有技術(shù)中使用的蛋白酶包含堿性蛋白酶(wo98/04730)或酸性蛋白酶(us5,386,024)。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)在核酸分離中廣泛用于樣品制備的蛋白酶是來自白色念球菌(tritirachiumalbum)的蛋白酶k(參見例如sambrookj.等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989)，其在中性ph左右是有活性的，并且屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶家族。對(duì)上文提及的裂解或樣品制備方法中的使用特別有利的是酶esperase，即一種在高堿度和于高溫兩者都保留其活性的強(qiáng)力的蛋白酶(ep1201753)。

在裂解步驟后的樣品制備步驟中，進(jìn)一步富集感興趣的組分。如果感興趣的非蛋白質(zhì)性組分是例如核酸，那么通常在將它們?cè)诨谔结樀臏y(cè)定法中使用前從復(fù)雜的裂解混合物提取它們。

有數(shù)種用于核酸純化的方法：

-序列依賴性的或生物特異性的方法如例如：

·親和層析

·與固定化的捕捉寡核苷酸雜交

-不依賴于序列的或物理化學(xué)的方法如例如：

·用例如酚-氯仿進(jìn)行的液體-液體萃取

·用例如純乙醇進(jìn)行的沉淀

·用濾紙進(jìn)行的提取

·用微團(tuán)形成劑如鯨蠟基三甲基溴化銨進(jìn)行的提取

·結(jié)合固定化的嵌合染料，例如吖啶衍生物

·吸附至硅膠或硅藻土(diatomicearth)

·在離液序列高的(chaotropic)條件下吸附至磁性玻璃顆粒(mgp)或有機(jī)硅烷顆粒。

對(duì)于純化目的特別感興趣的是將核酸吸附至玻璃表面，盡管其它表面也是有可能的。近年來已經(jīng)提出了許多用于將核酸自其天然環(huán)境分離的規(guī)程，這通過使用其對(duì)玻璃表面的結(jié)合行為來進(jìn)行。如果未修飾的核酸是靶物，那么優(yōu)選將核酸直接結(jié)合至具有硅土表面的材料，因?yàn)楹怂岵槐剡M(jìn)行修飾，而且甚至可以結(jié)合天然核酸，等等。這些方法由多份文件詳細(xì)地描述。例如，在vogelsteinb.等,proc.natl.acad.usa76(1979)615-9中，提出了一種用于將來自瓊脂糖凝膠的核酸在存在碘化鈉的情況下結(jié)合到磨砂火石玻璃的規(guī)程。在存在過氯酸鈉的情況下在玻璃粉上自細(xì)菌純化質(zhì)粒dna記載于markom.a.等,anal.biochem.121(1982)382-387。在de-a3734442中，描述了在玻璃纖維濾器上分離單鏈m13噬菌體dna，其通過使用乙酸將噬菌體顆粒沉淀，并用高氯酸鹽裂解噬菌體顆粒來進(jìn)行。清洗結(jié)合到玻璃纖維濾器的核酸，然后用含有甲醇的tris/edta緩沖液洗脫。一種用于從λ噬菌體純化dna的類似規(guī)程記載于jakobir.等,anal.biochem.175(1988)196-201。該規(guī)程需要使核酸在離液鹽溶液中選擇性結(jié)合玻璃表面，并將核酸與污染物諸如瓊脂糖、蛋白質(zhì)或細(xì)胞殘留物分開。為了將玻璃顆粒與污染物分開，可以將該顆粒離心或者將流體抽過玻璃纖維濾器。然而，這是一個(gè)限制步驟，其阻止該規(guī)程用于加工大量樣品。在通過添加鹽和乙醇進(jìn)行沉淀后使用磁性顆粒來固定化核酸是更有利的，并且記載于例如aldertonr.p.等,s.,anal.biochem.201(1992)166-169和pctgb91/00212中。在此規(guī)程中，將核酸與磁性顆粒一起凝集。通過應(yīng)用磁場(chǎng)并實(shí)施清洗步驟將凝集物與初始溶劑分開。在一個(gè)清洗步驟后，將核酸溶解于tris緩沖液中。然而，此規(guī)程具有的缺點(diǎn)在于沉淀對(duì)于核酸不是選擇性的。更確切地，也將多種固體和溶解的物質(zhì)凝集。因此，不可以使用此規(guī)程來除去可能存在的、特定酶促反應(yīng)的大量的任何抑制劑。磁性多孔玻璃也是市場(chǎng)上可購(gòu)得的，其在多孔特殊玻璃基質(zhì)中含有磁性顆粒，并且用含有鏈霉親合素的層覆蓋。如果生物學(xué)材料例如蛋白質(zhì)或核酸在復(fù)雜的制備步驟中修飾，從而它們共價(jià)結(jié)合生物素，那么可以使用此產(chǎn)品來分離它們?？纱呕奶厥馕絼┳C明為對(duì)于自動(dòng)樣品制備是非常有效且合適的。出于此目的，使用亞鐵磁性和鐵磁性以及超順磁性(superparamagnetic)色素。最優(yōu)選的mgp和使用磁性玻璃顆粒的方法是那些記載于wo01/37291中的。依照r.boom等(jclinmicrobiol.28(1990),495-503)的方法特別可用于本發(fā)明上下文中的核酸分離。

在將包含靶核酸的核酸自其天然環(huán)境純化或分離后，可以檢測(cè)靶核酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括避免污染的步驟。例如，一種利用尿嘧啶-dna糖基化酶的酶促方法記載于美國(guó)專利no.5,035,996、5,683,896和5,945,313以降低或消除一次熱循環(huán)儀運(yùn)行和下一次之間的污染。另外，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室防護(hù)實(shí)踐和規(guī)程在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)是期望的。防護(hù)實(shí)踐和規(guī)程包括但不限于為方法的不同步驟分開工作區(qū)、防護(hù)罩、屏障濾器移液管尖端和專用排氣式移液管。全體人員的一致防護(hù)實(shí)踐和規(guī)程對(duì)于診斷實(shí)驗(yàn)室操作臨床樣品中的準(zhǔn)確度是必需的。

優(yōu)選地，上文所列的方法基于供體熒光模塊和接受熒光模塊之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。代表性的供體熒光模塊是熒光素，而代表性的相應(yīng)接受熒光模塊包括lc-紅640、lc-紅705、cy5、和cy5.5。通常，檢測(cè)步驟包括以供體熒光模塊吸收的波長(zhǎng)激發(fā)樣品，并且顯現(xiàn)和/或測(cè)量由相應(yīng)的接受熒光模塊發(fā)射的波長(zhǎng)。依照本發(fā)明，檢測(cè)繼之以定量fret。優(yōu)選地，在每個(gè)循環(huán)步驟后實(shí)施檢測(cè)步驟。最優(yōu)選地，實(shí)時(shí)實(shí)施檢測(cè)步驟。通過使用商品化實(shí)時(shí)pcr儀(例如lightcycler^tm或)，pcr擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以以顯著縮短的循環(huán)時(shí)間在單個(gè)封閉的反應(yīng)區(qū)室，諸如例如小杯中組合。由于檢測(cè)與擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生，實(shí)時(shí)pcr方法消除對(duì)操作擴(kuò)增產(chǎn)物的需要，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)pcr大大地縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間，并且是臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)pcr技術(shù)的一種有吸引力的備選。

下列專利申請(qǐng)描述了如在lightcycler^tm技術(shù)中使用的實(shí)時(shí)pcr：wo97/46707、wo97/46714和wo97/46712。lightcycler^tm儀是一種與利用高質(zhì)量光學(xué)鏡的微體積熒光計(jì)組合的快速熱循環(huán)儀。此快速熱循環(huán)技術(shù)使用薄玻璃小杯作為反應(yīng)容器。反應(yīng)室的加熱和冷卻通過交替加熱的和周圍的空氣來控制。由于空氣的質(zhì)量低以及小杯的表面積與體積的比率高，可以在熱室內(nèi)實(shí)現(xiàn)非常快速的溫度交換速率。

技術(shù)利用用兩種熒光模塊標(biāo)記的單鏈雜交探針。當(dāng)?shù)谝粺晒饽K用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，吸收的能量依照fret的原理轉(zhuǎn)移到第二熒光模塊。一般地，第二熒光模塊是猝滅劑分子。以此形式使用的典型熒光染料是例如fam、hex、cy5、ja270、cyan和cy5.5，等等。在pcr反應(yīng)的退火步驟期間，經(jīng)標(biāo)記的雜交探針結(jié)合靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到taq或如熟練技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。結(jié)果，激發(fā)的熒光模塊和猝滅劑模塊變成彼此空間分開。因此，在沒有猝滅劑的情況中激發(fā)第一熒光模塊后，可以檢出來自第一熒光模塊的熒光發(fā)射。

在上文描述的兩種檢測(cè)形式中，發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度可以與初始靶核酸分子數(shù)目相關(guān)聯(lián)。

作為fret的一種備選，可以使用雙鏈dna結(jié)合染料諸如熒光dna結(jié)合染料(例如sybrgreen或(molecularprobes))來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在與雙鏈核酸相互作用后，這類熒光dna結(jié)合染料在用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射出熒光信號(hào)。也可以使用雙鏈dna結(jié)合染料諸如核酸嵌入染料。當(dāng)使用雙鏈dna結(jié)合染料時(shí)，通常實(shí)施解鏈曲線分析以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。

使用本發(fā)明的實(shí)時(shí)pcr方法，也可以使用與fret結(jié)合的分子信標(biāo)來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。分子信標(biāo)技術(shù)使用用第一熒光模塊和第二熒光模塊標(biāo)記的雜交探針。第二熒光模塊一般是猝滅劑，并且熒光標(biāo)記物通常位于探針的每個(gè)末端。分子信標(biāo)技術(shù)使用具有允許二級(jí)結(jié)構(gòu)形成(例如發(fā)夾)的序列的探針寡核苷酸。由于探針內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，兩種熒光模塊在探針在溶液中時(shí)為空間接近。在與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后，探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)受到破壞，并且熒光模塊變得彼此分開，使得在用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)后，可以檢出第一熒光模塊的發(fā)射。

因此，使用fret的上文描述的方法在依照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，其中所述探針包含允許所述第一和第二熒光模塊之間的空間接近的核酸序列。

僅可以在熒光模塊直接局部接近時(shí)，且在供體熒光模塊的發(fā)射光譜與接受熒光模塊的吸收光譜重疊時(shí)發(fā)生有效的fret。

因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述供體和接受熒光模塊在所述探針上在彼此的不超過5個(gè)核苷酸內(nèi)。

在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接受熒光模塊是猝滅劑。

如上文描述的，在taqman形式中，在pcr反應(yīng)的退火步驟期間，經(jīng)標(biāo)記的雜交探針結(jié)合靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)，并且在隨后的延伸階段期間，受到taq或如熟練技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶，諸如優(yōu)選的z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。

因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在依照本發(fā)明的方法中，擴(kuò)增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。

依照本發(fā)明的方法可以有利地應(yīng)用于病毒核酸。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物核酸是病毒核酸。

在病毒核酸中，有利地，可以對(duì)hcv應(yīng)用依照本發(fā)明的方法。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物核酸是hcv的核酸。然而，必須理解的是也可以對(duì)任何其它微生物核酸應(yīng)用本發(fā)明。

在下文中描述了如何基于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品在taqman形式中實(shí)施定量結(jié)果計(jì)算的例子。從來自整個(gè)pcr運(yùn)行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)計(jì)算滴度。含有靶核酸諸如微生物核酸和充當(dāng)內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的第一對(duì)照核酸的一組樣品在使用如規(guī)定的溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷pcr。在pcr概況期間的選定溫度和時(shí)間，通過過濾光照明樣品，并且對(duì)每份樣品針對(duì)靶核酸和內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成pcr運(yùn)行后，處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。在數(shù)次似真性檢查后，對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸和靶核酸計(jì)算肘值(elbowvalue)(ct)。肘值定義為靶核酸或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的熒光與預(yù)定閾值(熒光濃度)相交的點(diǎn)。滴度測(cè)定基于如下的假定，即靶核酸和內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸以相同的效率擴(kuò)增，且在計(jì)算的肘值，擴(kuò)增并檢測(cè)相等量的靶核酸和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的擴(kuò)增子拷貝。因此，(ctqs–ct靶物)與對(duì)數(shù)(靶物濃度/qs濃度)呈線性，其中“qs”代表內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸。然后，可以例如通過使用如下述等式中的多項(xiàng)式校正式計(jì)算滴度t：

t’＝10(a(ctqs–ct靶物)2+b(ctqs–ct靶物)+c)

已知多項(xiàng)式常數(shù)和內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的濃度，因此該等式中唯一的變量是差(ctqs–ct靶物)。

在下文中描述了如何在taqman中實(shí)施定性結(jié)果計(jì)算的例子：對(duì)來自整個(gè)pcr運(yùn)行的、經(jīng)儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行分析?？赡芎邪泻怂嶂T如微生物核酸和充當(dāng)定性內(nèi)部對(duì)照核酸的對(duì)照核酸的一組樣品在使用如規(guī)定的溫度概況的熱循環(huán)儀上經(jīng)歷pcr。在pcr概況期間的選定溫度和時(shí)間，通過過濾光照明樣品，并且對(duì)每份樣品針對(duì)靶核酸和定性內(nèi)部對(duì)照核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成pcr運(yùn)行后，處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生定性內(nèi)部對(duì)照核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。對(duì)定性內(nèi)部對(duì)照核酸和靶核酸(若存在的話)計(jì)算肘值(ct)。肘值定義為靶核酸或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的熒光與預(yù)定閾值(熒光濃度)相交的點(diǎn)。如果獲得在規(guī)定范圍內(nèi)的ct并且如果熒光超過預(yù)定的最小熒光強(qiáng)度，那么定性內(nèi)部對(duì)照是有效的。如果未獲得靶物ct，那么定性內(nèi)部對(duì)照就必須是有效的。如果獲得指示樣品中靶核酸存在的靶物ct，那么定性內(nèi)部對(duì)照可以是有效或無效的。

在本發(fā)明的意義中優(yōu)選的是上文描述的方法之任一，其中在一種對(duì)照試劑內(nèi)提供所述第一和所述第二對(duì)照核酸。

有利地，可以對(duì)靶向微生物核酸的任何相應(yīng)測(cè)定法使用如下的概念，即具有不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸的對(duì)照試劑用于可靠的定性檢測(cè)并且同時(shí)用于可靠的量化。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸用于通過實(shí)時(shí)pcr來同時(shí)檢測(cè)并量化微生物核酸的用途。進(jìn)一步優(yōu)選的是上文描述的用途，其中通過相同引物對(duì)或不同引物對(duì)擴(kuò)增所述第一和第二對(duì)照核酸，但是它們與不同探針雜交。

特別有利的是此概念在依照本發(fā)明的方法中的用途。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸依照上文描述的一種或多種方法用于同時(shí)檢測(cè)并量化微生物核酸的用途。

本發(fā)明還提供了用于通過實(shí)時(shí)pcr來同時(shí)檢測(cè)并量化生物學(xué)樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸、與所述微生物核酸的獨(dú)特序列部分以及所述第一和第二對(duì)照核酸的獨(dú)特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對(duì)、和與由所述一種或多種引物對(duì)擴(kuò)增的每種序列特異性雜交的探針，其中在一種對(duì)照試劑內(nèi)提供所述第一和第二對(duì)照核酸。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于依照上文描述的任何方法同時(shí)檢測(cè)并量化生物學(xué)樣品中的微生物核酸的試劑盒，所述試劑盒包含不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸、與所述微生物核酸的獨(dú)特序列部分以及所述第一和第二對(duì)照核酸的獨(dú)特序列部分特異性雜交的一種或多種引物對(duì)、和與由所述一種或多種引物對(duì)擴(kuò)增的每種序列特異性雜交的探針。

本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選方面是如上文所描述的試劑盒，其中通過相同引物對(duì)擴(kuò)增所述第一和第二對(duì)照核酸，但是它們與不同探針雜交，如此提供競(jìng)爭(zhēng)性設(shè)置。然而，必須理解的是本發(fā)明也包括非競(jìng)爭(zhēng)性或部分競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法和用于實(shí)施相應(yīng)方法的試劑盒。

如本領(lǐng)域中已知的，這類試劑盒可以進(jìn)一步包含可以在樣品制備規(guī)程期間使用的塑料器皿(如例如96孔或384孔形式的微量滴定板或者由例如eppendorf,hamburg,germany制造的普通反應(yīng)管)和用于實(shí)施依照本發(fā)明方法的任何其它試劑。因此，所述試劑盒可以另外含有對(duì)核酸具有親和力的材料，優(yōu)選地，對(duì)核酸具有親和力的材料包含具有硅土表面的材料。優(yōu)選地，具有硅土表面的材料是玻璃。最優(yōu)選地，對(duì)核酸具有親和力的材料是包含磁性玻璃顆粒的組合物。試劑盒可以進(jìn)一步或另外包含蛋白酶試劑和含有例如離液劑、去污劑或醇或其混合物的裂解緩沖液，從而允許裂解細(xì)胞?？梢栽诠芑蛸A存容器中分開地提供依照本發(fā)明的試劑盒的這些組分。根據(jù)組分的性質(zhì)，這些甚至可以在單個(gè)管或貯存容器中提供。試劑盒可以進(jìn)一步或另外包含適合于在核酸與磁性玻璃顆粒結(jié)合時(shí)對(duì)其進(jìn)行清洗步驟的清洗溶液。此清洗溶液可以在如上文所描述的具有酸性ph且沒有乙醇和/或離液劑的一種或多種緩沖溶液中含有乙醇和/或離液劑。清洗溶液或其它溶液經(jīng)常以儲(chǔ)備溶液提供，所述儲(chǔ)備溶液在使用前必須稀釋。所述試劑盒可以進(jìn)一步或另外包含洗脫液或洗脫緩沖液，即用于洗脫與磁性玻璃顆粒結(jié)合的核酸的溶液或緩沖液(例如10mmtris,1mmedta,ph8.0)或純水。此外，可以存在別的試劑或緩沖溶液，其可以用于核酸的純化過程。

優(yōu)選地，所述試劑盒含有具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。還優(yōu)選的是，所述試劑盒含有具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒含有具有5’至3’外切核酸酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶聚合酶。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的方法插入分析系統(tǒng)內(nèi)實(shí)施的方法的順序中，由此優(yōu)選地，形成可自動(dòng)化的過程。

因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面是以下內(nèi)容：

用于通過實(shí)時(shí)pcr來同時(shí)檢測(cè)并量化生物學(xué)樣品中的微生物核酸的分析系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含

-包含裂解緩沖液和容器的樣品制備模塊，用于分離和純化所述微生物核酸

-包含反應(yīng)接受器的擴(kuò)增和檢測(cè)模塊，其中實(shí)施上文描述的方法

-如上文描述的試劑盒。

有利地，樣品制備模塊可以包含用于上文描述的樣品制備規(guī)程的組分，即例如磁性玻璃顆粒和用于將它們與溶液分開的磁體、蛋白酶試劑、離液鹽溶液和一個(gè)或多個(gè)含有粗制樣品和樣品制備需要的試劑的容器。

擴(kuò)增和檢測(cè)模塊中的反應(yīng)接受器可以例如是微量滴定板、離心瓶、裂解管、或適合于含有依照本發(fā)明的反應(yīng)混合物的任何其它類型的容器。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分析系統(tǒng)含有貯存模塊，其含有用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑。

所述貯存模塊可以進(jìn)一步含有對(duì)本發(fā)明的方法有用的其它組分，例如一次性用品諸如移液管尖端或甚至要在擴(kuò)增和檢測(cè)模塊內(nèi)用作反應(yīng)接受器的容器。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分析系統(tǒng)包含預(yù)分析系統(tǒng)模塊，用于將生物學(xué)樣品從初級(jí)管轉(zhuǎn)移到分析系統(tǒng)上可用的容器。

在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分析系統(tǒng)含有轉(zhuǎn)移模塊，用于將生物學(xué)樣品從樣品制備模塊轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增和檢測(cè)模塊。

盡管手動(dòng)實(shí)施所述轉(zhuǎn)移是有可能的，但是優(yōu)選的是使用自動(dòng)化系統(tǒng)，其中例如通過機(jī)器人裝置諸如例如如電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的移動(dòng)架或機(jī)器人擺動(dòng)臂實(shí)施轉(zhuǎn)移。

可自動(dòng)化方法意味著方法的步驟適合于用儀器或機(jī)器實(shí)施，所述儀器或機(jī)器能夠在很少或沒有人為外部控制或影響的情況中運(yùn)行。自動(dòng)化方法意味著用儀器或機(jī)器實(shí)施可自動(dòng)化方法的步驟，所述儀器或機(jī)器能夠在很少或沒有人為外部控制或影響的情況中運(yùn)行。僅可能必須手動(dòng)完成該方法的制備步驟，例如必須將貯存容器充滿并放好位置，必須人為實(shí)施樣品的選擇以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟，例如控制計(jì)算機(jī)的操作。儀器或機(jī)器可以例如自動(dòng)添加液體，混合樣品或于特定溫度實(shí)施溫育步驟。典型地，這類機(jī)器或儀器是由計(jì)算機(jī)控制的機(jī)器人，該計(jì)算機(jī)實(shí)施規(guī)定單一步驟和命令的程序。

因此，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的分析系統(tǒng)進(jìn)一步包含用于控制系統(tǒng)組件的控制單元。

這類控制單元可以包含用于確保所述分析系統(tǒng)的不同組件正確且以正確的時(shí)機(jī)工作并相互作用(例如以協(xié)調(diào)方式將組件諸如樣品移動(dòng)到反應(yīng)模塊)的軟件?？刂茊卧€可以包含運(yùn)行實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)(rtos)(其是意圖用于實(shí)時(shí)應(yīng)用的多任務(wù)操作系統(tǒng))的處理器。換言之，該系統(tǒng)處理器能夠管理實(shí)時(shí)約束，即從事件到系統(tǒng)應(yīng)答的操作最后期限(與系統(tǒng)加載無關(guān))。其以實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)內(nèi)的不同單元依照給定的指令正確運(yùn)行并響應(yīng)。

依照本發(fā)明的用途、試劑盒和分析系統(tǒng)的所有其它優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施方案的具體描述是那些對(duì)依照本發(fā)明的方法提述的。

附圖描述

圖1a：

在圖中顯示了商業(yè)cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1測(cè)試的定量實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照增長(zhǎng)曲線。pcr反應(yīng)含有跨越5個(gè)log10范圍的hiv-1靶物濃度和靶物陰性樣品。如果反應(yīng)中存在較高的靶物濃度(參見“靶物高度陽(yáng)性”)，那么內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)核酸(qs)達(dá)到的熒光水平顯著低于在不存在hiv-1靶物的pcr反應(yīng)(參見“靶物陰性”)的情況中的。因?yàn)閝s在所有靶物濃度都必須是有效的，從而能夠計(jì)算定量結(jié)果輸出的滴度，所以qs的最小熒光強(qiáng)度水平設(shè)置(“rfimin”)較低。表1中給出了三種商業(yè)測(cè)試cobasampliprep/cobastaqmanhbv、hcv和hiv-1中定量結(jié)果輸出的rfimin設(shè)置。

圖1b：

在圖中顯示了商業(yè)cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1測(cè)試的實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)的內(nèi)部對(duì)照增長(zhǎng)曲線。所有pcr反應(yīng)都含有hiv-1靶物陰性樣品。內(nèi)部對(duì)照增長(zhǎng)曲線的熒光水平約束在較窄的范圍內(nèi)，并且定性內(nèi)部對(duì)照核酸(ic)的最小熒光強(qiáng)度水平設(shè)置(“rfimin”)較高。在靶物陽(yáng)性反應(yīng)中，ic可以落到rfimin之下，并且可以變?yōu)闊o效；在靶物存在的情況中，pcr反應(yīng)的結(jié)果仍然有效。表1中給出了如對(duì)測(cè)試cobasampliprep/cobastaqmanhbv、hcv和hiv-1的定性結(jié)果輸出優(yōu)化的rfimin設(shè)置。

圖2：

裝甲的rna顆粒的生成：用于生成裝甲的rna顆粒的表達(dá)載體和裝甲的rna顆粒的電子顯微術(shù)。在大腸桿菌(e.coli)中構(gòu)成裝甲的rna顆粒。誘導(dǎo)lac操縱子后，mrna受到轉(zhuǎn)錄，其包含ms-2外殼蛋白的ms-2噬菌體基因、控制序列、包裝信號(hào)和在trrnb終止子上游的質(zhì)粒序列。在外殼蛋白翻譯后，自發(fā)發(fā)生顆粒組成，其包裝一個(gè)拷貝的mrna。

圖3：

對(duì)含有hcv靶物、第一對(duì)照核酸和第二對(duì)照核酸的實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)獲得的標(biāo)準(zhǔn)化增長(zhǎng)曲線。

圖4a：

hcv-rna和qs的同時(shí)擴(kuò)增。qs和hcv-rna兩者的信號(hào)強(qiáng)度都低于在產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)的反應(yīng)中的(參見圖4b)。

圖4b：

hcv-rna和qs的同時(shí)擴(kuò)增。這兩種反應(yīng)都產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度。為了與受抑制的熒光曲線比較(參見圖4a)，還要注意兩幅圖中的不同幅度。

實(shí)施例

實(shí)施例1：依照用于獲得定性和定量結(jié)果輸出的不同標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)估第一對(duì)照核酸。

cobasampliprep/cobastaqmanhbv、hcv和hiv-1測(cè)試是商品化的實(shí)時(shí)pcr測(cè)試，其已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化以準(zhǔn)確量化病毒靶物hbv、hcv和hiv-1。在全自動(dòng)化cobasampliprep/cobastaqman系統(tǒng)(其包含用于將pcr反應(yīng)混合物從樣品制備單元自動(dòng)化轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增/檢測(cè)單元的對(duì)接(docking)站)上或者在手動(dòng)轉(zhuǎn)移的cobasampliprep/cobastaqman系統(tǒng)上或者在cobasampliprep/cobastaqman48系統(tǒng)上使用該測(cè)定法。

使用cobasampliprep/cobastaqmanhcv測(cè)試作為一個(gè)例子來調(diào)查用一組相同試劑提供同時(shí)的定量和定性測(cè)試結(jié)果的辦法。該測(cè)試具有15iu/ml的檢測(cè)限，并且顯示現(xiàn)有技術(shù)的靈敏度，與市場(chǎng)上的定量而且也是定性的hcv測(cè)試相當(dāng)或比它們好。由于此較高的靈敏度，已經(jīng)有也使用該測(cè)試作為定性hcv測(cè)試的嘗試。定量測(cè)試的主要焦點(diǎn)是提供準(zhǔn)確的hcv滴度，而定性測(cè)試的主要焦點(diǎn)是確保測(cè)定法的高靈敏度。由于最初開發(fā)cobasampliprep/cobastaqmanhcv測(cè)試用于定量監(jiān)測(cè)治療成功與否，對(duì)該測(cè)定法是否也可以在沒有任何變化的情況中使用以提供可靠的定性結(jié)果進(jìn)行分析。對(duì)數(shù)據(jù)的審查揭示，在不太有效的pcr的罕見事件中，具有其目前數(shù)據(jù)分析設(shè)置的定量測(cè)試沒有保證15iu/ml的靈敏度。在下文給出了受到抑制，但是顯示有效的qs結(jié)果且不能檢出靶物(2183iu/ml)的pcr反應(yīng)的一個(gè)例子：

在圖4a中顯示了受抑制的pcr反應(yīng)，其產(chǎn)生由于有效的qs所致的有效結(jié)果和“未檢出靶物”的結(jié)果。qs是有效的，因?yàn)槠涑^對(duì)應(yīng)于0.8個(gè)相對(duì)熒光單位的熒光閾值設(shè)置。

相同樣品的重復(fù)測(cè)試顯示了標(biāo)準(zhǔn)的pcr反應(yīng)和2183iu/ml的hcv滴度結(jié)果(圖4b)。

因此，沒有任何變化的定量cobasampliprep/cobastaqmanhcv測(cè)試不能用作定性測(cè)試。

使用上文提及的測(cè)試，優(yōu)化ic/qs對(duì)照核酸的數(shù)據(jù)分析參數(shù)設(shè)置從而實(shí)現(xiàn)可靠的定性結(jié)果輸出。為了證明普遍適用性，另外，在cobasampliprep/cobastaqman系統(tǒng)上對(duì)所有三種商業(yè)hbv、hcv和hiv-1測(cè)定法采取優(yōu)化。通過顯著提高參數(shù)設(shè)置中的最小相對(duì)熒光強(qiáng)度(rfimin)閾值，確保所有三種定量測(cè)試的靈敏度，從而可以使用它們來提供可靠的定性結(jié)果輸出。在下文表1中顯示了相關(guān)參數(shù)設(shè)置：

表1：商品化定量應(yīng)用和定性應(yīng)用中三種cobasampliprep/cobastaqman測(cè)試的內(nèi)部對(duì)照的rfimin設(shè)置。

定性rfimin設(shè)置9.0會(huì)使上文對(duì)hcv給出的例子中的受抑制的pcr反應(yīng)無效。

定性結(jié)果輸出的上述rfimin設(shè)置不能同時(shí)用于定量結(jié)果輸出，因?yàn)榘形锏拇嬖诳梢杂绊慽c/qs增長(zhǎng)曲線的熒光強(qiáng)度，如圖1a中顯示的。結(jié)果，在存在高靶物濃度的情況下，定性rfimin設(shè)置導(dǎo)致較高百分比的ic/qs無效反應(yīng)。相比之下，這并不影響定性結(jié)果輸出的有效性，因?yàn)閕c在存在靶物的情況中不得(mustnot)是有效的。盡管定量反應(yīng)的有效性受到顯著影響。

因此，如果要使用具有一種ic/qs的相同測(cè)試試劑來提供可靠的定性結(jié)果輸出(具有保證的測(cè)試靈敏度)和可靠的定量測(cè)試結(jié)果(具有可接受的低水平的qs無效結(jié)果)兩者，這僅可以通過用如這里提出的兩組不同參數(shù)設(shè)置分析原始數(shù)據(jù)來實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例2：使用不同濃度的第一和第二對(duì)照核酸用相同測(cè)試試劑獲得定量和定性結(jié)果輸出。

目的是用同一組測(cè)試試劑提供可靠的定性結(jié)果輸出和可靠的定量測(cè)試結(jié)果兩者。在解決此目的的此辦法中，含有內(nèi)部對(duì)照核酸的試劑包含具有兩種不同裝甲的rna顆粒的配制劑。可以使用下列試劑進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)：

a)cobasampliprep/cobastaqmanhcv測(cè)試的樣品制備試劑(磁性顆粒懸浮液；蛋白酶溶液，裂解緩沖液，洗脫緩沖液)

b)濃度水平為約1000個(gè)拷貝/反應(yīng)的qs裝甲顆粒和濃度水平為約100個(gè)拷貝/反應(yīng)的ic裝甲顆粒。在下文圖2中顯示了裝甲rna顆粒的生成。由裝甲顆粒封入的轉(zhuǎn)錄物具有不同引物結(jié)合位點(diǎn)和不同探針結(jié)合位點(diǎn)。與黑洞(blackhole)猝滅劑bhq一起用熒光標(biāo)記物hex和cy5標(biāo)記探針。

c)鎂試劑

d)主混合物(mastermix)試劑，其包含：

-z05dna聚合酶和ung

-針對(duì)靶hcv、針對(duì)第一和針對(duì)第二對(duì)照核酸的三種不同引物對(duì)

-用fam和bhq標(biāo)記的針對(duì)靶物、用hex和bhq標(biāo)記的針對(duì)第一對(duì)照核酸和用cy5和bhq標(biāo)記的針對(duì)第二對(duì)照核酸的三種不同探針

-適體

-dntp(dutp、datp、dctp、dgtp、dttp)

-主混合物緩沖液成分(醋酸鉀、甘油、tricine、dmso、甜菜堿、igepal、水)

使用對(duì)cobasampliprep/cobastaqmanhcv測(cè)試建立的標(biāo)本提取參數(shù)和pcr文件來實(shí)施樣品制備和擴(kuò)增/檢測(cè)步驟。獲得三種不同熒光染料的增長(zhǎng)曲線，并且在圖3中呈現(xiàn)。

對(duì)于hcv樣品，如下測(cè)定滴度以獲得定量結(jié)果輸出：在完成pcr運(yùn)行后，處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生qs核酸(hex熒光標(biāo)記物)的一組染料濃度數(shù)據(jù)、定性標(biāo)準(zhǔn)核酸(cy5熒光標(biāo)記物)的一組染料濃度數(shù)據(jù)、和靶核酸(fam熒光標(biāo)記物)的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理所有三組染料濃度數(shù)據(jù)。對(duì)定量和定性標(biāo)準(zhǔn)核酸以及靶核酸計(jì)算肘值(ct)。肘值定義為靶核酸或兩種內(nèi)部對(duì)照核酸的熒光與預(yù)定閾值(熒光濃度)相交的點(diǎn)。

對(duì)于定量結(jié)果輸出，通過僅分析hex和fam的染料濃度數(shù)據(jù)來完成滴度測(cè)定。滴度測(cè)定基于如下的假定，即靶核酸和qs核酸以相同的效率擴(kuò)增，且在計(jì)算的肘值，擴(kuò)增并檢測(cè)相等量的靶核酸和qs核酸的擴(kuò)增子拷貝。因此，(ctqs–ct靶物)與對(duì)數(shù)(靶物濃度/qs濃度)呈線性。然后，可以例如通過使用如下述等式中的多項(xiàng)式校正式計(jì)算滴度t，其中該等式中唯一的變量是差(ctqs–ct靶物)：

t’＝10(a(ctqs–ct靶物)2+b(ctqs–ct靶物)+c)

對(duì)于定性結(jié)果輸出，僅分析cy5和fam的染料濃度數(shù)據(jù)。通過比較cy5和fam的染料濃度數(shù)據(jù)，軟件確定pcr反應(yīng)呈靶物陰性還是陽(yáng)性。如果pcr反應(yīng)呈靶物陽(yáng)性，那么忽略ic結(jié)果，并且因此其可以是有效或無效的。如果pcr反應(yīng)呈靶物陰性，那么結(jié)果僅在ic顯示有效結(jié)果時(shí)才是有效的。在上文顯示的實(shí)施例中，所有反應(yīng)都含有較低水平的hcv靶物，并且盡管對(duì)于相應(yīng)測(cè)試結(jié)果的有效性而言無關(guān)，所有反應(yīng)都顯示有效的ic。