本發(fā)明屬于微生物學檢測方面的質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品及其制備方法。

背景技術(shù)：

生活飲用水微生物學檢驗領(lǐng)域非常特殊。目前，雖然國內(nèi)外已有認可機構(gòu)組織生活飲用水微生物學能力驗證和大規(guī)模的制備微生物能力驗證樣品的先例，但多為總大腸菌群定性樣品或純菌株，但總大腸菌群定量檢測樣品制備難度較高，，尚無一種較好的制備方法，均勻性和穩(wěn)定性無法達到要求總大腸菌群即總大腸菌群標準樣品仍屬空白領(lǐng)域。

總大腸菌群并非細菌學分類命名，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化特征及血清學方面并非完全一致，其定義為：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌等。如果制備的總大腸菌群樣品中，目標菌群易發(fā)生變化(繁殖和死亡等)，就會導致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩(wěn)定性差。因此，綜合考慮細菌的生化特性，選取性質(zhì)相對穩(wěn)定的菌群作為目標菌群對保證樣品的均勻性和穩(wěn)定性十分重要?？偞竽c菌群樣品制備的工藝技術(shù)要求比較高，并且樣品的均勻性和穩(wěn)定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護劑的使用、再水化的介質(zhì)等均有密切的關(guān)系。

生活飲用水中總大腸菌群指標，直接反映著生活飲用水的衛(wèi)生質(zhì)量與潛在致病風險。如果總大腸菌群數(shù)超過一定限量，就加大了致病性大腸埃希氏菌的存在風險，并最終導致食源性疾病發(fā)生。因此，制備均勻性與穩(wěn)定性俱佳的總大腸菌群樣品，可以避免總大腸菌群檢驗的隨意性和不確定性，真實地反映檢測實驗室的能力。這對提高實驗室質(zhì)量控制水平，保障生活飲用水安全，甚至于打破國際貿(mào)易壁壘、提高我國生活飲用水國際競爭力都具有特殊重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服總大腸菌群測定樣品中總的活的細菌數(shù)目在運輸、儲存和測試等過程中菌落數(shù)都可發(fā)生變化的問題，提供一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品，均勻性、穩(wěn)定性符合能力驗證要求，本發(fā)明的另一個目的是提供該樣品的制備方法，工藝簡單，成功率高。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品，其特征是：包括目標菌群和背景菌群，所述目標菌群由大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)和產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)組成，所述背景菌群由金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。

所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖體積分數(shù)為12％、脫脂奶粉體積分數(shù)為0.1％。

所述樣品中目標菌群的目標濃度為10²～10³cfu/100ml，背景菌群的目標濃度為10²cfu/ml。

一種生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗四個步驟，其中樣品凍干過程為：菌株復蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲存，具體過程為：

(1)菌株復蘇傳代

將標準菌株接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；

(2)增菌

目標菌群培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面刮取菌落，加到少量的凍干保護劑中制成相應單一菌種的菌液；

(3)菌懸液配制

將上一過程得到的菌液與凍干保護劑混合，按目標菌群的目標濃度10²～10³cfu/100ml和背景菌群的目標濃度10²cfu/ml配制菌懸液，分別配制5個目標菌的菌懸液和2個背景菌的菌懸液，分別按1:1體積比混合形成目標菌群懸液和背景菌群懸液，再將目標菌群懸液與背景菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實；

(4)凍干和包裝

將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機中，冷凍干燥40～50h，當樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進行箱內(nèi)加塞，關(guān)閉機器，樣品瓶中樣品為真空狀態(tài)；

(5)儲存

將樣品放置在4℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機挑選樣品進行均勻性和穩(wěn)定性試驗，滿足要求后發(fā)放給參試實驗室進行實驗室間比對。

所述凍干保護劑為含有海藻糖和脫脂奶粉的無菌水，其中體積分數(shù)分別為：海藻糖12％、脫脂奶粉0.1％。

所述樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗按照cnas—gl03《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》進行。

本發(fā)明菌種的選擇采用大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌作為總大腸菌群樣品的目標菌群，以金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌作為背景菌群。眾所周知，總大腸菌群是一類在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性無芽孢桿菌?？偞竽c菌群中的大腸埃希氏菌比較常見，但非常容易受到環(huán)境因素(特別是溫度)的影響。相比而言，以肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌作為目標菌群，可以最大程度保證測試樣品的穩(wěn)定性，即使在運輸及儲存中大腸埃希氏菌的含量發(fā)生變化，在統(tǒng)計學意義上也不會影響總大腸菌群的總量。

本發(fā)明的總大腸菌群能力驗證樣品具有以下優(yōu)勢特性：活的微生物、數(shù)量不發(fā)生變化、生化特征不發(fā)生變異，從滿足特殊運輸?shù)臈l件著手，通過特殊工藝的研究、穩(wěn)定性和均勻性的研究等形成一套完善的能力驗證的樣品制備技術(shù)，完全適合開展生活飲用水中總大腸菌群(定量)項目的考核，正確評價能力驗證結(jié)果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明工藝流程圖。

圖2為4℃條件下樣品總大腸菌群的穩(wěn)定性試驗結(jié)果圖。

圖3為在不同溫度下樣品的穩(wěn)定性試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明并不局限于具體實施例。

實施例1

生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品，包括目標菌群和背景菌群，所述目標菌群由大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)和產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)組成，所述背景菌群由金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。

所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖體積分數(shù)為12％、脫脂奶粉體積分數(shù)為0.1％。

所述樣品中目標菌群的目標濃度為10²～10³cfu/100ml，背景菌群的目標濃度為10²cfu/ml。

實施例2

如圖1所示，一種實施例1中生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品的制備方法，包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗四個步驟，具體步驟如下：

1、樣品添加菌株的選擇

按照目標菌群：大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)和產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)，背景菌群：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)選擇標準菌株，所有標準菌株均購于政府指定的機構(gòu)，并附有菌株證書，保證了菌株的溯源性。

2、凍干保護劑的配制

樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)(體積分數(shù)：海藻糖12％，脫脂奶粉0.1％)配制凍干保護劑。

3、樣品凍干

(1)菌株復蘇傳代

將標準菌株接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；

(2)增菌

目標菌群培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護劑中制成相應單一菌種的菌液；

(3)菌懸液配制

將上一過程得到的菌液與凍干保護劑混合，按目標菌群的目標濃度10²～10³cfu/100ml和背景菌群的目標濃度10²cfu/ml配制菌懸液。為保證得到的最終樣品中含有以上目標濃度的菌株，本實施例中按照目標菌10³cfu/100ml分別配制5個目標菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成目標菌群懸液；背景菌按10²cfu/ml配制2個背景菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成背景菌群懸液；背景菌群懸液與目標菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，采用比濁法檢查菌株含量；置于磁力攪拌器上不斷攪拌下取1.0ml分裝到樣品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實；

(4)凍干和包裝

將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機中，冷凍干燥機參數(shù)按如下設(shè)置：

冷凍速度(coolingrate)0.5℃/min

早期冷凍點(incipientfreezingpoint)-1℃15min

冷凍溫度(coolingtemperature)-40℃

共熔點(meltingpointeutectictemperature)-29℃

加熱溫度(heatingtemperature)20℃120min

啟動冷凍干燥機，機器直接進入程序化的冷凍干燥過程，整個凍干過程40h。

當樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進行箱內(nèi)加塞；關(guān)閉機器。剔除塞子不緊的西林瓶，西林瓶中樣品為真空狀態(tài)；

(5)儲存

將樣品放置在-18℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機挑選樣品均勻性和穩(wěn)定性試驗，滿足要求后發(fā)放給參試實驗室進行實驗室間比對。

4、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗

對樣品中目標菌的均勻性和穩(wěn)定性檢查是驗證樣品制備過程有效性的主要方法。檢查樣品均勻性和穩(wěn)定性按照cnas—gl03《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》進行。

所得樣品均勻性和穩(wěn)定性檢測方法及結(jié)果如下：

分別隨機選取12個樣品，采用gb/t5750.12-2006總大腸菌群方法，在重復條件測試2×12份樣品的總大腸菌群。結(jié)果數(shù)據(jù)用單因素方差分析(anov)進行統(tǒng)計處理，統(tǒng)計步驟及結(jié)果如下：

表1方差分析公式

上表中，

表2樣品均勻性檢測結(jié)果

表3樣品均勻性試驗方差分析結(jié)果

結(jié)論：在95％置信概率下，與其他因素對測試結(jié)果的影響相比，樣品的不均勻性是可接受的。

采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗：一種是在貯存溫度(4℃)下的穩(wěn)定性試驗，另一種是在高的溫度(模擬樣品的運輸條件)下的穩(wěn)定性試驗，選用三個溫度點，分別為20℃、36℃和45℃。定期檢測樣品，針對不同溫度點不同的保存時間測試3個樣本，將2×3份樣品結(jié)果的均值(對數(shù)轉(zhuǎn)化后)與均勻性測試結(jié)果比較，之間的絕對差值除以測試計劃中能力評價用穩(wěn)健標準差s^*，比值小于0.3為原則確定在不同溫度條件下符合能力驗證樣品要求的最長保存時間。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見圖2和圖3。

實施例3

本實施例中所述的生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品的制備方法的各步驟均與實施例2中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標菌群懸液中各目標菌的濃度按照5×10³cfu/100ml配制，背景菌群懸液中各背景菌的濃度按照10²cfu/ml配制；凍干過程45h。

實施例4

本實施例中所述的生活飲用水中總大腸菌群能力驗證樣品的制備方法的各步驟均與實施例3中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標菌群懸液中各目標菌的濃度按照4.5×10³cfu/100ml配制；凍干過程50h。