本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體來說是一種腦膠質(zhì)瘤mgmt啟動子基因甲基化的檢測方法。

背景技術：

dna甲基化是一種基因組dna表觀遺傳修飾的主要形式和基因組功能調(diào)節(jié)的重要手段。dna甲基化修飾的方式有很多，被修飾位點的堿基可以是腺嘌呤n-6位、胞嘧啶的n-4位，也可以是鳥嘌呤的n-7位或胞嘧啶的c-5位。dna甲基化具體是指在dna甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組cpg二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。最近研究表明dna甲基化在基因突變、表達調(diào)控、細胞增殖、分化、發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關系。

通過調(diào)整dna修飾機制來提高常規(guī)化療藥物療效是腫瘤研究的一個重要領域,o6-甲基鳥嘌呤-dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mgmt)在修飾o6-烷基鳥嘌呤損傷中的特殊作用機制及自殺性酶特性，使其在腫瘤早期診斷和預測腫瘤對烷化劑敏感性中具備重要意義。

mgmt基因結(jié)構功能的異常，特別是啟動子過甲基化和腫瘤發(fā)生以及生物學上的聯(lián)系，正成為關注的焦點,啟動子區(qū)過甲基化是引起基因沉默的主要機制之一，可能影響基因功能的正常發(fā)揮,大量研究表明，mgmt基因甲基化與替莫唑胺(tmz)療效相關，mgmt基因啟動子甲基化患者組生存時間明顯長于非甲基化組。

目前甲基化的檢測方法很多，如甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶-pcr/southern法、直接測序法、甲基化特異性pcr(msp)-電泳等,mgmt基因甲基化檢測最常用的是msp，該方法操作方便、適用性廣，靈敏度約為10％,直接測序法的靈敏度低，要求受檢材料的突變比例大于20％，且檢測成本高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有技術中的檢測精確度差、操作不便的缺陷，而提供一種腦膠質(zhì)瘤mgmt啟動子基因甲基化的檢測方法。

本發(fā)明解決上述技術問題提供的技術方案是：本發(fā)明公開了一種腦膠質(zhì)瘤mgmt啟動子基因甲基化的檢測方法，具體步驟如下：

(1)、用組織dna提取試劑盒對患者腦膠質(zhì)瘤的組織提取dna，確保dna濃度不低于50ng/ul，260/280＝1.8；

(2)、取20uldna，用甲基化修飾試劑盒對提取dna進行硫化處理；

(3)、用seqno1和seqno2甲基化引物對已經(jīng)硫化修飾后的dna位模板進行降落pcr，其中反應體系為25ul，其包括：模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.5ul、去離子水：16ul；

(4)、利用seqno1和seqno2甲基化引物pcr擴增的產(chǎn)物稀釋1000倍位模板，再以seqno3和seqno4引物進行普通pcr擴增，其中反應體系為25ul，其包括:模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.5ul、去離子水：16ul；

(5)、將seqno3和seqno4引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；

(6)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶；

(7)、pcr產(chǎn)物的與t載體的連接轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選：

(7.1)、插入的目的基因片斷與載體的摩爾數(shù)比為3～8:1，反應體系如下：

混勻反應體系，整個反應體系置于22℃連接30min；

(7.2)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌：

在100μl的感受態(tài)細胞中加入10μl連接的產(chǎn)物，冰浴30min，將此混合物置于42℃水浴準確熱激90s，迅速將反應物冰浴3min，加入400μl新鮮的lb液體培養(yǎng)基，于37℃，120rpm搖床溫育60min，培養(yǎng)液懸浮細胞，全部涂布于lb/ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃溫箱中倒置培養(yǎng)12～16h，直至出現(xiàn)單菌落，將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱放置數(shù)小時，使其充分顯色，即出現(xiàn)藍、白斑，其中藍色菌落為空載體，白色菌落即為含有外源基因片斷的重組子；

(8)、菌落pcr進行重組子的篩選：

用接菌環(huán)挑取白色單菌落于1mllb/ampicillin液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)3h，肉眼觀察渾濁，取1μl菌液作為為模板，按照步驟(4)的pcr反應體系和條件進行菌落pcr擴增，pcr擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖電泳，紫外透射儀檢測，出現(xiàn)目的帶的對應菌落為陽性克隆；

(9)、將陽性的克隆送到測序；

(10)、將測序結(jié)果用biq-analyzer軟件分析，得到甲基化結(jié)果。

作為優(yōu)選，所述的步驟(3)中，其反應條件如下：95℃預變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃至42℃退火30s每度2個cycle，最后再42℃退火30s10個cycles，72℃延伸45s，共42個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。

作為優(yōu)選，所述的步驟(4)中，其反應條件如下：95℃預變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。

作為優(yōu)選，所述的步驟(8)中，其反應條件如下：95℃預變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存，反應體系為25ul體系，其包括:模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.5ul、去離子水：16ul。

作為優(yōu)選，所述的步驟(3)-(5)中，所述的特異性擴增的引物seqno1、seqno2、seqno3和seqno4，其堿基序列如下所示：

seqno1：gtttagygaggatgygtagattgtt

seqno2：aaaaaaaactaaacaacacctaa

seqno:3：tttttttygggtttygttttagttt

seqno:4：actcrcccraaataaataaaaatca。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點：

本發(fā)明的目的是提供檢測腦膠質(zhì)瘤mgmt基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，即用于檢測mgmt基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，本發(fā)明的另一個目的是提供檢測腦膠質(zhì)瘤mgmt啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的方法，以此來對腦膠質(zhì)瘤對烷化劑化療藥物敏感性做分子標記；

經(jīng)過反復的實驗與推敲，本發(fā)明選出了兩對特異性很好的甲基化引物，第一對用于降落pcr用，第二對在第一對引物擴增產(chǎn)物內(nèi)再設計的引物，并且建立了穩(wěn)定的反應體系，摸索出理想的反應條件，應用敏感度較高的丙烯酰胺凝膠電泳技術作為結(jié)果檢出手段，因此得出可靠地實驗結(jié)果；

由上可知，本發(fā)明所述的腦膠質(zhì)瘤mgmt啟動子基因甲基化的檢測方法，檢測精度較高，靈敏度好，操作比較方便。

附圖說明

圖1為實施例1中將seqno3和seqno4引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果圖；

圖2為實施例1中的步驟(8)中菌落pcr進行重組子的篩選的檢測結(jié)果圖；

圖3為實施例1中的將測序結(jié)果用biq-analyzer軟件分析的分析結(jié)果圖；

圖4為實施例1中的將測序結(jié)果用biq-analyzer軟件分析的分析圖；

圖5為實施例1中的將測序結(jié)果用biq-analyzer軟件分析的結(jié)果圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。

實施例1：

將腦膠質(zhì)瘤a1患者進行mgmt啟動子甲基化檢測

(1)、用a1腦膠質(zhì)瘤的組織用組織dna提取試劑盒提取dna確保dna濃度為100ng/ul，260/280＝1.82。

(2)、取20uldna用甲基化修飾試劑盒對提取dna進行硫化處理；

(3)、用seqno1和seqno2甲基化引物對已經(jīng)硫化修飾后的dna位模板進行降落pcr，其反應條件如下：95℃預變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃至42℃退火30s每度2個cycle，最后再42℃退火30s10個cycles，72℃延伸45s，共42個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存，反應體系為25ul體系，其包括:模板(硫化產(chǎn)物)：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.5ul、去離子水：16ul；

(4)、利用seqno1和seqno2甲基化引物pcr擴增的產(chǎn)物稀釋1000倍位模板以seqno3和seqno4引物進行普通pcr擴增，其反應條件如下：95℃預變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共42個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存，反應體系為25ul體系，其包括:模板(seqno1和seqno2甲基化引物擴增產(chǎn)物)：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.5ul、去離子水：16ul；

(5)、將seqno3和seqno4引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳；

(6)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收378bp目的條帶；

(7)、pcr產(chǎn)物的與t載體的連接轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選

(7.1)、插入的目的基因片斷與載體的摩爾數(shù)比為3～8:1，反應體系如下：

混勻反應體系，整個反應體系置于22℃連接30min；

(7.2)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌

在100μl的感受態(tài)細胞中加入10μl連接的產(chǎn)物，冰浴30min，將此混合物置于42℃水浴準確熱激90s，迅速將反應物冰浴3min，加入400μl新鮮的lb液體培養(yǎng)基，于37℃，120rpm搖床溫育60min，培養(yǎng)液懸浮細胞，全部涂布于lb/ampicillin平板上，水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃溫箱中倒置培養(yǎng)12～16h，直至出現(xiàn)單菌落，將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱放置數(shù)小時，使其充分顯色，即出現(xiàn)藍、白斑，其中藍色菌落為空載體，白色菌落即為含有外源基因片斷的重組子。

(8)、菌落pcr進行重組子的篩選

用接菌環(huán)挑取5個白色單菌落于1mllb/ampicillin液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)3h，肉眼觀察渾濁，取1μl菌液作為為模板，按照4.4的pcr反應體系和條件進行菌落pcr擴增，pcr擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳，紫外透射儀檢測，出現(xiàn)目的帶的對應菌落為陽性克??；

(9)、將陽性的克隆測序；

(10)、將測序結(jié)果用biq-analyzer軟件分析。

參照圖3，mgmt基因原始序列與b9mgmt啟動子基因比對結(jié)果如圖3可以清楚發(fā)現(xiàn)有兩處發(fā)生甲基化；

參照圖4，圓圈代表cpg，白色圓圈表示未甲基化的，黑色圓圈表示甲基化；

參照圖5，柱子代表cpg，藍色柱子表示未甲基化的cpg位置，黃色柱子表示甲基化cpg位置。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。