本發(fā)明涉及生物免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種異魯米諾衍生物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)及其衍生物是最早在化學(xué)發(fā)光法中使用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。魯米諾化學(xué)名3-氨基鄰苯二甲酰胼，最早由albrecht報(bào)道其發(fā)光特性。這類(lèi)物質(zhì)通過(guò)氧化產(chǎn)生α-羥基過(guò)氧化物的中間體，該中間體的分解可釋放出光能，所發(fā)光的性質(zhì)與反應(yīng)系統(tǒng)的ph值有關(guān)。魯米諾類(lèi)化合物的氧化步驟與溶劑組分有關(guān)，在非質(zhì)子溶劑中，化學(xué)發(fā)光只需要氧氣和一種強(qiáng)堿；在質(zhì)子溶劑中，需要酶來(lái)催化各種氧的衍生物氧化魯米諾。魯米諾體系的發(fā)光效率并不高，標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度會(huì)降低，而通過(guò)對(duì)非雜環(huán)進(jìn)行化學(xué)修飾可以提高部分發(fā)光強(qiáng)度。
上世紀(jì)三十年代中后期，gleu發(fā)現(xiàn)了可以大大增強(qiáng)酶催化魯米諾化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度的物質(zhì)，即增強(qiáng)劑-羥高鐵血紅素(haematin)，其可以明顯增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，提高信噪比及靈敏度。與不含增強(qiáng)劑的體系相比，加入增強(qiáng)劑后組成的魯米諾體系的發(fā)光強(qiáng)度可提高1000倍，發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)至幾個(gè)小時(shí)，使原來(lái)的瞬時(shí)發(fā)光變?yōu)榱顺掷m(xù)發(fā)光，1978年，schroeder報(bào)道了abei及其類(lèi)似物的合成方法，并指出在h2o2-haematin底物系統(tǒng)中，n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為abei)幾乎與魯米諾具有相當(dāng)?shù)陌l(fā)光效率和檢測(cè)靈敏度，并建立了甲狀腺素(t4)的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，鑒于此，abei作為一種化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中。
目前abei的主要標(biāo)記方法有edc法、半琥珀酰胺活潑酯法、環(huán)內(nèi)酯法，但這些方法均存在發(fā)光強(qiáng)度不夠、背景值偏高，靈敏度有待改善等缺陷，同時(shí)，過(guò)多的標(biāo)記又會(huì)對(duì)抗體或蛋白活性產(chǎn)生影響，限制了其在化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用。因此為適應(yīng)科學(xué)研究及市場(chǎng)的實(shí)際需求，有必要提供一種增強(qiáng)型異魯米諾衍生物，以提供更高檢測(cè)的靈敏度，且減少對(duì)蛋白活性產(chǎn)生的影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)以上缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)光強(qiáng)度高的增強(qiáng)型異魯米諾衍生物及其制備方法，用于增強(qiáng)現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限；同時(shí)，降低發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含上述異魯米諾衍生物的化學(xué)發(fā)光底液，或包含上述異魯米諾衍生物標(biāo)記的抗原或抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒以及化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，已解決采用現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系測(cè)試時(shí)靈敏度和檢出限差的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明的再一目的在于上述異魯米諾衍生物在化學(xué)發(fā)光免疫定量分析中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種異魯米諾衍生物，其通式(i)為下式所示：
式中，x表示含有一個(gè)酰胺基的c原子數(shù)為1～7的直鏈或支鏈烷基，且烷基中插入至多一個(gè)亞氨基，或
x表示含有一個(gè)酰胺基的c原子數(shù)為1～7的烷基次氨基；
a的結(jié)構(gòu)式為：
y表示亞甲基或1,3-亞乙氧基；
a選自4～24的整數(shù)，b選自0～20的整數(shù)，且a+b≤24；
c、d選自0～6的整數(shù)；
s、t選自3～10的整數(shù)；
m、n選自0或1。
在現(xiàn)有技術(shù)中，abei作為一種化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，一方面，在標(biāo)記抗體或抗原時(shí)會(huì)損壞抗體或抗原的活性；另一方面，abei在參與發(fā)光反應(yīng)時(shí)，其結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率以及蛋白表面電荷的平衡，致使其標(biāo)記的抗原或抗體易沉淀從而影響抗原或抗體的穩(wěn)定性；且鑒于abei現(xiàn)有結(jié)構(gòu)，其發(fā)光效率也有局限性。因此，本發(fā)明通過(guò)提供一種發(fā)光強(qiáng)度高的增強(qiáng)型異魯米諾衍生物，不僅降低發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響；且有效保證發(fā)光反應(yīng)的正向進(jìn)行，維持抗原或抗體在溶液中的穩(wěn)定性。更關(guān)鍵的，本發(fā)明提供的異魯米諾衍生物通過(guò)成倍添加該衍生物的發(fā)光單元，大幅提高現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限。
上述通式(i)中，x的酰胺基與通式(i)中的-(ch2)b-連接?？梢岳斫?，上述a是一個(gè)基團(tuán)，其與z基團(tuán)連接形成a-z結(jié)構(gòu)式，具體如下：
，其中z表示通式(i)中除去a的基團(tuán)。
優(yōu)選地，x可任選自以下結(jié)構(gòu)：
(b1)：-n(h)c(＝o)-烷基-，且烷基中插入至多一個(gè)亞氨基，其中，烷基的碳原子數(shù)為1～6；或
(b2)：-n(h)c(＝o)-烷基次氨基-，且烷基的碳原子數(shù)為1～6；或
(b3)：-c(＝o)n(h)-烷基-，且烷基的碳原子數(shù)為1～6；或
(b4)：-c(＝o)n(h)-烷基次氨基-，且烷基的碳原子數(shù)為1～6。
進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)x的結(jié)構(gòu)為上述b1或b2時(shí)，m＝n＝1；
進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)x的結(jié)構(gòu)為上述b3或b4時(shí)，m＝n＝0。
在上述異魯米諾衍生物中，通過(guò)控制插入的間隔臂，即通過(guò)多個(gè)亞甲基和/或1,3-亞乙氧基形成的長(zhǎng)鏈，尤其是通過(guò)1,3-亞乙氧基形成的長(zhǎng)鏈保證該異魯米諾衍生物標(biāo)記抗原或抗體后保持其在溶液中的穩(wěn)定，進(jìn)一步保證發(fā)光反應(yīng)的穩(wěn)定性，本發(fā)明a優(yōu)選為4～12的整數(shù)；b優(yōu)選為0～12的整數(shù)；同樣，將s、t進(jìn)一步優(yōu)選為3～6的整數(shù)，c、d進(jìn)一步優(yōu)選自0～3的整數(shù)。
上述通式(i)中，x結(jié)構(gòu)式的烷基的碳原子數(shù)優(yōu)選為1～3，進(jìn)一步優(yōu)選為下述結(jié)構(gòu)：
-n(h)c(＝o)-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-ch(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-ch(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch(ch3)-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-nh-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-nh-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-nh-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-nh-ch2-ch(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-n(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-n(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-ch2-n(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch2-n(r1r2)或
-n(h)c(＝o)-ch2-ch(ch3)-n(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-n(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-n(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-ch2-n(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch2-n(r1r2)或
-c(＝o)n(h)-ch2-ch(ch3)-n(r1r2)
上述r1、r2基團(tuán)相互獨(dú)立，且分別表示通式(i)中的-(ch2)c-和-(ch2)d-的結(jié)構(gòu)。
特別優(yōu)選地，為保證本發(fā)明的異魯米諾衍生物易于參加后續(xù)發(fā)光反應(yīng)，烷基為碳原子數(shù)優(yōu)選為1～2的直鏈烷基，尤其優(yōu)選為與r1、r2基團(tuán)連接的原子為n且碳原子數(shù)為1～2的直鏈烷基。
本發(fā)明的異魯米諾衍生物通過(guò)插入有限長(zhǎng)度的間隔臂，且通過(guò)優(yōu)化基團(tuán)和成倍添加發(fā)光單元，不僅降低現(xiàn)有abei發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響，提高抗原和抗體的結(jié)合率；且保證異魯米諾衍生物標(biāo)記抗原或抗體后的穩(wěn)定性，更顯著增強(qiáng)現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限。
本發(fā)明還提供一種制備上述異魯米諾衍生物的方法，包括下述步驟：
1)合成n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯；
2)將所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i反應(yīng)，獲得第一中間產(chǎn)物；
3)將所述第一中間產(chǎn)物、n-羥基琥珀酰亞胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為nhs)、交聯(lián)劑反應(yīng)，后添加化合物i繼續(xù)反應(yīng)，獲得第二中間產(chǎn)物；
4)將第二中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑反應(yīng)，獲得異魯米諾衍生物；
其中，所述小分子物質(zhì)i為至少含有兩個(gè)氨基且c原子數(shù)為2～10的脂肪酸，所述脂肪酸的碳鏈可插入0～2個(gè)n原子；
所述化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2
或
其中，a選自4～24的整數(shù)，b選自0～20的整數(shù)，且a+b≤24。
上述步驟1)中合成n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯的方法可以為現(xiàn)有技術(shù)，但優(yōu)選采用下述步驟：n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐反應(yīng)，后加入交聯(lián)劑繼續(xù)反應(yīng)，獲得所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯。其中，酸酐優(yōu)選為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐、辛二酸酐、二甘醇酸酐中的任一種。
在一些具體實(shí)施例中，將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐反應(yīng)的步驟具體為：將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與酸酐溶于溶劑，并通入保護(hù)性氣體，在40～100℃下水浴攪拌反應(yīng)10～60分鐘，后移到室溫下避光繼續(xù)反應(yīng)1～3小時(shí)。上述反應(yīng)溫度在40度以上，則反應(yīng)速度不會(huì)下降，且縮短反應(yīng)時(shí)間，較為適當(dāng)；反應(yīng)溫度在100度以下，則不發(fā)生副反應(yīng)。
上述步驟1)中，加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、酸酐、交聯(lián)劑的摩爾比優(yōu)選為1：1～3：1～3；在合成過(guò)程中，加入適當(dāng)過(guò)量的酸酐和交聯(lián)劑可以保證反應(yīng)的徹底性，同時(shí)也將副產(chǎn)物的產(chǎn)率控制在合理范圍，方便后續(xù)分離純化。在一些具體實(shí)施例中，上述加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、酸酐、交聯(lián)劑的摩爾比為1：1.25：1.25。
上述步驟2)中，獲得的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i，反應(yīng)獲得第一中間產(chǎn)物的步驟具體為：將所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i溶于溶劑，并通入保護(hù)性氣體，在30～50℃下避光反應(yīng)3～6小時(shí)，室溫靜止過(guò)夜，獲得所述第一中間產(chǎn)物。
需要說(shuō)明，本制備方法中小分子物質(zhì)i的分子量小于500。其中，小分子物質(zhì)i為含有兩個(gè)氨基且c原子數(shù)為3～10的脂肪酸，所述脂肪酸的碳鏈可插入0～1個(gè)n原子。優(yōu)選地，所述小分子物質(zhì)i的同一個(gè)碳原子上連接的兩個(gè)活性基團(tuán)不相同，包括但不限于兩個(gè)羧基、或兩個(gè)氨基。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述小分子物質(zhì)i任選自3-(n,n-二胺乙基氨基)丙酸、2,4-二氨基戊酸、4-氨基-3-氨甲基丁酸、2-(n,n-二胺乙基氨基)乙酸、3,5-二氨基戊酸、3-(n,n-二胺丙基氨基)丙酸、2-(n,n-二胺丙基氨基)乙酸。
上述步驟(2)中，反應(yīng)溫度在30度以上，則反應(yīng)速度不會(huì)下降，且縮短反應(yīng)時(shí)間，較為適當(dāng)；且為防止反應(yīng)產(chǎn)物分解及確保中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性，反應(yīng)溫度應(yīng)在50度以下。
在一些具體實(shí)施例中，上述加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i的摩爾比為1：0.5～2.5，在合成過(guò)程中，加入適量過(guò)量的小分子物質(zhì)i可以保證可以保證反應(yīng)的徹底性，同時(shí)也將副產(chǎn)物的產(chǎn)率控制在合理范圍，方便后續(xù)分離純化。進(jìn)一步優(yōu)選地，加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i的摩爾比為1：0.625。
上述步驟3)中，化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或
其中，為保證獲得的異魯米諾衍生物參與發(fā)光反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)效率，即維持抗原或抗體在溶液中的穩(wěn)定性，本發(fā)明a優(yōu)選為4～12的整數(shù)；b優(yōu)選為0～12的整數(shù)。
需要說(shuō)明，為便于后續(xù)描述，在一些具體實(shí)施例中，當(dāng)化合物i中a、b的數(shù)量作出以下變化時(shí)，采用以下相應(yīng)簡(jiǎn)稱(chēng)表示化合物i，其中下述的peg表示1,3-亞乙氧基，me表示亞甲基，c表示羧基，a表示氨基，bs表示兩個(gè)nhs基團(tuán)：
(1)化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2時(shí)，
a＝4，b＝2，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)2；
a＝4，b＝4，化合物ii簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)4；
a＝4，b＝12，化合物ii簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)12；
a＝12，b＝2，化合物ii簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)12(me)2；
a＝12，b＝4，化合物ii簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)12(me)4；
(2)化合物i為
a＝5，b＝2，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)5(me)2；
a＝4，b＝4，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)4(me)4；
a＝4，b＝12，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)4(me)12。
在一些具體實(shí)施例中，上述加入的第一中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑的摩爾比為1：1～3：1～3；。為進(jìn)一步控制反應(yīng)的正向進(jìn)行，加入的第一中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑的優(yōu)選為摩爾比為1：1.25：1.25。在另一些具體的實(shí)施例中，上述加入的第一中間產(chǎn)物、化合物ii的摩爾比為1：1～5。
在一些具體實(shí)施例中，將第一中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑反應(yīng)，后添加化合物i繼續(xù)反應(yīng)，獲得第二中間產(chǎn)物的步驟具體為：將第一中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑溶于溶劑，并通入保護(hù)性氣體，室溫下攪拌且避光反應(yīng)1～3小時(shí)，后添加化合物i在30～50℃下避光反應(yīng)1～3小時(shí)，獲得所述第二中間產(chǎn)物。上述反應(yīng)溫度在30度以上，則反應(yīng)速度不會(huì)下降，且縮短反應(yīng)時(shí)間，較為適當(dāng)；且為防止反應(yīng)產(chǎn)物分解及確保中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性，反應(yīng)溫度應(yīng)在50度以下。
優(yōu)選地，上述在室溫下攪拌且避光反應(yīng)1～3小時(shí)之后，且在添加所述化合物i之前，還包括判斷是否有沉淀，如有沉淀，離心去掉沉淀取上清溶液，后在上清溶液中加入化合物ii繼續(xù)反應(yīng)。更優(yōu)選地，當(dāng)交聯(lián)劑為dcc或dic時(shí)，進(jìn)行離心去掉沉淀取上清溶液的步驟。
在一些具體實(shí)施例中，再處理步驟具體為：氮?dú)獯蹈伤龇磻?yīng)液，后重溶于甲醇、分離，獲得所述第二中間產(chǎn)物。其中，分離的步驟可以采用現(xiàn)有技術(shù)，但優(yōu)選為硅膠柱層析分離。
上述步驟4)中，第二中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑的摩爾比為1：1～3：1～3；在合成過(guò)程中，加入適量過(guò)量的nhs和交聯(lián)劑可以保證反應(yīng)正向進(jìn)行。進(jìn)一步優(yōu)選地，加入的第二中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑的摩爾比為1：1.25：1.25。
其中，步驟4)具體為：將第二中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑溶于溶劑，并通入保護(hù)性氣體，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，獲得異魯米諾衍生物。
本制備方法步驟1)～4)中。在反應(yīng)后和獲得相應(yīng)產(chǎn)物前，都還包括后處理步驟，所述后處理步驟至少包括萃取、洗滌、干燥、分離步驟中的任一種，所述各步驟的操作順序和次數(shù)以具體情況而定。優(yōu)選地：步驟1)和2)中，反應(yīng)后依次進(jìn)行萃取、洗滌、干燥、旋蒸、分離，獲得所述n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯或第一中間產(chǎn)物；步驟3)中，添加化合物i避光反應(yīng)后，氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，后進(jìn)行重溶、分離，獲得第二中間產(chǎn)物。在一些具體實(shí)施例中，萃取采用的萃取劑包括但不限于酯類(lèi)化合物，例如乙酸乙酯、甲酸乙酯，或者甲苯、二氯甲烷等，可以獨(dú)自使用也可以混合使用。洗滌可以進(jìn)行單次或多次，使用的洗滌劑以具體情況而定，包括但不限于超純水、稀鹽酸、飽和氯化鈉等，且洗滌順序可根據(jù)實(shí)際需要而定。干燥劑包括但不限于無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣等。分離的步驟應(yīng)以具體情況而定，例如可以是硅膠柱分離或采用離心步驟或液相色譜等，也可以分多次進(jìn)行，在此不加以贅述，但本制備方法的分離優(yōu)選為步驟簡(jiǎn)化且成本可控的硅膠柱分離。為進(jìn)一步純化、去除反應(yīng)的副產(chǎn)物，本發(fā)明也可包括對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行旋蒸的步驟，旋蒸根據(jù)獲得的目標(biāo)產(chǎn)物的物化性質(zhì)而定，例如，步驟2)中還包括的旋蒸過(guò)程就需要在低溫條件下(<30℃)進(jìn)行。重溶可以進(jìn)行單次或多次，采用的溶劑優(yōu)選為甲醇、乙醇等醇類(lèi)溶劑，溶劑可以是獨(dú)自使用或至少兩種以上混合使用，優(yōu)選為獨(dú)自使用。
本制備方法步驟1)～4)中，反應(yīng)均在液相中進(jìn)行，所述液相均使用溶劑溶解反應(yīng)物，包括溶解n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾環(huán)內(nèi)酯與小分子物質(zhì)i；或者溶解第一中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑；或者溶解第二中間產(chǎn)物、nhs、交聯(lián)劑，使用的溶劑均為無(wú)水溶劑，優(yōu)選為非質(zhì)子溶劑，進(jìn)一步優(yōu)選為非質(zhì)子極性溶劑。考慮abei衍生物可溶性差，所述溶劑更優(yōu)選自二甲基甲酰胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為nmp)，n,n-二甲基乙酰胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmac)、二甲基亞砜(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmso)、六甲基磷酰胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、吡啶、丙酮中的任一種或兩種以上混合物。該溶劑可以獨(dú)自使用或至少兩種以上混合使用，優(yōu)選為獨(dú)自使用。
本制備方法步驟1)～3)中，交聯(lián)劑優(yōu)選為碳化二亞胺類(lèi)交聯(lián)劑，進(jìn)一步優(yōu)選為二環(huán)己基碳二亞胺(簡(jiǎn)稱(chēng)為dcc)、n,n'-二異丙基碳二亞胺(簡(jiǎn)稱(chēng)為dic)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)為edc)、n-環(huán)己基-n'-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對(duì)甲苯磺酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)為cmc)中的任一種或兩種以上混合物。特別優(yōu)選為dcc和dic。為易于后續(xù)異魯米諾衍生物的標(biāo)記，也可以采用水相的edc和cmc?？梢岳斫?，交聯(lián)劑在不同步驟的作用并不相同，例如，步驟1)中加入交聯(lián)劑可促進(jìn)abei衍生物內(nèi)部脫水縮合形成環(huán)內(nèi)酯；在步驟3)交聯(lián)劑可促進(jìn)nhs脫水形成活化酯，同時(shí)為防止化合物i自身交聯(lián)，交聯(lián)劑必須在加入化合物i之前加入；步驟(4)中交聯(lián)劑用于羧基的活化從而形成活潑酯的結(jié)構(gòu)。
本制備方法步驟1)～4)中，為避免氧氣、防止部分反應(yīng)物氧化，在反應(yīng)中均通入優(yōu)選自氬氣、氖氣或氮?dú)獾乃霰Ｗo(hù)性氣體。另外，考慮到異魯米諾衍生物見(jiàn)光易分解，因此本制備方法的所有步驟都需在避光條件下進(jìn)行。
本制備方法獲得的異魯米諾衍生物在-4～-40℃下進(jìn)行保存；為保證異魯米諾衍生物的穩(wěn)定性，優(yōu)選地，異魯米諾衍生物在-4～-20℃下進(jìn)行保存。
本制備方法在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上大力優(yōu)化反應(yīng)體系，通過(guò)加入小分子物質(zhì)(i)成倍添加發(fā)光單元，后再添加化合物i，以確保降低該衍生物參與反應(yīng)時(shí)的空間效應(yīng)，且保證異魯米諾衍生物參與反應(yīng)時(shí)的效率與穩(wěn)定性，以及nhs和dcc的協(xié)同作用，獲得增強(qiáng)型abei衍生物，該制備方法不僅簡(jiǎn)易可行，且獲得的異魯米諾衍生物不僅增強(qiáng)了現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限；同時(shí)，降低發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響。
本發(fā)明還提供另一種制備上述異魯米諾衍生物的方法，包括下述步驟：
(a)將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與小分子物質(zhì)ii、交聯(lián)劑反應(yīng)，獲得第三中間產(chǎn)物；
(b)溶解所述第三中間產(chǎn)物，并加入縛酸劑反應(yīng)，獲得第四中間產(chǎn)物；
(c)將所述第四中間產(chǎn)物與化合物i反應(yīng)，獲得異魯米諾衍生物；
其中，所述小分子物質(zhì)ii含有至少兩個(gè)不與同一原子相連的羧基和至少一個(gè)連接有氨基保護(hù)基團(tuán)的亞氨基；
所述化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或
其中，a選自4～24的整數(shù)，b選自0～20的整數(shù)，且a+b≤24。
需要說(shuō)明，本制備方法中小分子物質(zhì)ii的分子量小于500。
上述步驟(a)中，為保護(hù)氨基，防止小分子物質(zhì)ii自身交聯(lián)，所述氨基保護(hù)基團(tuán)任選自甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、芐氧羰基、鄰苯二甲?；?、2,4-二甲氧基芐基、對(duì)甲氧基芐基、烯丙氧羰基。在一些具體實(shí)施例中，為更利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，所述氨基保護(hù)基團(tuán)任選自叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、芐氧羰基。
優(yōu)選地，小分子物質(zhì)ii中可插入0～1個(gè)n原子，且該n原子與亞氨基中的n不相同。在一些具體實(shí)施例中，所述小分子物質(zhì)ii選自3-叔丁氧羰基氨基戊二酸、3-叔丁氧羰基氨基庚二酸、3-芴甲氧羰基氨基戊二酸、3-芴甲氧羰基氨基庚二酸、3-芐氧羰基氨基戊二酸、3-芐氧羰基氨基庚二酸、n-叔丁氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-叔丁氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-叔丁氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-叔丁氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芴甲氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芴甲氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芐氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芐氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸、n-芐氧羰基氨丙基-n-羧乙基氨基丙酸、n-芐氧羰基乙基-n-羧乙基氨基丙酸中的任一種。
優(yōu)選地，為將羧基活化后與氨基形成肽鍵，加入的交聯(lián)劑優(yōu)選為碳化二亞胺類(lèi)交聯(lián)劑，進(jìn)一步優(yōu)選為dcc、dic、edc、cmc中的任一種或兩種以上混合物。特別優(yōu)選為dcc和dic。為易于后續(xù)異魯米諾衍生物的標(biāo)記，也可以采用水相的edc和cmc。
其中，上述步驟加入的n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、小分子物質(zhì)ii和交聯(lián)劑的摩爾比為1：0.5～2.5：0.5～2.5，在合成過(guò)程中，加入適量過(guò)量的小分子物質(zhì)ii和交聯(lián)劑可以保證反應(yīng)的徹底性，同時(shí)有效控制副產(chǎn)物的產(chǎn)率。進(jìn)一步優(yōu)選地，n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾、小分子物質(zhì)ii與交聯(lián)劑的摩爾比為1：0.625：0.625。
優(yōu)選地，上述在加入交聯(lián)劑反應(yīng)后，以及在獲得第三反應(yīng)產(chǎn)物前，還包括判斷反應(yīng)是否產(chǎn)生沉淀的步驟，如有沉淀，離心去掉沉淀取上清溶液。
上述步驟(b)中，為避免酸影響反應(yīng)或反應(yīng)平衡，防止副產(chǎn)物的生成，且更易于脫去所述氨基保護(hù)基團(tuán)，在反應(yīng)時(shí)可以加入縛酸劑。本發(fā)明中的縛酸劑指在反應(yīng)過(guò)程中能中和掉酸的一類(lèi)物質(zhì)，包括但不限于有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿，進(jìn)一步優(yōu)選為有機(jī)弱堿。在一些具體實(shí)施例中，更優(yōu)選為三乙胺、三丁胺、吡啶、二甲基氨基吡啶中的任一種?？`酸劑相對(duì)于第三中間產(chǎn)物使用比例是縛酸劑/第三中間產(chǎn)物摩爾比為0.2～1：1；優(yōu)選為0.3～0.5：1。
上述步驟(c)具體為：將第四中間產(chǎn)物、化合物i溶于溶劑，并通入保護(hù)性氣體，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，后依次用氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液、重溶、分離，獲得最終異魯米諾衍生物；在一些具體實(shí)施例中，反應(yīng)1～3小時(shí)后及用氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液前，還包括判斷反應(yīng)是否有沉淀，如有沉淀，離心去掉沉淀取上清溶液，后用氮?dú)獯蹈伤錾锨迦芤?。進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)交聯(lián)劑為dcc或dic時(shí)，進(jìn)行離心去掉沉淀取上清溶液的步驟。在另一些具體實(shí)施例中，第四中間產(chǎn)物與化合物i的摩爾比為1：1～3，優(yōu)選為1：1.25。
上述步驟(c)中，化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2，或
為保證獲得的異魯米諾衍生物參與液相反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)效率，即抗原或抗體在溶液中的穩(wěn)定性，本制備方法a優(yōu)選為4～12的整數(shù)；b優(yōu)選為0～12的整數(shù)。需要說(shuō)明，為便于后續(xù)描述，在一些具體實(shí)施例中，當(dāng)化合物i中a、b的數(shù)值作出以下變化時(shí)，采用以下相應(yīng)簡(jiǎn)稱(chēng)表示化合物i，其中下述的peg表示1,3-亞乙氧基，me表示亞甲基，c表示羧基，a表示氨基，bs表示兩個(gè)nhs基團(tuán)：
(1)化合物i為hooc-(ch2ch2o)a-(ch2)b-nh2時(shí)，
a＝4，b＝2，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)2；
a＝4，b＝4，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)4；
a＝4，b＝12，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)4(me)12；
a＝12，b＝2，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)12(me)2；
a＝12，b＝4，化合物ii簡(jiǎn)稱(chēng)為ca(peg)12(me)4；
(2)化合物i為
a＝5，b＝2，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)5(me)2；
a＝4，b＝4，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)4(me)4；
a＝4，b＝12，化合物i簡(jiǎn)稱(chēng)為bs(peg)4(me)12。
本制備方法步驟(a)～(c)中，反應(yīng)均在液相中進(jìn)行，所述液相均使用溶劑溶解反應(yīng)物，包括先將n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾與小分子物質(zhì)ii溶于溶劑，后加入交聯(lián)劑反應(yīng)；或者溶解所述第三中間產(chǎn)物；或者將第四中間產(chǎn)物、化合物i溶于溶劑。其中，使用的溶劑均為無(wú)水溶劑，優(yōu)選為非質(zhì)子溶劑，進(jìn)一步優(yōu)選為非質(zhì)子極性溶劑?？紤]abei衍生物可溶性差，所述溶劑更優(yōu)選自二甲基甲酰胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmf)、n-甲基-2-吡咯烷酮(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為nmp)，n,n-二甲基乙酰胺(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmac)、二甲基亞砜(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為dmso)、六甲基磷酰胺、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、吡啶、丙酮中的任一種或兩種以上混合物。該溶劑可以獨(dú)自使用或至少兩種以上混合使用，優(yōu)選為獨(dú)自使用。
本制備方法步驟(a)～(c)中。在反應(yīng)后和獲得相應(yīng)產(chǎn)物前，都還包括后處理步驟，所述后處理步驟至少包括干燥、分離、離心、重溶、洗滌步驟中的任一種，所述各步驟的操作順序和次數(shù)以具體情況而定。優(yōu)選地：步驟(a)中，反應(yīng)后依次進(jìn)行采用氮?dú)獯蹈伤龅谌磻?yīng)產(chǎn)物，后重溶、分離，獲得所述第三中間產(chǎn)物；步驟(b)中，在避光條件下反應(yīng)后，氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液、分離，獲得所述第四中間產(chǎn)物。在一些具體實(shí)施例中，重溶可以進(jìn)行單次或多次，采用的溶劑優(yōu)選為甲酸乙酯、乙酸乙酯等酯類(lèi)溶劑，溶劑可以是獨(dú)自使用或至少兩種以上混合使用，優(yōu)選為獨(dú)自使用。分離的步驟應(yīng)以具體情況而定，例如可以是硅膠柱分離或采用離心步驟或液相色譜等，也可以分多次進(jìn)行，但本制備方法的分離優(yōu)選為步驟簡(jiǎn)化且成本可控的硅膠柱分離。為進(jìn)一步純化、去除反應(yīng)的副產(chǎn)物，本發(fā)明也可包括對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行旋蒸、萃取、洗滌、干燥等步驟，該部分與上述第一種制備方法的限定相同，在此不加以贅述。
本制備方法步驟(a)～(c)中，為避免氧氣、防止部分反應(yīng)物氧化，在反應(yīng)中均通入優(yōu)選自氬氣、氖氣或氮?dú)獾乃霰Ｗo(hù)性氣體。另外，考慮到異魯米諾衍生物見(jiàn)光易分解，因此本制備方法的所有步驟都優(yōu)選在避光條件下進(jìn)行。
本制備方法獲得的異魯米諾衍生物在-4～-40℃下進(jìn)行保存；為保證異魯米諾衍生物的穩(wěn)定性，優(yōu)選地，異魯米諾衍生物在-4～-20℃下進(jìn)行保存。
本制備方法直接通過(guò)氨基和羧基縮合，后脫去保護(hù)基團(tuán)，再與化合物i反應(yīng)擴(kuò)鏈，一方面成倍添加發(fā)光單元，增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度；另一方面增長(zhǎng)第一中間產(chǎn)物的線性結(jié)構(gòu)，不僅降低該衍生物參與反應(yīng)時(shí)的空間效應(yīng)，且保證異魯米諾衍生物標(biāo)記的抗原或抗體的穩(wěn)定性，以及在nhs和dcc的協(xié)同作用下，獲得增強(qiáng)型abei衍生物。該制備方法不僅簡(jiǎn)易可行，且獲得的異魯米諾衍生物增強(qiáng)了現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限；同時(shí)，降低發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響。
本發(fā)明提供一種化學(xué)發(fā)光底液，其至少包括本發(fā)明的異魯米諾衍生物或者由本發(fā)明的兩種獨(dú)立的異魯米諾衍生物的制備方法制備得到的異魯米諾衍生物，還可包括輔助性的成分，包括但不限于本領(lǐng)域人員公知的發(fā)光增強(qiáng)劑。該化學(xué)發(fā)光底液與酶配合實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光，所述酶包括但不限于堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶。所述化學(xué)發(fā)光底液可以包括在試劑盒中也可單獨(dú)放置并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。
本發(fā)明提供一種免疫診斷試劑，其包括本發(fā)明的異魯米諾衍生物或者由本發(fā)明的兩種獨(dú)立的異魯米諾衍生物的制備方法制備得到的異魯米諾衍生物。在本文中已證實(shí)，上述異魯米諾衍生物能增強(qiáng)現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，同時(shí)降低發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響。
本發(fā)明的診斷試劑還包括一種或多種檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體，其中檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體可以但不需要一定被上述異魯米諾衍生物標(biāo)記?？梢岳斫?，其中標(biāo)記可以是直接標(biāo)記或間接標(biāo)記，間接標(biāo)記的方式包括但不限于通過(guò)異硫氰酸熒光素(fitc)與抗fitc抗體體系或通過(guò)鏈霉親和素(sa)與生物素(biotin)體系與檢測(cè)抗原或抗體連接進(jìn)行標(biāo)記。所述抗fitc抗體優(yōu)選為羊抗fitc多克隆抗體。為降低非特異性吸附，且提高測(cè)試靈敏度，本發(fā)明優(yōu)選為直接標(biāo)記，也就是異魯米諾衍生物直接標(biāo)記檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體。其中，標(biāo)記方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不加以限定。如上所述，被本發(fā)明的異魯米諾衍生物標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體在溶液中不會(huì)沉淀，性質(zhì)穩(wěn)定。
優(yōu)選地，本發(fā)明的異魯米諾衍生物可標(biāo)記檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體，底物除了至少存在堿性溶液和h2o2以外，還可包括微過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、乳過(guò)氧化物酶、次氯血紅素、氯化血紅素、次氯酸鹽、cocl2、過(guò)硫酸鹽、過(guò)氧化鉀、高碘酸鈉、k3fe(cn)6、黃嘌呤氧化酶、次黃嘌呤氧化酶、叔丁醇鉀中的至少一種，進(jìn)一步優(yōu)選為次氯血紅素或者k3fe(cn)6。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種化學(xué)發(fā)光試劑盒，其包含含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體的診斷試劑。優(yōu)選地，試劑盒還包括固體支持物，例如微粒、珠子、試管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、濾紙或芯片。優(yōu)選為具有超順磁性和高含量表面功能基團(tuán)的納米磁性微球，且粒徑大小為0.1-5μm，進(jìn)一步優(yōu)選為1-3μm。表面功能基團(tuán)包括但不限于羧基、氨基、羥基等活性基團(tuán)，但為避免磁性微球表面基團(tuán)自身發(fā)生交聯(lián)，基團(tuán)不能為巰基等基團(tuán)?？梢岳斫?，試劑盒還可以任選地包括捕獲抗原或捕獲抗體，其中捕獲抗原或捕獲抗體可與微粒連接，其中連接可以是直接連接或間接連接，間接連接的方式包括但不限于通過(guò)異硫氰酸熒光素(fitc)與抗fitc抗體體系或通過(guò)鏈霉親和素(sa)與生物素(biotin)體系與捕獲抗原或捕獲抗體連接。所述抗fitc抗體優(yōu)選為羊抗fitc多克隆抗體。為降低非特異性吸附，且提高測(cè)試靈敏度，本發(fā)明優(yōu)選為直接標(biāo)記，也就是異魯米諾衍生物直接標(biāo)記檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體。其中，標(biāo)記方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不加以限定。所述試劑盒包含的任選的捕獲抗原或捕獲抗體用以與試驗(yàn)樣本中的待測(cè)抗原或抗體接觸，在接觸之前，任選的捕獲抗原或捕獲抗體先與固相支持物結(jié)合。
任選地，所述試劑盒包含執(zhí)行測(cè)定必須的所有成分，即試劑、標(biāo)準(zhǔn)物、緩沖液、底物、稀釋液和待測(cè)抗體或待測(cè)抗原的免疫診斷試劑說(shuō)明書(shū)等。所述試劑盒可以另外包括一種或多種對(duì)照物。用于分離和/或處理試驗(yàn)樣品的其它組分(諸如緩沖液、稀釋液、預(yù)處理劑)也可以包括在試劑盒中。所述預(yù)處理劑、稀釋液、緩沖液可以是一種或多種溶劑。試劑盒的一種或多種組分可以被低壓凍干，且試劑盒的一種或多種組分可以是液體或固體。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，其包含含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體的試劑盒和半自動(dòng)或全自動(dòng)免疫分析儀。優(yōu)選為全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀，尤其是采用深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀系列。所述分析儀包含執(zhí)行測(cè)定必須的所有模塊，即反應(yīng)杯加載模塊、加樣模塊、試劑倉(cāng)、樣品倉(cāng)、溫育模塊、清洗站、測(cè)量室、數(shù)據(jù)處理模塊、控制系統(tǒng)等。各模塊的結(jié)構(gòu)及其相互位置關(guān)系為本領(lǐng)域的公知技術(shù)。
本發(fā)明還提供了用于確定含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體的試劑盒中待測(cè)抗原或待測(cè)抗體的存在、量或濃度的方法。本領(lǐng)域已知的任意合適的測(cè)定可以用在這樣的方法中，只要這樣的測(cè)定使用本發(fā)明的異魯米諾衍生物。例子包括但不限于免疫測(cè)定，諸如夾心免疫測(cè)定或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)性抑制免疫測(cè)定等。通常，以1-步或2-步形式進(jìn)行免疫測(cè)定，但在特定測(cè)定中，還可以包括特殊2-步形式進(jìn)免疫測(cè)定，例如在1-步中就形成夾心復(fù)合物，后在2-步中再加入標(biāo)記物(例如采用本發(fā)明的異魯米諾衍生物)標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體。優(yōu)選直接化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定，尤其是采用深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀系列的免疫測(cè)定。
本發(fā)明再提供一種含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物，或者含有由本發(fā)明提供的兩種制備方法分別制備得到的異魯米諾衍生物，或者含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物的免疫診斷試劑，或者包含含有本發(fā)明的異魯米諾衍生物標(biāo)記的檢測(cè)抗原或檢測(cè)抗體的診斷試劑的試劑盒，或者包含本發(fā)明試劑盒和自動(dòng)化免疫分析儀的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)在化學(xué)發(fā)光免疫定量分析中的應(yīng)用。尤其是用于異魯米諾衍生物對(duì)人血清中各種激素、腫瘤標(biāo)志物、傳染病、心血管及心肌標(biāo)志物中的至少一種進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫定量的測(cè)定。
任選地，所述激素為：
1)甲狀腺功能系列：其中，用于檢測(cè)甲狀腺功能的激素為促甲狀腺素、血清甲狀腺素、血清三碘甲狀腺原氨酸、血清游離四碘甲狀腺原氨酸、血清游離三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺球蛋白、甲狀腺球蛋白抗體、甲狀腺微粒體抗體、促甲狀腺激素受體抗體、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體、血清反三碘甲狀腺原氨酸；
2)性腺激素：其中，所述性腺激素為卵泡刺激素、黃體生成素、人絨毛膜促性腺激素、催乳素、雌二醇、游離雌三醇、孕酮、睪酮、游離睪酮、抗繆勒氏管激素、17羥基孕酮；
3)糖代謝系列：其中，所述糖代謝系列為c肽、胰島素、抗人胰島素抗體、胰島素原、谷氨酸脫羧酶抗體、抗胰島細(xì)胞抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白質(zhì)抗體。
任選地，所述腫瘤標(biāo)志物為血清甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異性抗原、糖類(lèi)抗原50、糖類(lèi)抗原125、糖類(lèi)抗原153、糖類(lèi)抗原199、細(xì)胞角蛋白十九片段、糖類(lèi)抗原242、糖類(lèi)抗原724、sangtec-100蛋白質(zhì)、胃蛋白酶原i、胃蛋白酶原ⅱ、胃泌素17、幽門(mén)螺旋桿菌。
任選地，所述用于檢測(cè)傳染病的系列為甲型肝炎病毒總抗體、甲型肝炎病毒總抗體igm抗體、乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒表面抗體、乙肝病毒e抗原、乙肝病毒e抗體、乙肝病毒核心抗體、丙型肝炎病毒抗體、人類(lèi)免疫缺陷病毒p24抗原、梅毒螺旋體抗體、人類(lèi)免疫缺陷病毒、人t淋巴細(xì)胞病毒1型抗體、人t淋巴細(xì)胞病毒2型抗體、克氏錐蟲(chóng)。
任選地，所述用于檢測(cè)心血管及心肌疾病的標(biāo)志物為肌鈣蛋白i、腦自然肽n端前體蛋白、d-二聚體、醛固酮、血管緊張素i、血管緊張素ii、腎素、人血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2。
本發(fā)明的異魯米諾衍生物通過(guò)插入有限長(zhǎng)度的間隔臂，且通過(guò)優(yōu)化基團(tuán)和成倍添加發(fā)光單元，不僅降低現(xiàn)有abei發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響，提高抗原和抗體的結(jié)合率；且保證異魯米諾衍生物參與反應(yīng)時(shí)的效率與穩(wěn)定性，更顯著增強(qiáng)現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限。并且，本發(fā)明提供的兩種異魯米諾衍生物的制備方法是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上大力優(yōu)化反應(yīng)體系，且該制備方法簡(jiǎn)易可行。此外，本發(fā)明提供的免疫診斷試劑能構(gòu)成穩(wěn)定性好、檢測(cè)范圍寬、靈敏度高的化學(xué)發(fā)光試劑盒，可應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)對(duì)人血清中各種激素、腫瘤標(biāo)志物、傳染病、心血管及心肌標(biāo)志物中的至少一種進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫定量的快速測(cè)定。
具體實(shí)施方式
下面將通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但應(yīng)理解，本發(fā)明的范圍并不限于此。
以下實(shí)施例采用深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司生產(chǎn)的maglumi2000plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。
乙肝病毒表面抗原(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為hbsag)，來(lái)源：美國(guó)meridian公司。
抗hbsag單克隆抗體1，來(lái)源：美國(guó)rabiosources公司。
抗hbsag多克隆抗體2，來(lái)源：美國(guó)rabiosources公司。
反三碘甲狀腺原氨酸抗原，來(lái)源：從sigma公司采購(gòu)。
抗反三碘甲狀腺原氨酸抗體，來(lái)源：從biogenesis公司采購(gòu)。
17α-羥孕酮抗體來(lái)源：購(gòu)自calbioreagents公司。
17α-羥孕酮抗原來(lái)源：購(gòu)自sigma公司。
抗胃泌素-17抗體來(lái)源：兩株抗體(第一抗胃泌素-17抗體和第二抗胃泌素-17抗體)均購(gòu)自芬蘭biohit公司。
血管緊張素i(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為aⅰ)抗原：購(gòu)于sigma公司。
抗aⅰ抗體：購(gòu)于biogenesis公司。
磁性微球來(lái)源：深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司生產(chǎn)。
maglumi2000化學(xué)發(fā)光分析儀，來(lái)源：深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。
n-(4-氨丁基)-n-乙基異魯米諾(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為abei)，來(lái)源：深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)股份有限公司生產(chǎn)。
實(shí)施例1
異魯米諾衍生物的制備
1)合成abei環(huán)內(nèi)酯；
取500mgabei和200mg丁二酸酐，溶于30ml無(wú)水dmso溶劑，通入氬氣保護(hù)，50℃水浴攪拌反應(yīng)30min，轉(zhuǎn)移到室溫避光繼續(xù)反應(yīng)120min，加入400mgedc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，結(jié)束反應(yīng)。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱分離得到abei環(huán)內(nèi)酯。
2)第一中間產(chǎn)物的制備
將步驟1)中獲得的100mgabei環(huán)內(nèi)酯，34mg3-(n,n-二胺丙基氨基)丙酸，溶于5ml無(wú)水dmso，在氬氣保護(hù)下，37℃避光反應(yīng)4h，室溫靜止過(guò)夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥得有機(jī)相，低溫(<30℃)旋蒸。硅膠柱層析分離得第一中間產(chǎn)物。
3)第二中間產(chǎn)物的制備
取步驟2)中純化得到的第一中間產(chǎn)物100mg，加入25.2mgnhs，45.1mgdcc，置于5ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h。離心去掉沉淀并取上清溶液，后加入92.9mgca(peg)4(me)2，37℃水浴攪拌避光反應(yīng)2h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于甲醇，硅膠柱層析分離得到第二中間產(chǎn)物。
4)終產(chǎn)物的制備
取10mg步驟3)中的第二中間產(chǎn)物，1.2mgnhs，2mgdcc，溶于1ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)下室溫避光反應(yīng)2h，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例2
異魯米諾衍生物的制備
1)合成abei環(huán)內(nèi)酯；
取500mgabei和290mg己二酸酐，溶于30ml無(wú)水dmf溶劑，通入氬氣保護(hù)，40℃水浴攪拌反應(yīng)50min，轉(zhuǎn)移到室溫避光繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，加入440mgdcc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，結(jié)束反應(yīng)。加入甲酸乙酯萃取，超純水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱分離得到abei環(huán)內(nèi)酯。
2)第一中間產(chǎn)物的制備
將步驟1)中獲得的100mgabei環(huán)內(nèi)酯，21mg2,4-二氨基戊酸，溶于5ml無(wú)水dmf，在氬氣保護(hù)下，37℃避光反應(yīng)3h，室溫靜止過(guò)夜。加入大量甲酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無(wú)水硫酸鎂干燥得有機(jī)相，低溫(<30℃)旋蒸。硅膠柱層析分離得第一中間產(chǎn)物。
3)第二中間產(chǎn)物的制備
取步驟2)中純化得到的第一中間產(chǎn)物100mg，加入15.3mgnhs，25.8mgdcc，置于5ml無(wú)水dmso，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h，離心取上清液，加入35.2mgca(peg)4(me)4，37℃水浴攪拌避光反應(yīng)2h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于甲醇，硅膠柱層析分離得到第二中間產(chǎn)物。
4)終產(chǎn)物的制備
取10mg步驟3)中的第二中間產(chǎn)物，1.2mgnhs，2mgdcc，溶于1ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)下室溫避光反應(yīng)2h，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例3
異魯米諾衍生物的制備
1)合成abei環(huán)內(nèi)酯；
取500mgabei和270mg戊二酸酐，溶于30ml無(wú)水dmac溶劑，通入氬氣保護(hù)，60℃水浴攪拌反應(yīng)20min，轉(zhuǎn)移到室溫避光繼續(xù)反應(yīng)60min，加入450mgedc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，結(jié)束反應(yīng)。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱分離得到abei環(huán)內(nèi)酯。
2)第一中間產(chǎn)物的制備
將步驟1)中獲得的100mgabei環(huán)內(nèi)酯，25mg3,5-二氨基戊酸，溶于5ml無(wú)水dmac，在氬氣保護(hù)下，37℃避光反應(yīng)4h，室溫靜止過(guò)夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥得有機(jī)相，低溫(<30℃)旋蒸。硅膠柱層析分離得第一中間產(chǎn)物。
3)第二中間產(chǎn)物的制備
取步驟2)中純化得到的第一中間產(chǎn)物100mg，加入16mgnhs，28mgedc，置于5ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h，加入60mgca(peg)4(me)12，37℃水浴攪拌避光反應(yīng)2h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于甲醇，硅膠柱層析分離得到第二中間產(chǎn)物。
4)終產(chǎn)物的制備
取10mg步驟3)中的第二中間產(chǎn)物，1.15mgnhs，1.91mgedc，溶于1ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)下室溫避光反應(yīng)2h，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例4
異魯米諾衍生物的制備
1)合成abei環(huán)內(nèi)酯；
取500mgabei和250mg丁二酸酐，溶于30ml無(wú)水nmp溶劑，通入氬氣保護(hù)，50℃水浴攪拌反應(yīng)30min，轉(zhuǎn)移到室溫避光繼續(xù)反應(yīng)120min，加入450mgdcc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，結(jié)束反應(yīng)。加入乙酸乙酯萃取，超純水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱分離得到abei環(huán)內(nèi)酯。
2)第一中間產(chǎn)物的制備
將步驟1)中獲得的100mgabei環(huán)內(nèi)酯，22.5mg4-氨基-3-氨甲基丁酸，溶于5ml無(wú)水無(wú)水nmp，在氬氣保護(hù)下，37℃避光反應(yīng)4h，室溫靜止過(guò)夜。加入大量乙酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥得有機(jī)相，低溫(<30℃)旋蒸。硅膠柱層析分離得第一中間產(chǎn)物。
3)第二中間產(chǎn)物的制備
取步驟2)中純化得到的第一中間產(chǎn)物100mg，加入18.4mgnhs，31.5mgdcc，置于5ml無(wú)水nmp，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h，離心取上清液，加入66.4mgca(peg)12(me)2，37℃水浴攪拌避光反應(yīng)2h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于甲醇，硅膠柱層析分離得到第二中間產(chǎn)物。
4)終產(chǎn)物的制備
取10mg步驟3)中的第二中間產(chǎn)物，1.21mgnhs，2.04mgdcc，溶于1ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)下室溫避光反應(yīng)2h，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例5
異魯米諾衍生物的制備
1)合成abei環(huán)內(nèi)酯；
取500mgabei和330mg庚二酸酐，溶于30ml無(wú)水dmso溶劑，通入氬氣保護(hù)，50℃水浴攪拌反應(yīng)30min，轉(zhuǎn)移到室溫避光繼續(xù)反應(yīng)120min，加入400mgdcc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，結(jié)束反應(yīng)。加入甲酸乙酯萃取，超純水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱分離得到abei環(huán)內(nèi)酯。
2)第一中間產(chǎn)物的制備
將步驟1)中獲得的100mgabei環(huán)內(nèi)酯，29.4mg2-(n,n-二胺丙基氨基)乙酸，溶于5ml無(wú)水dmso，在氬氣保護(hù)下，37℃避光反應(yīng)4h，室溫靜止過(guò)夜。加入大量甲酸乙酯萃取，依次用稀鹽酸，飽和氯化鈉和超純水洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥得有機(jī)相，低溫(<30℃)旋蒸。硅膠柱層析分離得第一中間產(chǎn)物。
3)第二中間產(chǎn)物的制備
取步驟2)中純化得到的第一中間產(chǎn)物100mg，加入16.8mgnhs，28.4mgdcc，置于5ml無(wú)水dmso，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h，離心取上清液，加入69.2mgca(peg)12(me)4，37℃水浴攪拌避光反應(yīng)2h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于乙醇，硅膠柱層析分離得到第二中間產(chǎn)物。
4)終產(chǎn)物的制備
取10mg步驟3)中的第二中間產(chǎn)物，1.15mgnhs，1.94mgdcc，溶于1ml無(wú)水dmf，氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)2h，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例6
異魯米諾衍生物的制備
1)第三中間產(chǎn)物的制備
取100mgabei和61.40mg3-叔丁氧羰基氨基戊二酸，溶于5ml無(wú)水dmf，加入45.63mgdcc，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光攪拌2h，離心取上清液。氮?dú)獯蹈缮锨逡海厝苡诩姿嵋阴?，硅膠柱分離得第三中間產(chǎn)物。
2)第四中間產(chǎn)物的制備
取步驟1)中的第三中間產(chǎn)物50mg溶于20ml無(wú)水dmf，加入3.7ul三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)1h。氮?dú)獯蹈?，硅膠柱分離得第四中間產(chǎn)物。3)終產(chǎn)物的制備
取步驟2)中的第四中間產(chǎn)物100mg，bs(peg)5(me)295.07mg，溶于5ml無(wú)水dmf中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢璞芄夥磻?yīng)2h，離心取上清液，氮?dú)獯蹈缮锨逡海厝苡谝宜嵋阴?，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例7
異魯米諾衍生物的制備
1)第三中間產(chǎn)物的制備
取100mgabei和93.2mgn-芴甲氧羰基氨丙基-n-羧甲基氨基乙酸，溶于5ml無(wú)水dmso，加入44.93mgedc，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光攪拌1h。氮?dú)獯蹈?，重溶于乙酸乙酯，硅膠柱分離得第三中間產(chǎn)物。
2)第四中間產(chǎn)物的制備
取步驟1)中的第三中間產(chǎn)物50mg溶于20ml無(wú)水dmso，加入2.2ul吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)1h。氮?dú)獯蹈桑枘z柱分離得第四中間產(chǎn)物。
3)終產(chǎn)物的制備
取步驟2)中的第四中間產(chǎn)物100mg，bs(peg)4(me)4156.21mg，溶于5ml無(wú)水dmso中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢璞芄?h。氮?dú)獯蹈煞磻?yīng)液，重溶于甲酸乙酯，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)下式7-3)，-20℃保存。
實(shí)施例8
異魯米諾衍生物的制備
1)第三中間產(chǎn)物的制備
取100mgabei和65.2mgn-叔丁氧羰基乙基-n-羧甲基氨基乙酸，溶于5ml無(wú)水dmac，加入43.88mgdcc，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，置于室溫避光攪拌30分鐘，離心取上清液，氮?dú)獯蹈缮锨逡?，重溶于乙酸乙酯，硅膠柱分離得第三中間產(chǎn)物。
2)第四中間產(chǎn)物的制備
取步驟1)中的第三中間產(chǎn)物50mg溶于20ml無(wú)水dmac，加入7.3ul三丁胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)1h。氮?dú)獯蹈?，硅膠柱分離得第四中間產(chǎn)物。3)終產(chǎn)物的制備
取步驟2)中的第四中間產(chǎn)物100mg，bs(peg)4(me)12122.49mg，溶于5ml無(wú)水dmac中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢?h，離心取上清液，氮?dú)獯蹈缮锨逡?，重溶于乙酸乙酯，得到終產(chǎn)物異魯米諾衍生物，-20℃保存。
實(shí)施例9乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1中的標(biāo)記物替換為本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物。具體區(qū)別如下，以下為本實(shí)施例標(biāo)記物體系的制備步驟：
標(biāo)記物體系的制備。
1)透析液的配制：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩沖液。
2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體2用透析液調(diào)整到1ml，放入透析液中，室溫?cái)嚢柰肝?小時(shí)將透析好的溶液加入本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物404μg，37℃反應(yīng)2小時(shí)。
3)以g-25凝膠柱純化上述反應(yīng)得到的標(biāo)記異魯米諾衍生物的抗hbsag多克隆抗體2。
4)在純化后的標(biāo)記異魯米諾衍生物的抗hbsag多克隆抗體2溶液中加入等體積的5g/ml的bsa保護(hù)液，即得。
實(shí)施例10乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例2制備的異魯米諾衍生物403μg”。
實(shí)施例11乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例3制備的異魯米諾衍生物440μg”。
實(shí)施例12乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例4制備的異魯米諾衍生物410μg”。
實(shí)施例13乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例5制備的異魯米諾衍生物500μg”。
實(shí)施例14乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例6制備的異魯米諾衍生物321μg”。
實(shí)施例15乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例7制備的異魯米諾衍生物427.8μg”。
實(shí)施例16乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104698172b實(shí)施例1的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例8制備的異魯米諾衍生物380.8μg”。
實(shí)施例17rt3的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104730257a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104730257a實(shí)施例1中的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物404μg”。
實(shí)施例1817α-羥孕酮的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn105651990a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的17α-羥孕酮的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn105651990a實(shí)施例1中制備3的“加入300μgabei活化酯”替換為“加入本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物404μg”。
實(shí)施例19胃泌素-17的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104614536a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的胃泌素-17抗原的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104614536a實(shí)施例1中的“300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物404μg”。
實(shí)施例20血管緊張素i的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104634965a中實(shí)施例1的試劑盒和實(shí)施例9的檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的血管緊張素i的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104634965a實(shí)施例1中的“300μgabei活化酯”替換為“404μg本實(shí)施例1制備的異魯米諾衍生物”。
實(shí)施例21rt3的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104730257a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104730257a實(shí)施例1中的“加入300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例6制備的異魯米諾衍生物321μg”。
實(shí)施例2217α-羥孕酮的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn105651990a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的17α-羥孕酮的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn105651990a實(shí)施例1中制備3的“加入300μgabei活化酯”替換為“加入本實(shí)施例6制備的異魯米諾衍生物321μg”。
實(shí)施例23胃泌素-17的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104614536a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的胃泌素-17抗原的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104614536a實(shí)施例1中的“300μgabei-半琥珀酰胺酸n-羥基琥珀酰亞胺酯”替換為“加入本實(shí)施例6制備的異魯米諾衍生物321μg”。
實(shí)施例24血管緊張素i的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104634965a中實(shí)施例1的試劑盒和實(shí)施例9的檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的血管緊張素i的含量，區(qū)別在于：將該專(zhuān)利cn104634965a實(shí)施例1中的“300μgabei活化酯”替換為“321μg本實(shí)施例6制備的異魯米諾衍生物”。
對(duì)比例1乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量，區(qū)別在于：標(biāo)記物體系不同，具體如下：
標(biāo)記物體系的制備：1)透析液的配制：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩沖液。
2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體用透析液調(diào)整到1ml，放入透析液中，室溫?cái)嚢柰肝?小時(shí)將透析好的溶液加入169μgabei，37℃反應(yīng)2小時(shí)。
3)以g-25凝膠柱純化上述反應(yīng)得到的標(biāo)記abei的抗hbsag多克隆抗體。
4)在純化后的標(biāo)記abei的抗hbsag多克隆抗體溶液中加入等體積的的5g/ml的bsa保護(hù)液，即得。
對(duì)比例2乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
與對(duì)比例1基本相同，區(qū)別在于：標(biāo)記物不同，即abei替換為abei-環(huán)內(nèi)酯，具體步驟如下：
1)透析液的配制：在5000ml燒杯中加入na2co314.31g，nahco326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/l的碳酸緩沖液。
2)選用截留量為14000的透析袋，量取合適的尺寸,取1mg抗hbsag多克隆抗體用透析液調(diào)整到1ml，放入透析液中，室溫?cái)嚢柰肝?小時(shí)將透析好的溶液加入226μgabei-環(huán)內(nèi)酯，37℃反應(yīng)2小時(shí)。
3)以g-25凝膠柱純化上述反應(yīng)得到的標(biāo)記abei的抗hbsag多克隆抗體。
4)在純化后的標(biāo)記abei的抗hbsag多克隆抗體溶液中加入等體積的的5g/ml的bsa保護(hù)液，即得。
對(duì)比例3乙肝病毒表面抗原的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104698172b中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的乙肝病毒表面抗原含量。
對(duì)比例4rt3的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104730257a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的反三碘甲狀腺原氨酸含量。
對(duì)比例517α-羥孕酮的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn105651990a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的17α-羥孕酮的含量。
對(duì)比例6胃泌素-17的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104614536a中實(shí)施例1的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的胃泌素-17含量。
對(duì)比例7血管緊張素i的檢測(cè)
按照專(zhuān)利cn104634965a中實(shí)施例1的試劑盒和實(shí)施例9的檢測(cè)方法檢測(cè)樣本中的血管緊張素i的含量。
測(cè)量結(jié)果及分析：
1、靈敏度分析
1)按照實(shí)施例9～16和對(duì)比例1-3中所示的檢測(cè)乙肝病毒表面抗原的試劑盒及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣本包括：采購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所的hbsag定量參考品和定性參考品(批號(hào)：300003-201002)，測(cè)量結(jié)果如下表一～二所示。其中，按照上述試劑盒提供的hbsag標(biāo)準(zhǔn)品的十點(diǎn)曲線(a-j點(diǎn))，其中a點(diǎn)為稀釋液，b點(diǎn)為1iu/ml，c點(diǎn)為3.162iu/ml，j點(diǎn)為10000iu/ml，對(duì)a,b,j點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，rlu:相對(duì)光單位。
2)按照實(shí)施例17、實(shí)施例21和對(duì)比例4中所示的檢測(cè)反三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒和及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如下表三所示。
3)按照實(shí)施例18、實(shí)施例22和對(duì)比例5中所示的檢測(cè)17α-羥孕酮的試劑盒和及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如下表四所示。
4)按照實(shí)施例19、實(shí)施例23和對(duì)比例6中所示的檢測(cè)胃泌素-17的試劑盒和及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如下表五所示。
5)按照實(shí)施例20、實(shí)施例24和對(duì)比例7中所示的檢測(cè)血管緊張素i的試劑盒和及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如下表六所示。
2、加速穩(wěn)定性分析
采用乙肝病毒表面抗原標(biāo)準(zhǔn)品，用購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)scantibody公司的去激素人血清為溶劑配制成濃度為4ng/ml和12ng/ml的兩份樣品，其中，樣本1為低濃度樣品，樣本2為高濃度樣品。為驗(yàn)證試劑的穩(wěn)定性，將本實(shí)施例9、實(shí)施例14、對(duì)比例1～3提供的試劑盒分別置于37℃環(huán)境下，對(duì)樣本1和樣本2連續(xù)監(jiān)測(cè)7天，記錄其rlu值的變化，結(jié)果如表七所示。
表一、乙肝病毒表面抗原十點(diǎn)曲線rlu光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)據(jù)
按照實(shí)施例9～16中所示的檢測(cè)乙肝病毒表面抗原的試劑盒及其檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣本包括：采購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所的hbsag定量參考品和定性參考品(批號(hào)：300003-201002)，測(cè)量結(jié)果如上表所示。
其中，按照上述試劑盒提供的hbsag標(biāo)準(zhǔn)品的十點(diǎn)曲線，其中0點(diǎn)為稀釋液，rlu:相對(duì)光單位。
從上表可以看出采用新方案合成的八種abei衍生物標(biāo)記的抗體，具有更高的靈敏度，其中實(shí)施例12的靈敏度最高，a/j點(diǎn)的比例達(dá)到了1514，從abc三點(diǎn)可以看出實(shí)施例9-16在低點(diǎn)的靈敏度均優(yōu)于對(duì)比例(1-3)，同時(shí)相對(duì)于對(duì)比例2和對(duì)比例3,本發(fā)明abei衍生物的用量(物質(zhì)的量)比前兩者的用量少一半左右，說(shuō)明對(duì)比例2和對(duì)比例3過(guò)多的標(biāo)記也會(huì)對(duì)抗體的活性產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致靈敏度的降低。
表二、國(guó)家參考品測(cè)定結(jié)果
從上述結(jié)果可以看出，在5.9-100iu/ml濃度范圍內(nèi)，對(duì)比例2和對(duì)比例3與實(shí)施本發(fā)明實(shí)施例9-16比較，并沒(méi)有明顯差異，而對(duì)比例1的測(cè)試結(jié)果遠(yuǎn)偏離國(guó)家參考品的標(biāo)準(zhǔn)濃度，說(shuō)明edc法直接標(biāo)記abei時(shí)，既存在abei偶聯(lián)抗體，也有可能會(huì)導(dǎo)致抗體與抗體之間的偶聯(lián)，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明實(shí)施例9-16和對(duì)比例2、對(duì)比例3均屬于定向與抗體偶聯(lián)，其檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。
表三、rt3十點(diǎn)曲線rlu光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)據(jù)
從上述十點(diǎn)曲線結(jié)果可以看出，在0-10ng/ml濃度下，實(shí)施例17和實(shí)施例21比對(duì)比例4的的曲線范圍更大，其中實(shí)施例17的曲線范圍最大，rlu從692546到32253，有利于測(cè)試精確度，本發(fā)明中實(shí)施例17在低值區(qū)域(0、0.2、0.236)的靈敏度要明顯優(yōu)于對(duì)比例4，這說(shuō)明采用第一制備方法獲得的異魯米諾衍生物親水性更好，且增加一定長(zhǎng)度的手臂能提高檢測(cè)的靈敏度。
表四、17α-oh孕酮十點(diǎn)曲線rlu光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)據(jù)
從上述十點(diǎn)曲線結(jié)果可以看出，在0-20ng/ml濃度下，實(shí)施例18和實(shí)施例22比對(duì)比例5的的曲線范圍更大，其中實(shí)施例18的曲線范圍最大，有利于測(cè)試精確度，本發(fā)明中實(shí)施例18在低值區(qū)域(0、0.25、0.433)的靈敏度要明顯優(yōu)于對(duì)比例5，這說(shuō)明采用第一制備方法獲得的異魯米諾衍生物親水性更好，且增加一定長(zhǎng)度的手臂能提高檢測(cè)的靈敏度。
表五、胃泌素-17十點(diǎn)曲線rlu光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)據(jù)
從上述十點(diǎn)曲線結(jié)果可以看出，在0-500pmol/l濃度下，實(shí)施例19和實(shí)施例29比對(duì)比例6的的曲線范圍更大，其中實(shí)施例19的曲線范圍最大，有利于測(cè)試精確度，本發(fā)明中實(shí)施例19在低值區(qū)域(0、1、2.174)的靈敏度要明顯優(yōu)于對(duì)比例5，這說(shuō)明采用第一制備方法獲得的異魯米諾衍生物來(lái)標(biāo)記抗體，能有效改善胃泌素-17測(cè)試的靈敏度。
表六、血管緊張素i十點(diǎn)曲線rlu光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)據(jù)
從上述十點(diǎn)曲線結(jié)果可以看出，在0-24ng/ml濃度下，實(shí)施例20和實(shí)施例24比對(duì)比例7的曲線范圍大，其中實(shí)施例19的曲線范圍最大，有利于測(cè)試精確度，本發(fā)明中實(shí)施例20在低值區(qū)域(0、1、2.174)的靈敏度要明顯優(yōu)于對(duì)比例7，說(shuō)明采用第一制備方法獲得的異魯米諾衍生物有效改善ai測(cè)試的靈敏度。
表七乙肝病毒表面抗原試劑盒穩(wěn)定性
注：相對(duì)偏差＝(第七天rlu-第一天rlu)/第一天rlu
表七中，實(shí)施例9和實(shí)施例14的相對(duì)偏差均小于10％，說(shuō)明在37℃條件下，試劑相對(duì)穩(wěn)定。而對(duì)比例1的相對(duì)偏差約在34％到37％之間，可知對(duì)比例1的試劑盒對(duì)于溫度已經(jīng)非常敏感；對(duì)比例2的相對(duì)偏差約20％，對(duì)比例3的相對(duì)偏差在23％-26％。說(shuō)明在37℃條件下，對(duì)比例2和對(duì)比例3相對(duì)于實(shí)施例9和實(shí)施例14，試劑較不穩(wěn)定，這對(duì)于對(duì)周?chē)h(huán)境要求非常高的直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(測(cè)量結(jié)果往往達(dá)到納克級(jí)別甚至皮克級(jí)別)而言影響是非常大的。而對(duì)比例1中的試劑對(duì)溫度相當(dāng)敏感，可能是由于在37℃下，對(duì)比例1中抗體穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)很大的偏差。
綜上，上述實(shí)施例1-24結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化異魯米諾衍生物的結(jié)構(gòu)，各實(shí)施例制備獲得的異魯米諾衍生物在標(biāo)記各抗原或抗體后組成的不同試劑盒在用于檢測(cè)時(shí)不僅增強(qiáng)現(xiàn)有魯米諾-過(guò)氧化物體系的發(fā)光強(qiáng)度，提高測(cè)試靈敏度與檢出限，且標(biāo)記的抗原或抗體穩(wěn)定性好。而且還降低現(xiàn)有abei發(fā)光標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原的標(biāo)記量，減少過(guò)量標(biāo)記對(duì)抗體或抗原活性的影響。
雖然本發(fā)明已作了詳細(xì)描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的修改將是顯而易見(jiàn)的。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明記載的各方面、不同具體實(shí)施方式的各部分、和列舉的各種特征可被組合或全部或部分互換。在上述的各個(gè)具體實(shí)施方式中，那些參考另一個(gè)具體實(shí)施方式的實(shí)施方式可適當(dāng)?shù)嘏c其它實(shí)施方式組合，這是將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，前面的描述僅是示例的方式，并不旨在限制本發(fā)明。