專利名稱：一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用電化學(xué)發(fā)光傳感器對赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測，特點(diǎn)在于赭曲霉毒 素A適配體和異魯米諾電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的應(yīng)用、納米金粒子在電化學(xué)發(fā)光過程中放大信 號的作用，以及該檢測方法的高靈敏度及易操作性，屬于電化學(xué)發(fā)光傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素Akchratoxin A，OTA)在自然界分布廣泛，毒性強(qiáng)，對人類和動植物損 害極大。OTA主要存在于谷類、豆類及豆制品、千果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、油料作物、啤 酒、茶葉等中。毒理學(xué)研究表明，赭曲霉毒素A具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，以及致 畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。1993年國際癌癥 研究機(jī)構(gòu)(The International Agency for Research onCancer, IARC)已將 OTA 列為人類 可能致癌物。鑒于OTA毒性強(qiáng)，對人體健康危害大，世界各國紛紛制定出糧食及飼料中OTA 限量標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟規(guī)定谷物原料OTA最大限量5 μ g/kg，谷物加工制品最大限量3 μ g/kg， 嬰幼兒及有特殊醫(yī)療目的食品不超過0. 5 μ g/kg ；我國飼料OTA最大限量100 μ g/kg。目前OTA分析檢測方法主要包括薄層層析法(TLC)、高壓液相色譜-熒光檢測法 (HPLC-FD)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)、高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbentassay，簡稱ELISA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)、膠 體金免疫層析分析法(GICA)和放射免疫法(RIA)等?，F(xiàn)場快速篩檢方法中則以ELISA和 GICA方法應(yīng)用最多，這兩種方法均是基于抗原-抗體親和反應(yīng)，以抗體作為識別分子。但抗 體易受外界條件尤其是溫度的影響，對保藏條件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的靈 活應(yīng)用。此外，抗體制備需要經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，繁瑣費(fèi)時(shí)，制備的抗體成本高，發(fā)展 的方法檢測成本也相應(yīng)偏高。所以有必要發(fā)展一種快速方便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性 強(qiáng)、使用成本低的新型檢測方法。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器則是指由生物材料作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件， 以光強(qiáng)作為特征檢測信號的傳感器。生物傳感器是指各種生物體成分(酶、抗原、抗體、 激素等)或者生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為敏感元件的傳感器。核酸適配 體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)篩選而來的。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、 易修飾、易固定、可反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點(diǎn)，因而核酸適配體為識別分子構(gòu)建的生物傳 感器在蛋白質(zhì)研究、藥物檢測、毒素檢測、醫(yī)學(xué)診斷等方面得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明把赭曲霉毒素A適配體應(yīng)用于電化學(xué)發(fā)光傳感器，并在電極表面修飾上可 以增強(qiáng)光信號的納米金粒子，大大提高了傳感器的靈敏度，該傳感器以金電極為工作電極， 銀電極為參比電極，鉬電極為對電極，以過氧化氫(H2O2)與異魯米諾(ABEI)在堿性條件下 反應(yīng)的光信號為檢測信號，通過對不同濃度赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá) 到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的。該發(fā)明可以用于小麥、谷物，飼料及其制品 中赭曲霉毒素A含量的檢測。
本發(fā)明與CN 1011699277A ( 一種電化學(xué)傳感器對微量赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測的方 法)相比，在適配體傳感器的制作及檢測模式上完全不同，CN 1011699277 A利用電化學(xué)方 法以電流值作為定量信號，而本發(fā)明采用電化學(xué)發(fā)光檢測獲得了更高的靈敏度，檢測限可 低至 0. 007ng/mL。

發(fā)明內(nèi)容
一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法將納米金粒子修飾到裸 金電極表面，對電化學(xué)信號起放大的作用，另外在工作電極表面修飾上巰基化的單鏈DNA， 并通過堿基配對將標(biāo)記有異魯米諾(ABEI)的適配體DNA修飾到電極表面，組裝成適配體電 化學(xué)發(fā)光傳感器。加入過氧化氫(H2O2)，檢測發(fā)光信號，當(dāng)加入目標(biāo)分析物赭曲霉毒素A時(shí)， 適配體DNA與赭曲霉毒素A發(fā)生特異性結(jié)合，使得適配體DNA的空間構(gòu)象發(fā)生變化，不能與 互補(bǔ)單鏈DNA匹配，從而標(biāo)記有異魯米諾(ABEI)的適配體DNA從電極表面脫落，導(dǎo)致電化 學(xué)發(fā)光信號減弱。以此現(xiàn)象對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對含赭 曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的；步驟為(1)裸金電極的拋光處理將裸金電極依次用111111、0.311111、0.0511111的氧化鋁 粉末進(jìn)行打磨處理；然后置于丙酮水溶液中超聲數(shù)分鐘。將拋光處理好的電極在濃度為 0. 5mol/L H2SO4中，0 1. 5V(標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極)100mV/S進(jìn)行循環(huán)伏安掃描直至得到重現(xiàn)的 循環(huán)伏安圖。然后用含有鐵氰化鉀的PBS溶液，在-0. 2 0. 6V(標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極)100mV/S 下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描表征，直至得到形狀良好的、峰_峰差值小于74mV的循環(huán)伏安圖。(2)裸金電極的修飾將裸金電極置于2mM 1，3-丙二硫醇-乙醇溶液中室溫孵育 20h，巰基單分子層被修飾到電極表面，經(jīng)過乙醇和超純水清洗后，將其置于200 μ L納米金 溶液中4°C反應(yīng)10h，即得納米金修飾的電極，室溫吹干后備用。(3)適配體修飾2mg ABEI (購于Sigma，USA)溶于鹽酸，然后加入含5%戊二醛的 PBS緩沖液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h后，加入適配體DNA (購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司)4°C振搖反應(yīng)12h，得到ABEI標(biāo)記的適配體DNA。(4)適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備將納米金修飾好的電極置于LOmL濃度為 2. OX 10_6mol/L單鏈DNA中反應(yīng)4h，用0. lmol/L PBS緩沖液清洗電極，再將其置于1. OmL ABEI標(biāo)記的適配體DNA 37°C雜交反應(yīng)30min，清洗電極。即制備得該電化學(xué)發(fā)光傳感器。(5)對制備所得的電化學(xué)發(fā)光傳感器分別施加循環(huán)伏安和脈沖電壓，由于ABEI在 脈沖電壓下氧化程度更高，所以檢測時(shí)脈沖電壓獲得的電化學(xué)工作信號強(qiáng)于循環(huán)伏安法， 而且脈沖電壓下得到的電化學(xué)發(fā)光信號也比循環(huán)伏安法得到的穩(wěn)定，因次本發(fā)明選用脈沖 電壓。且在脈沖電壓下，利用納米金修飾的電極進(jìn)行檢測得到的電化學(xué)發(fā)光信號比單純使 用裸金電極增大了 10倍。(6)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將制備好的電化學(xué)發(fā)光傳 感器置于赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度依次為0ng/mL、0. 02ng/mL、 0. 04ng/mL、0. 06ng/mL、0. 08ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 8ng/mL、Ing/mL、1. 5ng/mL、2ng/ mL、3ng/mL，選用工作電壓為0. 8V，工作緩沖體系為Na2CO3-NaHCO3 (pHll. 0)，每個(gè)濃度分別 反應(yīng)30min，隨后加入的H2O2濃度為1. 5mM，根據(jù)相對電化學(xué)發(fā)光值與對應(yīng)的赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立際準(zhǔn)曲線。
(7)對赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行檢測將制備好的電化學(xué)發(fā)光傳感器置于赭曲霉 毒素A待測樣品溶液中反應(yīng)，選用工作電壓為0. 8V,工作緩沖體系為Na2CO3-NaHCO3(pH 11.0)，每個(gè)樣品反應(yīng)30min，隨后加入的H2O2濃度為1. 5mM,根據(jù)相對電化學(xué)發(fā)光值與從標(biāo) 準(zhǔn)曲線中求得對應(yīng)的赭曲霉毒素A的濃度。所述的納米金粒子粒徑為IOnm左右。所述的適配體DNA是對赭曲霉毒素A有特異性結(jié)合能力的單鏈DNA。所述的標(biāo)記ABEI的氨基適配體DNA，是通過戊二醛反應(yīng)，將ABEI與適配體上修飾 的氨基通過偶聯(lián)作用反應(yīng)得到的。所述的單鏈DNA是與適配體DNA的一端互補(bǔ)配對、且用巰基修飾的DNA，修飾到電 極上的納米金粒子與巰基修飾的DNA通過金巰鍵相結(jié)合。所述的建立赭曲霉毒素A檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線是指適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器與不同 濃度的赭曲霉毒素A進(jìn)行孵育后，再與過氧化氫在施加脈沖電壓的條件下進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，根據(jù)不同濃度下得到的相對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度做的標(biāo)準(zhǔn)曲線。有益效果(1)本發(fā)明采用異魯米諾(ABEI)標(biāo)記的適配體做傳感器，提高了檢測的靈敏度和 穩(wěn)定性。(2)本發(fā)明把納米金粒子修飾到電極表面，放大了電化學(xué)發(fā)光信號，進(jìn)一步提高了 其靈敏度。(3)本發(fā)明采用電化學(xué)發(fā)光作為檢測手段，靈敏度高，方便快捷。


圖1 基于適配體的電化學(xué)發(fā)光傳感器對赭曲霉毒素A定量檢測的實(shí)驗(yàn)原理圖。圖2 對赭曲霉毒素A定量檢測的電化學(xué)發(fā)光工作信號圖。A.循環(huán)伏安圖譜；B.脈 沖電壓圖譜，其中(a)圖為金電極表面修飾了納米金粒子得到的信號圖；(b)圖為裸金電極 得到的信號圖。圖3 赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4 本發(fā)明和國標(biāo)方法檢測同樣的實(shí)際樣品得到的相關(guān)性曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及小麥實(shí)際樣品檢測將制備好的電化學(xué)發(fā)光傳感器置于赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品溶 液濃度依次為 0ng/mL、0. 02ng/mL、0. 04ng/mL、0. 06ng/mL、0. 08ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/ mL、0. 8ng/mL、lng/mL、l. 5ng/mL、2ng/mL、3ng/mL，選用工作電壓為 0. 8V，工作緩沖體系為 Na2CO3-NaHCO3 (pH 11.0)，每個(gè)濃度分別反應(yīng)30min，隨后加入的H2O2濃度為1. 5mM,根據(jù)相 對電化學(xué)發(fā)光值與對應(yīng)的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品預(yù)處理小麥高速粉碎過篩，稱取20g于IOOmL燒瓶中，加入5g NaCl，80%乙 醇水溶液，充分混勻后置于均質(zhì)器中高速攪拌提取2min，靜止片刻，過濾，取IOmL濾液置于 50mL燒瓶中，再次在均質(zhì)器中高速攪拌提取2min，靜止后用超細(xì)玻璃纖維過濾紙過濾，直 至濾液澄清，收集濾液備用。
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從本地六家農(nóng)貿(mào)市場購買20種不同類別的小麥，利用本發(fā)明方法和國標(biāo)方法分別測定其中赭曲霉毒素A的含量，結(jié)果見表一，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果P<o．000l，說明該發(fā)明方法快速可靠，靈敏度高，穩(wěn)定性好，適合用于小麥實(shí)際樣品中赭曲霉毒素A的檢測。
表一小麥實(shí)際樣品檢測，本發(fā)明方法與國標(biāo)方法對比
權(quán)利要求
一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于對裸金電極拋光處理，然后將納米金粒子修飾在裸金電極上，接著將單鏈DNA修飾到電極上，最后通過堿基配對將標(biāo)記有異魯米諾(ABEI)的適配體修飾到電極表面，裝配成為基于適配體的電化學(xué)發(fā)光傳感器，對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于裸金電極的拋光處理將裸金電極依次用1 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化鋁粉末進(jìn)行 打磨處理；然后置于丙酮水溶液中超聲數(shù)分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于裸金電極上修飾上納米金粒子將裸金電極置于2mM 1，3-丙二硫醇-乙醇溶液中室 溫孵育20h，巰基單分子層被修飾到電極表面，經(jīng)過乙醇和超純水清洗后，將其置于200μ L 納米金溶液中4V反應(yīng)10h，即得納米金修飾的電極，室溫吹干后備用。
4.如權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，其特 征在于適配體DNA修飾2mg ABEI溶于鹽酸，然后加入含5%戊二醛的PBS緩沖液，室溫?cái)?拌反應(yīng)2h后，加入適配體DNA4°C振搖反應(yīng)12h，得到ABEI標(biāo)記的適配體DNA。
5.一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，利用脈沖電壓為電勢，優(yōu) 化各項(xiàng)工作條件工作電壓為0. 8V，工作緩沖體系為Na2CO3-NaHCO3 (pH 11. 0)，加入的H2O2 濃度為1. 5mM，確保該方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
全文摘要
一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，屬于電化學(xué)發(fā)光傳感器技術(shù)領(lǐng)域，用于小麥、谷物，飼料及其制品中赭曲霉毒素A含量的檢測。本發(fā)明的基礎(chǔ)是適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別和過氧化氫(H2O2)與異魯米諾(ABEI)在堿性條件下的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。將納米金粒子修飾到裸金電極表面，對電化學(xué)發(fā)光信號起放大的作用，再在工作電極表面修飾上單鏈DNA，并通過堿基配對將標(biāo)記有異魯米諾(ABEI)的適配體修飾到電極表面，加入過氧化氫(H2O2)，檢測電發(fā)光信號，相對電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與赭曲霉毒素A濃度成比例，進(jìn)而建立赭曲霉毒素A定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明旨在建立靈敏度高、可操作性強(qiáng)的赭曲霉毒素A定量檢測方法。
文檔編號G01N27/48GK101936940SQ20101027124
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者吳世嘉, 段諾, 混旭, 王周平 申請人:江南大學(xué)