克倫巴胺適配體與檢測克倫巴胺的適配體電化學(xué)生物傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種克倫巴胺適配體以及檢測克倫巴胺的適配體電化學(xué)生物傳感器，以及該傳感器的制備方法與檢測方法。本發(fā)明所述的克倫巴胺適配體為含有GCGTAGCTACTCATAT序列、長度為20-25個堿基的單鏈DNA探針，且3’端修飾了3’-NH2-(CH2)7-。該傳感器提高了檢測克倫巴胺的靈敏性，最低可以檢測出1.0pg/mL的克倫巴胺；大大降低了檢測克倫巴胺的成本，操作簡單方便，可實(shí)現(xiàn)對克倫巴胺的快速檢測。
【專利說明】克倫巴胺適配體與檢測克倫巴胺的適配體電化學(xué)生物傳感 器

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種克倫巴胺適配體以及檢測克倫巴胺的適配體 電化學(xué)生物傳感器，以及該傳感器的制備方法與檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 克倫巴胺（Phenylethanolamine，PHL)，化學(xué)命名為 2-[4_(4_ 硝基苯基）丁 基-2-氨基]-1-(4-甲氧基苯基）乙醇，又名苯乙醇胺A，分子量為344. 17,分子式 C19H24N204，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 一種克倫巴胺適配體，其特征在于，所述適配體為含有GCGTAGCTACTCATAT序列、長 度為20-25個堿基的單鏈DNA探針，即XnGCGTAGCTACTCATATYm，其中，X和Y表示任意核酸 堿基，11和!!1表示整數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫巴胺適配體，其特征在于：所述適配體的3'端進(jìn)行氨基 修飾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫巴胺適配體，其特征在于：所述3'端氨基修飾基團(tuán) 為-NH2 _(CH2)7-。
4. 一種檢測克倫巴胺的適配體電化學(xué)生物傳感器，其特征在于：所述的電化學(xué)生物傳 感器中含有如權(quán)利要求1至3之一所述的適配體。
5. 如權(quán)利要求4所述的適配體電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 裸金電極表面的拋光及活化處理：將裸金電極用氧化鋁粉末打磨，用超純水超聲 清洗去除氧化鋁粉末，將清洗好的裸金電極浸入新鮮配制的熱的Piranha溶液于20-25°C 下活化10分鐘，得到活化的裸金電極； (2) 活化電極的適配體修飾：合成如權(quán)利要求1所述的適配體，配制100 μ mol/L的適 配體溶液，加入到NaCl溶液中配制成2 μ mol/L適配體組裝液；將步驟（1)所得的活化的裸 金電極浸入適配體組裝液中，4°C下組裝24小時，得到所述的適配體電化學(xué)生物傳感器。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的適配體電化學(xué)生物傳感器可以用于克倫巴胺的檢測。
7. -種基于如權(quán)利要求4所述的適配體電化學(xué)生物傳感器的檢測克倫巴胺的方法，其 特征在于，包括以下步驟： (1)對克倫巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線： 將所述的適配體電化學(xué)生物傳感器作為工作電極，Ag/AgCl (飽和KC1)電極作為參比 電極，鉬絲電極作為對電極； 將所述的適配體電化學(xué)生物傳感器用超純水沖洗，去除未結(jié)合的適配體，然后置于濃 度為 5mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]為 1 :1 的含 0. lmol/L KC1 的電解液中，進(jìn)行交 流阻抗分析，初始電位為〇. 22V，頻率為0. 1-1. 0X105Hz，得到適配體電化學(xué)生物傳感器的 交流阻抗圖譜及其阻抗值RetO ; 將交流阻抗分析后的適配體電化學(xué)生物傳感器用超純水沖洗后浸入濃度1. 〇pg/mL的 克倫巴胺水溶液中，室溫孵育15分鐘，反應(yīng)后用超純水沖洗去除非特異性吸附的克倫巴 胺，然后置于濃度為 5mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]為 1 :1 的含 0. lmol/L KC1 的電 解液中，進(jìn)行交流阻抗分析，初始電位為〇. 22V，頻率為0. 1-1. 0X105Hz，得到濃度為1. Opg/ mL的克倫巴胺標(biāo)準(zhǔn)液的交流阻抗圖譜及其阻抗值Retl ; 同理，將上述修飾電極依次放入濃度5. 0pg/mL、10. 0pg/mL、50. 0pg/mL、5. OX 102pg/ mL、l. OX 103pg/mL、5. OX 103pg/mL的克倫巴胺標(biāo)準(zhǔn)液中，分別于室溫下孵育反應(yīng)15分鐘， 分別進(jìn)行交流阻抗分析，記錄其對應(yīng)的交流阻抗圖譜及阻抗值Retn (η = 2, 3··· 7)，并計(jì)算 各標(biāo)準(zhǔn)液相對初始的適配體電化學(xué)生物傳感器的阻抗變化值Λ Ret，Λ Ret為各標(biāo)準(zhǔn)液對 應(yīng)的阻抗值Retn (η = 1，2, 3…7)減去適配體電化學(xué)生物傳感器對應(yīng)的阻抗值RetO ; 以濃度為 1. 0pg/mL、5. 0pg/mL、10. 0pg/mL、50. 0pg/mL、5. 0 X 102pg/mL、1. 0 X 103pg/mL、 5. 0 X 103pg/mL的克倫巴胺標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以這7種標(biāo)準(zhǔn)液對應(yīng)的阻抗變化值 Λ Ret為縱坐標(biāo)作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)對含克倫巴胺的樣品溶液進(jìn)行定量檢測： 根據(jù)農(nóng)業(yè)部I486號公告-1-2010所述方法對樣品中的克倫巴胺進(jìn)行提取純化；將得到 的克倫巴胺干粉用超純水溶解后過〇. 45 μ Μ濾膜，然后進(jìn)行電化學(xué)檢測； 將交流阻抗分析后的適配體電化學(xué)生物傳感器用超純水沖洗后浸入從樣品溶液中提 取純化得到的克倫巴胺水溶液中，室溫孵育15分鐘，反應(yīng)后用超純水沖洗，然后置于濃度 為 5mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]為 1 :1 的，含濃度 0· lmol/L KC1 的電解液中，進(jìn)行 交流阻抗分析，初始電位為0. 22V，頻率為0. 1-1. 0X105Hz，得到樣品中克倫巴胺溶液檢測 的交流阻抗圖譜及其阻抗值Rets ; 通過步驟（1)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出Rets-RetO對應(yīng)的克倫巴胺濃度，即為樣品中克 倫巴胺的濃度。
【文檔編號】G01N27/26GK104152455SQ201410369428
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】劉大嶺, 陳丹, 姚冬生, 謝春芳 申請人:暨南大學(xué)