一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，是由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度為1.0×10?6mol·L?1～1.0×10?4mol·L?1的魯米諾工作液，另配制濃度為10μg·mL?1～1.0×104μg·mL?1的過氧化氫水溶液，分別檢測(cè)空白水樣及待測(cè)水樣與過氧化氫水溶液及魯米諾工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為I0和I，計(jì)算得到相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI＝I0?I，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)水樣中結(jié)晶紫的濃度。本發(fā)明通過建立結(jié)晶紫?魯米諾(3?氨基鄰苯二甲酰肼)?過氧化氫的特殊發(fā)光體系檢測(cè)水體中結(jié)晶紫的含量，檢測(cè)靈敏及準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣、多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、成本低。
【專利說明】
一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法。 技術(shù)背景
[0002] 結(jié)晶紫，分子式為C25H3QClN3,其結(jié)構(gòu)如附圖1所示，屬三芳基甲烷化學(xué)物質(zhì)，被廣泛 地用于紡織業(yè)、皮革業(yè)、制陶業(yè)和細(xì)胞染色等。同時(shí)，由于它能抑制寄生蟲，殺死真菌和細(xì) 菌，許多國家在較長(zhǎng)一段時(shí)間里曾將其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的常用殺菌劑，用于魚類高發(fā)的水 霉病、原蟲病的控制，提高魚類存活率。但結(jié)晶紫對(duì)魚類的生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有高毒 性、高殘留、致癌、致畸、致突變等的毒副作用，大部分國家和地區(qū)將結(jié)晶紫列為水產(chǎn)獸醫(yī)行 業(yè)的禁用藥，但由于結(jié)晶紫價(jià)格低、易制備、使用方便和藥效顯著等特點(diǎn)，我國許多地方在 水產(chǎn)品養(yǎng)殖、保鮮和運(yùn)輸過程中仍在使用，引起的水產(chǎn)品體內(nèi)的殘留和環(huán)境污染，因此，需 要建立水體中結(jié)晶紫的快速檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)晶紫的使用進(jìn)行監(jiān)測(cè)監(jiān)管。
[0003] 目前結(jié)晶紫的檢測(cè)手段有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法
[0004] (HPLC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)、同位素內(nèi)標(biāo)法、酶聯(lián)免疫分析 法等，但這些方法有操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、儀器價(jià)格昂貴、需要專業(yè)的技術(shù)人員、不適合現(xiàn)場(chǎng)大 規(guī)模的檢測(cè)等缺點(diǎn)，而化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境 監(jiān)測(cè)、化學(xué)分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但目前對(duì)于結(jié)晶紫還沒有出現(xiàn)高效的基于化學(xué)發(fā)光的檢 測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，該 方法通過建立結(jié)晶紫-魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼)_過氧化氫的特殊發(fā)光體系，檢測(cè)水體 中結(jié)晶紫的含量，具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0008] 由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度 為1.0 X 10-6mol · L-1~1.0 X 10-4mol · L-1的魯米諾工作液，另配制濃度為IOyg · mL-1~1.0 X 104yg · ml/1的過氧化氫水溶液，分別檢測(cè)空白水樣及待測(cè)水樣與過氧化氫水溶液及魯米 諾工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為Io和I，計(jì)算得到相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度AI = Iq-I,對(duì) 照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)水樣中結(jié)晶紫的濃度。
[0009] 優(yōu)選的，所述碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液的濃度 為0.05mol · L-1 ~0.20mol · L-SpH值為9.5~13.0。
[0010] 所述待測(cè)水樣為水產(chǎn)養(yǎng)殖水或環(huán)境水樣，不含有結(jié)晶紫以外的其他影響結(jié)晶紫與 魯米諾、過氧化氫反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度的物質(zhì)，所述空白水樣為不含有結(jié)晶紫及其他影響結(jié)晶紫 與魯米諾、過氧化氫反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度的水樣，優(yōu)選的，待測(cè)水樣中結(jié)晶紫的濃度為2~SOOng · ml/1，保證結(jié)晶紫濃度與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度之間的正比關(guān)系。
[0011] 優(yōu)選的，所述待測(cè)水樣經(jīng)過預(yù)處理后再與過氧化氫水溶液及魯米諾工作液混合， 所述預(yù)處理是將待測(cè)水樣經(jīng)過濾后，用活化的強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂和強(qiáng)堿性陰離子交換 樹脂進(jìn)行處理，再加入乙二胺四乙酸二鈉作為掩蔽劑消除金屬離子的干擾，得到預(yù)處理后 的待測(cè)水樣。
[0012] 本發(fā)明利用結(jié)晶紫對(duì)魯米諾-過氧化氫在堿性條件下發(fā)光強(qiáng)度的影響來檢測(cè)結(jié)晶 紫的含量，實(shí)際中隨結(jié)晶紫含量增加，結(jié)晶紫-魯米諾-過氧化氫在堿性條件下反應(yīng)的化學(xué) 發(fā)光強(qiáng)度I降低，則魯米諾-過氧化氫在堿性條件下反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Io與結(jié)晶紫-魯米 諾-過氧化氫在堿性條件下發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I的差值（即相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度A I = Iq-I ) 隨結(jié)晶紫的含量增加而增加。在該檢測(cè)方法中，所述過氧化氫水溶液與魯米諾工作液反應(yīng) 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Io隨過氧化氫水溶液用量的增加而增加，即該空白反應(yīng)體系中魯米諾是過 量的，而含結(jié)晶紫的待測(cè)水樣與魯米諾工作液及過氧化氫水溶液反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I隨 待測(cè)水樣用量增加而減小，據(jù)此調(diào)節(jié)各種物質(zhì)的用量。
[0013] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的時(shí)間為IOs~30s。所述反應(yīng)是在避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)過程的 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度是逐漸增強(qiáng)后衰減的過程，因而需要根據(jù)實(shí)際情況選擇檢測(cè)時(shí)間。
[0014] 本發(fā)明的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法優(yōu)選在帶有多個(gè)樣品檢測(cè)槽、自動(dòng)進(jìn)樣 裝置及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)裝置的現(xiàn)有設(shè)備中進(jìn)行，在檢測(cè)槽中分別加入結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè) 水樣及空白樣，由自動(dòng)進(jìn)樣裝置同時(shí)將魯米諾工作液及過氧化氫水溶液注入樣品槽中進(jìn)行 化學(xué)發(fā)光，由化學(xué)發(fā)光檢測(cè)裝置檢測(cè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算后得到待測(cè)水樣中結(jié)晶紫的濃度， 可實(shí)現(xiàn)單個(gè)待測(cè)樣品的平行檢測(cè)、多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的同步檢測(cè)，進(jìn)樣準(zhǔn)確 度高，檢測(cè)速度快。所述現(xiàn)有設(shè)備可以為帶有自動(dòng)進(jìn)樣器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)單元的酶標(biāo)儀或其 他化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，另配套使用自動(dòng)讀板裝置(如微孔板）。
[0015] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明通過建立結(jié)晶紫-魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼)_過氧化氫的特殊化學(xué)發(fā) 光體系檢測(cè)水體中結(jié)晶紫的含量，具有檢測(cè)靈敏及準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，并可結(jié)合現(xiàn)有的自動(dòng) 進(jìn)樣、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等裝置，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、成本低，適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及 環(huán)境預(yù)警監(jiān)測(cè)。
【附圖說明】
[0017] 圖1結(jié)晶紫的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；
[0018] 圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明可通過如下的實(shí)施例進(jìn)一步的說明，但實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限 制。
[0020] 實(shí)施例
[0021]待測(cè)水樣的制備：取水樣IOOmL，用0.45μπι微孔濾膜過濾，所得濾液經(jīng)過活化后的 強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂(732,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(717， 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）處理，再加入IyL IX l(T7m〇l · I/1的乙二胺四乙酸二鈉作為 掩蔽劑消除金屬離子的干擾，得到預(yù)處理后的待測(cè)水樣;在100mL預(yù)處理后的待測(cè)水樣中加 入IyL Img · ml/1的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混合均勾，得到濃度為10.OOng · ml/1的模擬待測(cè) 水樣。
[0022] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與待測(cè)水樣的檢測(cè)：
[0023] 使用濾光片型多功能酶標(biāo)儀Infinite? 200 (TECAN，瑞士），配套使用白色96孔聚苯 乙烯平底微孔板（3922，Corning，美國），將空白水樣、待測(cè)水樣和濃度為800ng · mL一1、 500ng · mL-\300ng · mL-\200ng · mL-\l50ng · mL-\100 ng · mL-\50ng · mL-\25ng · ml,-1、 IOng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液按照50yL/孔的體積用量分 別加入到微孔板的微孔中，空白水樣、待測(cè)水樣及每個(gè)濃度的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液均設(shè)置3個(gè)平 行孔；
[0024] 用？!1=11.5、濃度為0.2111〇1.1/1的恥20)3溶液配置濃度為2\10- 5111〇1.1/1的魯米 諾工作液，用超純水配置濃度為1.11 X 103yg · ml/1過氧化氫水溶液，將魯米諾工作液與過 氧化氫水溶液分別連接酶標(biāo)儀的自動(dòng)進(jìn)樣器，設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣體積均為50yL、震蕩時(shí)間為 20s，開啟自動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)試，得到空白水樣發(fā)生反應(yīng)后的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別與待測(cè)水樣、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的差值（即相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度AI = I〇-I)，由結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì) 發(fā)光強(qiáng)度與結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = 78444Ln(x) + 124295(R2 = 0.9939)，由待測(cè)水樣反應(yīng)后的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)水樣的結(jié)晶紫濃 度為10.43ng · mL-、
[0025]考察檢測(cè)方法的回收率:取5yL初始濃度為Img · ml/1的結(jié)晶紫溶液，用預(yù)處理后的 待測(cè)水樣稀釋成10mL，此時(shí)濃度為50ng · mL-S再倍比稀釋成25ng · mL-1UOng · mL-1Jng · mL'得到4個(gè)添加后的待測(cè)水樣，并設(shè)空白樣，按照50μ!7孔的體積用量分別加入到微孔板 的微孔中，每個(gè)添加后的待測(cè)水樣及空白樣均設(shè)11個(gè)平行孔，開啟自動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)試，得到 空白樣發(fā)生反應(yīng)后與添加后的待測(cè)水樣的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的差值（即相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度A I = I0-I)，計(jì)算得到該檢測(cè)方法的回收率為89.4~112.5%，RSD〈10.4%。
[0026]最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù) 范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行若干推演或者等 同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，包括以下步驟： 由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度為 1.0X10-6mol · L-1~1.0X10-4mol · L-1的魯米諾工作液，另配制濃度為IOyg · mL-1~1.0X 104yg · ml/1的過氧化氫水溶液，分別檢測(cè)空白水樣及待測(cè)水樣與過氧化氫水溶液及魯米諾 工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為Io和I，計(jì)算得到相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度AI = I〇-I，對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)水樣中結(jié)晶紫的濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，其特征在于，所述碳酸鈉溶 液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液的濃度為〇.〇5mol · IZ1~0.20mol · L一S pH 值為9.5~13.0〇3. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)水樣中 結(jié)晶紫的濃度為2~800ng · mL一、4. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，其特征在于，所述反應(yīng)的時(shí)間 為IOs~30s。5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)方法，其特征在于，所述基 于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測(cè)在帶有多個(gè)樣品檢測(cè)槽、自動(dòng)進(jìn)樣裝置及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)裝置的設(shè) 備中進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK105891190SQ201610207824
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月4日
【發(fā)明人】趙肅清, 楊靈珊, 焦洛瑩, 秦靜, 夏娜娜, 沈定
【申請(qǐng)人】廣東工業(yè)大學(xué)