專利名稱：一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)測(cè)定分析領(lǐng)域，具體涉及采用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，以及用本方法制備的免疫學(xué)測(cè)定(定量\定性)試劑盒。本發(fā)明結(jié)合了吖啶酯化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素標(biāo)記技術(shù)以及(鏈酶)親和素偶聯(lián)的通用磁顆粒技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前常見的化學(xué)發(fā)光體系有多種，最主要的有HRP-魯米諾系統(tǒng)(或異魯米諾及其衍生物)，AP-螺旋金剛烷-1，2- 二氧乙烷及其衍生物系統(tǒng)，吖啶酯或吖啶磺酰胺系統(tǒng)， 以及電化學(xué)發(fā)光體系等；其它見諸文獻(xiàn)資料但商品化應(yīng)用尚未普遍推廣的還有咪唑類化合物、葡萄糖氧化酶、芳香草酸酯、黃嘌呤類化合物等等。目前，目前相對(duì)成熟的商品化化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑所采用的體系主要是前四種，而在這四種體系中，魯米諾(或異魯米諾及其衍生物)體系的靈敏度相對(duì)后三種低且穩(wěn)定性差，后三種發(fā)光體系的靈敏度都很高。這其中吖啶酯(或吖啶磺酰胺)發(fā)光體系相對(duì)于其他體系而言具有其特殊的優(yōu)點(diǎn)首先、對(duì)于發(fā)光標(biāo)記物來說，吖啶酯或亞丁磺酰胺類物質(zhì)的標(biāo)記相對(duì)簡(jiǎn)單，且標(biāo)記物發(fā)光穩(wěn)定，試劑盒有效期長(zhǎng)，成本相對(duì)也較低；且發(fā)光為閃光型，發(fā)光快速集中且強(qiáng)度大，方便實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度和精密度都很高，并且對(duì)于儀器的要求相對(duì)簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化操作；其次、對(duì)于發(fā)光體系來說，吖啶酯(或吖啶磺酰胺)相對(duì)于其他系統(tǒng)也是最為簡(jiǎn)單的，在堿性-過氧化氫溶液中就可以直接發(fā)光，不需要增強(qiáng)劑或催化劑；干擾因素少， 本底極低，信噪比很高?；谶灌グl(fā)光體系具有的這些優(yōu)點(diǎn)，研制開發(fā)吖啶酯類化學(xué)發(fā)光免疫分析系列試劑盒及配套儀器，從理論與實(shí)際意義上講是切實(shí)可行的，本發(fā)明即是利用吖啶酯((或吖啶磺酰胺)系統(tǒng)的這些優(yōu)勢(shì)進(jìn)行免疫試劑盒的開發(fā)。生物素_(鏈酶)親和素系統(tǒng)(biotin-(Strept)avidin system, BAS)因?yàn)橐粋€(gè) (鏈酶)親和素分子可以結(jié)合四個(gè)生物素分子的特性而產(chǎn)生的多級(jí)信號(hào)放大作用，可以顯著提高反應(yīng)靈敏度，且因?yàn)樯锼?鏈酶)親和素系統(tǒng)所具有的良好適應(yīng)性標(biāo)記方法簡(jiǎn)單且對(duì)于不同環(huán)境的抗性極佳，一經(jīng)問世，即受到廣泛應(yīng)用，但長(zhǎng)期以來，多數(shù)文獻(xiàn)及實(shí)際應(yīng)用所涉及的都是生物(鏈酶)親和素系統(tǒng)的信號(hào)放大，基本都在利用這一系統(tǒng)提高反應(yīng)體系的靈敏度，卻忽略了這一系統(tǒng)的另一大優(yōu)勢(shì)借助(鏈酶)親和素和生物素之間的強(qiáng)親和力，以(鏈酶)親和素偶聯(lián)其他諸如聚苯乙烯微孔板、納米顆粒以及其他適合的載體物質(zhì)作為通用載體，便可以很容易的連接任何被生物素化的分子，進(jìn)而參與進(jìn)一步的反應(yīng)，這一應(yīng)用并不以信號(hào)放大為目的，而是提供一種通用的載體，因此在規(guī)模化生產(chǎn)和自動(dòng)化應(yīng)用領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明即利用(鏈酶)親和素偶聯(lián)超順磁顆粒形成一種通用的載體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而用于結(jié)合不同的生物素化抗原或抗體，開發(fā)出檢測(cè)不同生物大分子的試劑盒。超順磁微粒用于免疫分析檢測(cè)中是近幾年的事情，作為一種固相分離方法，相較于傳統(tǒng)的微孔板式免疫類反應(yīng)可以大大提高分離的效率，并且非常便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，磁顆粒相較于微孔板大大提高的表面積顯著增加了有效的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合免疫學(xué)液相反應(yīng)，可以大大拓寬免疫學(xué)檢測(cè)的線性范圍，更好的適應(yīng)臨床需求，而磁顆粒良好的環(huán)境抗性使得它可以適應(yīng)從酸到堿的苛刻反應(yīng)環(huán)境，從而使得反應(yīng)體系具有更大的包容性。但是長(zhǎng)久以來，人們利用磁顆粒作為固相載體，只是簡(jiǎn)單的利用了磁顆粒易于分離的特點(diǎn)，多數(shù)應(yīng)用都只是將不同分子直接標(biāo)記在磁顆粒上進(jìn)而參與免疫反應(yīng)，每一個(gè)項(xiàng)目都需要將不同的抗原 /抗體標(biāo)記于磁顆粒上，對(duì)于規(guī)模化生產(chǎn)來說，這將耗費(fèi)很多的人力物力，會(huì)嚴(yán)重影響生產(chǎn)效率，本發(fā)明旨在創(chuàng)造性的將生物素(鏈酶)親和素系統(tǒng)的通用性和超順磁顆粒體系易于分離的特性完美結(jié)合在一起，將(鏈酶)親和素同超順磁顆粒偶聯(lián)形成通用載體，可以結(jié)合任何生物素化的分子，并利用吖啶酯檢測(cè)系統(tǒng)的高靈敏度和高穩(wěn)定性，開發(fā)不同的免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的新穎之處有(1)利用(鏈酶)親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒作為通用的固相載體，既保留了磁顆粒的易于分離特性，有保留了(鏈酶)親和素良好的通用性；(2) 選擇吖啶酯(或吖啶磺酰胺)作為發(fā)光體系，具有高靈敏度和高穩(wěn)定性；(3)使用單克隆抗體或基因重組的抗原，大大提高了反應(yīng)的特異性。以(鏈酶)親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒作為通用的固相載體，以不同生物素化抗原 /抗體分子作為捕獲試劑，以吖啶酯(或吖啶磺酰胺)標(biāo)記的抗原/抗體分子作為檢測(cè)試劑，以NaOH-H2A作為底物系統(tǒng)來進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的開發(fā)是一種先進(jìn)而有效的方法， 必將極大的促進(jìn)化學(xué)發(fā)光產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用與發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以(鏈酶)親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒作為通用的固相載體，以不同生物素化抗原/抗體分子作為捕獲試劑，以吖啶酯(或吖啶磺酰胺)標(biāo)記的抗原 /抗體分子作為檢測(cè)試劑，以NaOH-H2A作為底物系統(tǒng)的通用技術(shù)平臺(tái)。本發(fā)明的另一目的是以此技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ)開發(fā)不同的免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的通用技術(shù)平臺(tái)包含以下技術(shù)1)以親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒作為通用的固相載體技術(shù)；2)以不同生物素偶聯(lián)不同捕獲抗原/抗體分子各種活性基團(tuán)的標(biāo)記技術(shù)；3)以不同吖啶酯或吖啶磺酰胺聯(lián)通過不同偶聯(lián)劑偶聯(lián)不同檢測(cè)抗原/抗體分子各種活性基團(tuán)的標(biāo)記技術(shù)；4)以NaOH-H2A為基礎(chǔ)、以酸和表面活性劑為增強(qiáng)劑的底物系統(tǒng)。具體的，本發(fā)明所述的(鏈酶)親和素包括親和素(Avidin)，鏈酶親和素 (Streptavidin)以及中性親和素(Neutravidin)以及其他可以結(jié)合生物素分子的類親和素分子。本發(fā)明所述的超順磁顆粒是指以四氧化三鐵為內(nèi)核、表面包裹帶有諸如氨基 (NH2-)、羧基(-C00H)、羥基(-0H)、巰基(-SH)或其他易于偶聯(lián)的活性基團(tuán)的聚合物，顆粒直徑在5nm-5 μ m的超順磁顆粒。本發(fā)明所述的生物素是指以,
權(quán)利要求
1.一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，特征在于，所述方法融合了以下技術(shù)方法1)以親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒作為通用的固相載體技術(shù)；2)以不同生物素偶聯(lián)不同捕獲抗原/抗體分子各種活性基團(tuán)的標(biāo)記技術(shù)；3)以不同吖啶酯或吖啶磺酰胺聯(lián)通過不同偶聯(lián)劑偶聯(lián)不同檢測(cè)抗原/抗體分子各種活性基團(tuán)的標(biāo)記技術(shù)；4)以NaOH-H2A為基礎(chǔ)、以酸和表面活性劑為增強(qiáng)劑的底物系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，特征在于1)所述“親和素”選自親和素、鏈酶親和素、中性親和素或可以結(jié)合生物素分子的類親和素分子；2)所述“超順磁顆?！睘橐运难趸F為內(nèi)核、表面包裹帶有各種活性基團(tuán)的聚合物， 顆粒直徑在50nm-5 μ m的超順磁顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè) 的方法，特征在于選用的生物素是指以
4.根據(jù)權(quán)利要求ι 3任一所述的一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，特征在于，所述各種活性基團(tuán)為氨基、羧基、羥基、巰基；所述不同偶聯(lián)劑為二甲基亞胺、戊二醛、N, N' - 二環(huán)己基碳二亞胺、SATA, SMCC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，特征在于，所述底物系統(tǒng)為以NaOH-H2A為基礎(chǔ)、以酸和表面活性劑作為增強(qiáng)劑進(jìn)行不同配比組合的適用于吖啶酯或吖啶磺酰胺體系的發(fā)光底物系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，特征在于，所述酸為硝酸、硫酸、鹽酸；所述表面活性劑為SDS、Tween, Triton-X, Brij，CTAC。
7.一種利用權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行檢測(cè)的甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，特征在于，所述試劑盒包括鏈酶親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒；捕獲抗體，所述捕獲抗體為結(jié)合生物素標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的生物素化甲胎蛋白單克隆抗體；檢測(cè)抗體，所述檢測(cè)抗體為吖啶酯標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的吖啶酯-甲胎蛋白單克隆抗體；及由A液HN03-H202、B液NaOH-SDS組成的底物系統(tǒng)。
8.一種利用權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行檢測(cè)的聯(lián)合檢測(cè)血液中HIV 1+2及 P24抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒，特征在于，所述試劑盒包括中性親和素偶聯(lián)的超順磁顆粒；結(jié)合生物素標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的生物素化HIV 1+2重組抗原和生物素化HIV pM抗體； 吖啶酯標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的吖啶酯-HIV 1+2重組抗原和吖啶酯-HIV p24抗體 ’及由A液HN03-H202、B液NaOH-SDS組成的底物系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法在病原微生物檢測(cè)、疾病標(biāo)志物檢測(cè)、毒品檢測(cè)、 環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)測(cè)定分析領(lǐng)域，具體涉及采用吖啶酯標(biāo)記技術(shù)結(jié)合通用型磁顆粒進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法，以及用本方法制備的免疫學(xué)測(cè)定(定量\定性)試劑盒。本發(fā)明以吖啶酯或吖啶磺酰胺類物質(zhì)標(biāo)記檢測(cè)抗原或抗體，以生物素標(biāo)記捕獲抗原或抗體，結(jié)合通用的(鏈酶)親和素標(biāo)記磁顆粒，進(jìn)行生物分子的免疫學(xué)測(cè)定，該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，在免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102565405SQ201110243269
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者姚洪濤 申請(qǐng)人:蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)生物試劑有限公司