本發(fā)明屬于工業(yè)生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用固定化釀酒酵母細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。

背景技術(shù)：

化石燃料的長久使用，使各種環(huán)境問題愈演愈烈，且化石燃料日趨枯竭。乙醇作為一種清潔型燃料，已是世界各國的可再生能源研究的熱點(diǎn)，也是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)で笸黄频闹攸c(diǎn)。乙醇可作為新的燃料替代品，減少對石油的消耗，也作為可再生能源，可直接作為液體燃料或者同汽油混合使用，可減少對石油的依賴，保障該國能源的安全。

傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)技術(shù)采用游離細(xì)胞發(fā)酵，酵母會與發(fā)酵醪共同流走，使發(fā)酵罐中酵母細(xì)胞濃度過低，進(jìn)而造成發(fā)酵速度較慢，酒精發(fā)酵時間較長，時間成本過大，效率較低，且發(fā)酵結(jié)束固液分離困難。

固定化技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用就是將微生物自然固定或限定在有限的空間，使其保持固有活性，并可以重復(fù)利用。近些年，固定化技術(shù)不斷發(fā)展，對固定化方法和載體材料的研究越來越廣泛。按照載體與細(xì)胞作用方式的差異，可將其分為吸附法、包埋法、交聯(lián)法和膜隔離法等。

固定化酵母就是將酵母細(xì)胞固定在不溶性載體上并進(jìn)行發(fā)酵的過程，此技術(shù)具有以下特點(diǎn)：效率高、專一性強(qiáng)、酵母細(xì)胞及載體可重復(fù)利用、便于連續(xù)發(fā)酵及自動化控制?？纱蟠蠊?jié)省發(fā)酵時間，降低發(fā)酵成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用固定化釀酒酵母細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高，效率低等問題。

未解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種利用固定化釀酒酵母細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，它包括如下步驟：

將處理后的豬小腸浸入發(fā)酵液中，接種酵母細(xì)胞種子液，使酵母細(xì)胞定植于豬小腸中；定植完成后，通過更換發(fā)酵液實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵。

其中，所述的處理后的豬小腸是指將豬小腸用水清洗。

其中，豬小腸用水清洗后，可直接用作后續(xù)操作，也可選擇下述三種方法之一進(jìn)行處理：

(1)用75v/v％的乙醇水溶液浸泡30min；

(2)用0.1mol/L的NaOH水溶液浸泡30min；

(3)冷凍干燥。

豬小腸用水清洗后，優(yōu)選再用75v/v％的乙醇水溶液浸泡30min。

其中，所述的發(fā)酵液的配方為：葡萄糖20～250g/L，胰蛋白胨0.5～30g/L，酵母膏0.5～30g/L，硫酸銨0.01～3g/L，磷酸鹽0.01～10g/L，七水合硫酸亞鐵0.01～1g/L，七水合硫酸鋅0.01～1g/L，溶劑為水。

其中，豬小腸和發(fā)酵液的質(zhì)量比為1～200：1000，優(yōu)選80：1000。

其中，酵母細(xì)胞種子液的接種量為1～15％v/v，優(yōu)選5％v/v。

其中，所述的定植是指接種酵母細(xì)胞種子液后，在30～35℃下培養(yǎng)36～72h。

優(yōu)選的是，接種酵母細(xì)胞種子液后，在30℃恒溫下以200rpm培養(yǎng)24h，更換發(fā)酵液，之后每隔24h更換一次發(fā)酵液，共培養(yǎng)72h。

其中，所述的酵母細(xì)胞種子液由酵母細(xì)胞在種子培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期后得到；接種時，酵母細(xì)胞種子液的OD值為1。

其中，所述的種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1～10g/L、胰蛋白胨1～10g/L和酵母粉1～10g/L，溶劑為水。

其中，發(fā)酵時的條件為：200rpm下厭氧發(fā)酵。

其中，優(yōu)選當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度小于10g/L時，更換發(fā)酵液。

其中，發(fā)酵所得乙醇產(chǎn)量通過高效氣相色譜檢測，具體方法為：安捷倫氣相色譜儀(分流襯管：5183-4647)，柱箱溫度：70℃；進(jìn)樣器溫度：180℃；檢測器溫度：230℃。檢測液配制方法：100μL待測樣品與1900μL純水混合均勻。進(jìn)樣量：1μL。

有益效果：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：

本發(fā)明所采用的固定化材料為豬小腸。豬小腸作為不常見食材，利用價值不高。豬小腸做為載體，不僅開發(fā)了其附加價值，而且因其生物材料特性，無毒害，可食用，生物安全性高。而且在發(fā)酵過程中，對釀酒酵母細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)，不影響其代謝生長狀況，機(jī)械強(qiáng)度較好，可以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。

本發(fā)明所采用的固定化材料可以使釀酒酵母細(xì)胞定植其上，可有效避免在連續(xù)發(fā)酵過程中的菌體流失現(xiàn)象。而且酵母可以通過群聚效應(yīng)，增加對各種不利因素的耐受性，提高其存活能力。同時，進(jìn)行連續(xù)化發(fā)酵時操作方便、便于自動化生產(chǎn)，可較明顯地節(jié)省人力、物力，降低生產(chǎn)費(fèi)用。最終，可以使發(fā)酵性能大幅提高，其中，以葡萄糖為底物進(jìn)行乙醇發(fā)酵的產(chǎn)率由1-3gL^-1h^-1提高至5.8-7.6gL^-1h^-1。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中不同處理方式的豬小腸進(jìn)行乙醇發(fā)酵的影響；

圖2為實(shí)施例2中豬小腸添加量的不同對乙醇發(fā)酵的影響；

圖3為實(shí)施例3中連續(xù)發(fā)酵對發(fā)酵速率的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例說明豬小腸作為固定化載體的不同處理方式對乙醇發(fā)酵的影響。為探討不同發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響，使用經(jīng)過不同處理方式的豬小腸進(jìn)行乙醇發(fā)酵，結(jié)果如圖1所示。

對豬小腸分別以75％乙醇浸泡30min，0.1M NaOH浸泡30min，冷凍干燥，高壓滅菌等方式處理后，以8％的質(zhì)量比加入發(fā)酵液中。乙醇發(fā)酵的條件為30°恒溫條件下以200轉(zhuǎn)不通入氣體情況下厭氧發(fā)酵，得到豬小腸不同處理方式下釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇產(chǎn)量對比圖，如圖1所示。具體發(fā)酵實(shí)施步驟如上述。高壓滅菌處理方式在相同發(fā)酵時間下比游離酵母發(fā)酵產(chǎn)率稍高，其次是0.1M NaOH浸泡30min，冷凍干燥這兩種處理方式發(fā)酵效果更好，最后，75％乙醇浸泡30min這種處理方式下乙醇發(fā)酵產(chǎn)率最高。

實(shí)施例2

本實(shí)施例說明豬小腸作為固定化載體添加量不同對乙醇發(fā)酵的影響。

分別以40:1000,80:1000,120：1000質(zhì)量比向發(fā)酵液中加入75％乙醇處理過的豬小腸載體，具體發(fā)酵實(shí)施步驟如上述，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)具體發(fā)酵實(shí)施步驟如上述。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果來看，在實(shí)施例比例范圍內(nèi)，其余兩組實(shí)驗(yàn)效果均不如80:1000的豬小腸載體添加量。由此可知，80:1000的添加量在此發(fā)明中為最優(yōu)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例說明豬小腸作為釀酒酵母固定化載體在連續(xù)發(fā)酵過程中的效果。

以80:1000質(zhì)量比向發(fā)酵液中加入75％乙醇處理過的豬小腸固定化載體，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖含量在10g/L以下，更換新鮮發(fā)酵液，連續(xù)發(fā)酵10批次。發(fā)酵結(jié)果如圖3。根據(jù)發(fā)酵數(shù)據(jù)可以看出隨著發(fā)酵批次的增加，發(fā)酵時間相應(yīng)縮短，發(fā)酵速率逐漸加快，在第四批次發(fā)酵之后，發(fā)酵產(chǎn)率基本上維持在5.8-7.2gL^-1h^-1，相比與游離酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的1-3gL^-1h^-1，生產(chǎn)效率明顯提高。