本發(fā)明涉及一種檢測致癌蛋白表皮生長因子受體（EGFR）的試劑及試劑盒，屬于腫瘤分子診斷技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

表皮生長因子受體（EGFR）屬于受體酪氨酸激酶分子，在細(xì)胞生長、增殖、分化、遷移、粘連、存活等過程中起關(guān)鍵的控制和調(diào)節(jié)作用。EGFR在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、直腸癌、肝癌、腦癌、腎癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中高度表達(dá)，其過表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移具有密切的相關(guān)性，特別是在肺癌中，已證明EGFR的激酶編碼區(qū)突變導(dǎo)致EGFR活化是其腫瘤發(fā)生和惡化的主要原因之一。 根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，在亞裔女性非吸煙肺癌患者中，約有20% 的患者是EGFR活化突變造成的。因此， EGFR是腫瘤靶向治療中最重要的靶向分子之一。EGFR的激酶抑制劑和抑制性抗體，如Gefitinib （Iressa）、erlotinib （Tarceva）、lapatinib（Tykerb）、Cetuximab （Erbitux）、panitumumab（Vectibix）等，已在肺癌的臨床治療中廣泛使用，是目前肺癌靶向治療中最為有效的藥物。

由于EGFR在腫瘤發(fā)生發(fā)展和臨床治療中的重要性，其檢測和臨床分子診斷對于腫瘤的預(yù)防、靶向治療及預(yù)后效果預(yù)測成為一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。 目前腫瘤組織中的EGFR檢測主要為抗體染色和二代測序?？贵w染色是腫瘤組織EGFR檢測的常規(guī)方法，其操作步驟比較簡便，但檢測結(jié)果不是很穩(wěn)定，變異較大。且抗體制作過程較為繁瑣，成本較高。二代測序雖然可檢測到EGFR的突變位點(diǎn)，但檢測過程非常復(fù)雜，技術(shù)要求較高，且結(jié)果分析繁瑣，需要專門的技術(shù)人員才能完成。同時檢測成本也較高。因此，設(shè)計(jì)、發(fā)展和建立新型的快速、簡便、準(zhǔn)確以及經(jīng)濟(jì)的EGFR檢測技術(shù)，對腫瘤的分子診斷和EGFR靶向治療具有非常重要的臨床意義。

本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，非受體酪氨酸激酶TNK2（亦稱ACK1）含有一個與EGFR結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域特異性地與活化的EGFR激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，命名該TNK2結(jié)構(gòu)域?yàn)镋GFR激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（EGFR kinase-binding domain，簡稱EKBD）。本發(fā)明中基于TNK2的EGFR激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 結(jié)合熒光染料和分子標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一種新型的活化EGFR檢測試劑，并建立了新型的活化EGFR檢測技術(shù)。同時應(yīng)用該活化EGFR檢測試劑和技術(shù)，發(fā)明了腫瘤組織和細(xì)胞的活化EGFR檢測試劑盒，以用于腫瘤的臨床分子診斷和預(yù)后效果的預(yù)測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中竄仔的技術(shù)缺陷，提供一種新型的檢測致癌蛋白表皮生長因子受體的技術(shù)。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明公開了一種與活化EGFR激酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域EKBD，它的編碼核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

SEQ.ID.NO.1：

gcgcagctgg ccatggacgc ctgctccctg ctggacgaga ccccgcctca gagccccacg cgggcactgc cccggcccct gcaccccacg cctgtggtgg actgggacgc acgcccgctg ccccccccgc ccgcctatga cgacgtggcc caggatgagg atgactttga gatctgctcc atcaacagca ccctcgtggg cgcgggggtc cctgccgggc ccagccaggg ccagaccaac tacgcctttg tgcctgagca ggcgcggccg ccccctcccc tggaggacaa cctgttcctc ccgccccagg gtgggggc

SEQ.ID.NO.2：GPASPPRVPPREPLSPQGSRTPSPLVPPGSSPLPPRLSSSPGKTMPTTQSFASDPKYATPQVIQAPGPRAGPCILPIVRDGKKVSSTHYYLLPERPSYLERYQRFL

所述的EKBD的核苷酸或氨基酸序列包括人和其他哺乳動物的TNK2或MIG6同源序列；

所述的EKBD核苷酸或氨基酸序列包括不影響或增強(qiáng)其與EGFR結(jié)合的序列改變，如序列點(diǎn)突變、剪切和添加等；

所述的EKBD核苷酸或氨基酸序列包括相似的人工合成序列。

本發(fā)明公開了利用熒光染料標(biāo)記EKBD和EKBD融合蛋白檢測腫瘤組織和細(xì)胞中活化EGFR的試劑和技術(shù)。檢測腫瘤組織和細(xì)胞中活化EGFR的EKBD試劑的制作技術(shù)流程如圖1所示。

本發(fā)明還提供一種檢測致癌蛋白表皮生長因子受體的試劑，所述試劑包括EKBD結(jié)構(gòu)域，具體的，所述試劑為帶有熒光染料、標(biāo)簽或蛋白標(biāo)記的EKBD。

所述熒光染料為FITC、羅丹明、俄勒岡綠、德克薩斯紅、Cy5或Cy3，優(yōu)選FITC。

所述標(biāo)記EKBD的蛋白為HPR或其它酶功能蛋白或標(biāo)簽蛋白。

本發(fā)明還公開了使用EKBD檢測腫瘤組織和細(xì)胞中活化EGFR的試劑和技術(shù)而制作的試劑盒，所述試劑盒中包括所述的檢測致癌蛋白表皮生長因子受體的試劑。

所述試劑盒包括2種，這兩種試劑盒的組成如下：

（1）試劑盒#1： HPR-EKBD融合蛋白、二甲苯溶液、0.5M檸檬酸鹽緩沖液、30%過氧化氫溶液、阻斷液和DAB染色液。

（2）試劑盒#2：熒光染料標(biāo)記的FITC-EKBD、10×細(xì)胞固定液、10×細(xì)胞滲透液和10X清洗液。

其中所述的標(biāo)記EKBD的熒光染料除FITC外，還包括但不限于羅丹明、俄勒岡綠、德克薩斯紅、Cy5或Cy3等。

所述HRP-EKBD融合蛋白中除HRP外，還包括但不限于其它的酶功能蛋白及標(biāo)簽蛋白等。

試劑盒的具體成分為：

阻斷液：10% 山羊血清。

DAB染色液：1000μL染色液A + 25μL染色液B + 10μL染色液C；其中的染色液A為DAB緩沖液，即50 mM Tris-HCl，pH7.6；染色液B為2% DAB；染色液C為1% H₂O₂。

10×細(xì)胞固定液：30% 多聚甲醛。

10×細(xì)胞滲透液：含濃度為1% Triton X-100 的10×PBS。

10×清洗液：0.5 M Tris-HCl，pH 7.5， 1.5 M NaCl ，0. 5% Tween-20。

本發(fā)明技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢：

目前，致癌蛋白EGFR的病理診斷和檢測技術(shù)主要基于抗體的免疫染色技術(shù)。由于抗體需要進(jìn)行動物免疫反應(yīng)產(chǎn)生，因此生產(chǎn)周期長（需6-12個月）、成本高。且抗體與EGFR的親和性不可預(yù)測，其檢測靈敏度也難以改進(jìn)。同已有的EGFR檢測技術(shù)相比，本發(fā)明中EGFR檢測試劑盒的EKBD由于是通過大腸桿菌離體表達(dá)生產(chǎn)的，其生產(chǎn)周期短（1-2周），生產(chǎn)簡便易操作，成本低，且檢測靈敏度可以通過蛋白工程進(jìn)行改進(jìn)。同時，EKBD可通過分子設(shè)計(jì)進(jìn)行各種標(biāo)簽標(biāo)記，使其在EGFR臨床檢測的應(yīng)用范圍和目的非常廣泛，可用于腫瘤患者血液、尿液或腫瘤組織的EGFR分子精準(zhǔn)檢測和診斷。

附圖說明

圖1是制備檢測活化EGFR的EKBD試劑的技術(shù)流程示意圖。

圖2是應(yīng)用FITC標(biāo)記的EKBD檢測肺癌細(xì)胞中活化的EGFR的結(jié)果；圖中左圖為沒有EGF刺激的肺癌A549細(xì)胞，右圖是經(jīng)EGF刺激30分鐘后的肺癌A549細(xì)胞。

圖3是應(yīng)用HRP標(biāo)記的EKBD檢測肺癌組織中活化的EGFR的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：熒光染料標(biāo)記的EKBD的制備

1. EKBD的分子設(shè)計(jì)和克隆。從人類TNK2轉(zhuǎn)錄亞型I的cDNA（NCBI 基因登錄號: NM_005781）中將EKBD的編碼區(qū)（見SEQ.ID.NO.1）通過PCR復(fù)制出來，再轉(zhuǎn)到帶有6×his標(biāo)簽的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a （Novagen，Madison，WI，USA）。PCR復(fù)制出的編碼區(qū)經(jīng)DNA測序證實(shí)是EKBD的序列。該編碼區(qū)表達(dá)出來的EKBD氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2．EKBD的表達(dá)與純化：將pET28a-His-EKBD轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21中以用于表達(dá)EKBD蛋白。 轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37°C 下用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)到A₆₀₀（600 nm的光吸收）為1.0的密度，然后加入1/1000 IPTG（0.5mM）去誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá) 3-5個小時。 融合蛋白表達(dá)后的細(xì)菌則用離心機(jī)8000 rpm離心10分鐘沉淀收集。沉淀后的細(xì)菌重懸于細(xì)菌裂解液（25 mM HEPES (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 10% 甘油, 10 mM 咪唑）。每500毫升的細(xì)菌沉淀, 用細(xì)菌裂解液10毫升重懸。然后加入溶菌酶（50微克/毫升）和DNase I（10微克/毫升），在4°C下旋轉(zhuǎn)培育 1小時。 之后用超聲儀在能量水平3.5下超聲裂解3×30秒加2秒間隔。裂解液在4°C下15000rpm離心20分鐘， 將其上清液轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管。在上清液中加入200μL Ni-NTA瓊脂糖珠（Qiagen，Germantown, MD，USA），并在4°C 下滾動培育 2-3小時。瓊脂糖珠用加有20 mM 咪唑的細(xì)菌裂解液清洗3次（每次10毫升裂解液）。膠珠上的EKBD用洗脫液（100 mM 碳酸氫鹽緩沖液 (pH 8.4), 100 mM NaCl, 250 mM咪唑）在4 °C下滾動洗脫15分鐘，洗脫出來的EKBD 在透析液（100 mM 碳酸氫鹽緩沖液, pH 8.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂）透析過夜。經(jīng)透析出來的EKBD其純度和濃度用SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色來進(jìn)行測定。純化好的EKBD儲存在-80 °C用于熒光染料標(biāo)記。

用于表達(dá)EKBD融合蛋白的親和標(biāo)簽（Tag）不僅限于hexahistidine （6×His 標(biāo)簽），也包括其他的親和標(biāo)簽，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽， T7標(biāo)簽，泛素標(biāo)簽，F(xiàn)lag 標(biāo)簽，Myc 標(biāo)簽，HA標(biāo)簽，聚精氨酸標(biāo)簽，polycysteine標(biāo)簽，polyphenylalanine標(biāo)簽，BTag標(biāo)簽，半乳糖結(jié)合域標(biāo)簽，纖維素結(jié)合域（CBD）標(biāo)簽，thioredoxin標(biāo)簽，金黃色葡萄球菌蛋白標(biāo)簽，鏈球菌G蛋白標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽，β-半乳糖苷酶標(biāo)簽，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，S-肽標(biāo)簽，生物素標(biāo)簽，advidin標(biāo)簽, streptavidin標(biāo)簽以及鏈球菌標(biāo)簽等。

表達(dá)EKBD不僅限于大腸桿菌，也包括其它的表達(dá)系統(tǒng)，如酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等。因而表達(dá)的載體不僅限于細(xì)菌表達(dá)載體，也包括酵母、植物、動物以及病毒表達(dá)載體。

EKBD的生產(chǎn)不僅限于融合蛋白方式，也包括非融合蛋白和人工合成的多肽。

3．EKBD的染料標(biāo)記：將純化的EKBD用100 mM 碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.4）配成10 mg/mL的EKBD溶液?；罨臒晒馊玖螰ITC（熒光素） 琥珀酰亞胺酯（FITC succinimidyl ester）（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）溶解在DMSO溶劑中，濃度為10 mg/mL。將50-100μL的熒光染料（0.5-1 mg）慢慢加入到攪拌的1 mL EKBD溶液中。在室溫（25 °C）下?lián)u晃共育60分鐘，然后加入0.1 mL新鮮配制的1.5 M 羥胺 停止反應(yīng)，并在室溫下繼續(xù)共育60分鐘。標(biāo)記好的EKBD溶液中的游離的熒光染料分子通過PBS緩沖液（pH 7.4）透析去除。在透析好的FITC-EKBD溶液中加入BSA （終濃度為10 g/mL）和疊氮鈉（sodium azide）（終濃度為1 mM）以穩(wěn)定蛋白和防止菌類污染。標(biāo)記好的EKBD儲存在4 °C 備用。

EKBD的染料標(biāo)記不僅限于FITC（fluorescein），也包括其它的染料，如Rhodamine，Oregon Green，Texas Red，Cy5，Cy3等。

實(shí)施例二： HRP（Horseradish Peroxidase）-EKBD蛋白的制備

從人類TNK2轉(zhuǎn)錄亞型I的cDNA中將EKBD的編碼區(qū)（見SEQ.ID.NO.1）以及pUC19-6×HIS-HRP（Addgene，Cambridge, MA，USA）中的HIS標(biāo)簽和HRP的編碼區(qū)通過PCR復(fù)制出來，再轉(zhuǎn)到慢病毒載體pFUW（Addgene，Cambridge, MA，USA）上形成pFUW-HIS-HRP-EKBD表達(dá)質(zhì)粒。該慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2（Addgene，Cambridge, MA，USA）和pMD2.G（Addgene，Cambridge, MA，USA）一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞（ATCC，Manassas, VA，USA）中包裝成病毒顆粒。轉(zhuǎn)染24小時后，開始收集培養(yǎng)基。每24小時收集一次，共三次。收集的培養(yǎng)基中的細(xì)胞碎片則通過1000xg離心5分鐘去除。離心后的帶有病毒顆粒的培養(yǎng)基儲存在4 °C備用。

帶病毒顆粒的培養(yǎng)基與正常培養(yǎng)基1:1 混勻后再和6 g/mL聚凝胺 (Sigma-Aldrich, H9268)一起感染 HEK293T細(xì)胞。感染48-72小時后，收集細(xì)胞。細(xì)胞用冷凍的PBS 溶液 （137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4）清洗一次，然后用冷凍的動物細(xì)胞裂解液（40 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 25 mM 磷酸甘油, 1 mM 正釩酸鈉, 1 mM EDTA, 10 μg/mL 抑酶肽）裂解。細(xì)胞裂解后，離心15,000g 15分鐘去除細(xì)胞碎片和未溶解的殘留細(xì)胞器及細(xì)胞骨架。離心的上清用來純化HIS-HRP-EKBD。在上清液中加入200μL Ni-NTA瓊脂糖珠（Qiagen，Germantown, MD，USA），并在4°C 下滾動培育 2-3小時。瓊脂糖珠用清洗液（100 mM 碳酸氫鹽緩沖液(pH 8.4), 100 mM NaCl, 20 mM 咪唑）液清洗3次（每次10毫升裂解液）。膠珠上的HRP-EKBD用洗脫液（100 mM 碳酸氫鹽緩沖液 (pH 8.4), 100 mM NaCl, 250 mM 咪唑）在4 °C下滾動洗脫15分鐘，洗脫出來的HRP-EKBD 在透析液（100 mM 碳酸氫鹽緩沖液, pH 8.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂）透析過夜。經(jīng)透析出來的HRP-EKBD其純度和濃度用SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色來進(jìn)行測定。其HRP活性則用ECL（Enhanced Chemiluminescence）試劑盒（PerkinElmer，Hopkinton, MA，USA）測定。

用于動物細(xì)胞中表達(dá)HRP-EKBD的載體不僅限于慢病毒載體，也包括其它類型的動物細(xì)胞表達(dá)載體，如腺病毒載體、動物細(xì)胞瞬時表達(dá)（Transient expression）載體、昆蟲病毒表達(dá)載體等。

用于融合EKBD的蛋白不僅限于HRP，也包括其它的酶功能蛋白，如GFP、luciferase、nuclease等和標(biāo)簽蛋白如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽、 T7標(biāo)簽、泛素標(biāo)簽、Flag 標(biāo)簽、Myc 標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、聚精氨酸標(biāo)簽，polycysteine標(biāo)簽、polyphenylalanine標(biāo)簽、BTag標(biāo)簽、半乳糖結(jié)合域標(biāo)簽、纖維素結(jié)合域（CBD）標(biāo)簽、thioredoxin標(biāo)簽、金黃色葡萄球菌蛋白標(biāo)簽、鏈球菌G蛋白標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽、β-半乳糖苷酶標(biāo)簽、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、S-肽標(biāo)簽、生物素標(biāo)簽、advidin標(biāo)簽、streptavidin標(biāo)簽以及鏈球菌標(biāo)簽等。

表達(dá)HRP-EKBD不僅限于人類細(xì)胞，也包括其它的動物細(xì)胞，如小鼠、大鼠和昆蟲細(xì)胞。

實(shí)施例三：應(yīng)用FITC-EKBD試劑盒檢測肺癌細(xì)胞中的活化EGFR

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購自American Type Culture Collection （ATCC，Manassas, VA，USA），正常培養(yǎng)在DMEM加10% FBS。培養(yǎng)條件為5% CO₂，37 °C。檢測前，細(xì)胞轉(zhuǎn)到底部有玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并用無血清的DMEM培養(yǎng)18小時。細(xì)胞經(jīng)EGF（100 ng/mL）處理30分鐘后，迅速移至冰上，用PBS清洗一次。然后用試劑盒中細(xì)胞固定液固定10分鐘。去除固定液后，再用試劑盒中的細(xì)胞滲透液處理10分鐘。用試劑盒中的清洗液清洗一次。以1:100的比率用清洗液加1% BSA稀釋試劑盒中FITC-EKBD，加入培養(yǎng)皿中，與細(xì)胞在室溫下共育60分鐘。移去FITC-EKBD溶液，用試劑盒中的清洗液清洗細(xì)胞三次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并記錄圖像（見圖2）。從圖中可以看出，沒有EGF刺激的肺癌A549細(xì)胞只有非常微弱的FITC-EKBD染色信號（圖2左邊照片），表明FITC-EKBD不能檢測未活化的EGFR。而經(jīng)EGF刺激30分鐘后，肺癌A549細(xì)胞的FITC-EKBD染色信號大幅增強(qiáng)（圖2右邊照片），表明FITC-EKBD檢測到細(xì)胞中被EGF刺激活化的EGFR。

用FITC-EKBD檢測活化EGFR，不僅限于腫瘤細(xì)胞和組織的染色，也包括其它的檢測技術(shù)和方法，如ELISA、沉淀分析、雜交分析、高通量篩選等技術(shù)和方法。檢測的腫瘤組織和細(xì)胞不僅限于肺癌，也包括其它的癌癥，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等。

用FITC-EKBD檢測EGFR不僅限于腫瘤組織和細(xì)胞，也包括血液、尿液、淋巴液等。

實(shí)施例四：應(yīng)用HRP-EKBD試劑盒檢測肺癌組織的活化EGFR

肺癌組織切片來源于江蘇大學(xué)第一附屬醫(yī)院。首先將石蠟包埋的組織切片用試劑盒中的二甲苯和醇溶液進(jìn)行脫石蠟和再水化。切片修復(fù)則用試劑盒中的0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0 ）在98℃下對切片處理5分鐘（微波爐處理），然后將切片冷卻至室溫。用3 ％過氧化氫溶液處理切片10分鐘去除內(nèi)源的過氧化物酶，再用PBS（ pH 7.4）清洗。用試劑盒中的阻斷液（blocking solution）在室溫下對切片處理10分鐘后，再用試劑盒中的HRP-EKBD（稀釋度1:100 ）在4 °C下孵育切片過夜。用試劑盒中的DAB（3,3’ Diaminobenzidine）染色溶液在室溫下染色切片5分鐘，PBS清洗5分鐘，再用蘇木精復(fù)染后，PBS清洗5分鐘。封片后，染色結(jié)果在Olympus CX31顯微鏡下觀察并記錄圖像 （見圖3）。圖中可觀察到很強(qiáng)的HRP-EKBD染色信號，表明HRP-EKBD能夠靈敏有效地檢測肺癌腫瘤組織中的活化EGFR，可應(yīng)用于肺癌腫瘤組織中活化EGFR的臨床檢測。

用HRP-EKBD檢測活化EGFR，不僅限于腫瘤細(xì)胞和組織的染色，也包括其它的檢測技術(shù)和方法，如ELISA、沉淀分析、雜交分析、高通量篩選等技術(shù)和方法。檢測的腫瘤組織和細(xì)胞不僅限于肺癌，也包括其它的癌癥，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等。

用HRP-EKBD檢測EGFR不僅限于腫瘤組織和細(xì)胞，也包括血液、尿液、淋巴液等。