專利名稱：：涉及hpv相關(guān)的癌前期的和癌的生長(包括cin)的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
：本申請要求于2001年7月20日提交的美國臨時專利申請60/306,809的優(yōu)先權(quán),在此其全文作為參考。依據(jù)從國家癌癥研究院(NCI)的授權(quán)號CA65561和CA77378以及國家健康研究院(NIH)的授權(quán)號CA16672，美國政府可擁有本發(fā)明的權(quán)利。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及免疫學(xué)，病毒學(xué)和腫瘤學(xué)。具體來說，涉及診斷和治療由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的癌前期的和癌的生長或損傷(包括子宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN))發(fā)生和復(fù)發(fā)的方法。2.相關(guān)技術(shù)描述全世界女性中，子宮頸癌是第二惡性癌，占到所有女性癌癥患者的15％(Parkin等，1993)。在美國，子宮頸癌是女性生殖道最為普遍的瘤之一。實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)的研究已經(jīng)集中于一些種類的人乳頭瘤病毒(HPV)在子宮頸瘤發(fā)病機(jī)理中的病原學(xué)作用上(Brinton，1992；Munoz等，1992)。一般的，在超過79％的確診患有子宮頸疾病的婦女的樣品中檢測出HPV的DNA。最普遍的HPV類型是HPV16，它發(fā)現(xiàn)于高度鱗狀上皮內(nèi)損傷和癌癥中(Lorincz等，1992)。流行病學(xué)研究結(jié)論支持了子宮頸瘤與HPV之間的相關(guān)性，在HPV型16中，這一關(guān)系更為顯著(Morrison等，1991；Koutsky等，1992；和Munoz等，1992)。腫瘤由細(xì)胞的非正常生長形成，它通常導(dǎo)致入侵正常組織，如原發(fā)性腫瘤，或?qū)е孪蜻h(yuǎn)處組織的傳播，如轉(zhuǎn)移瘤。HPV16的E6和E7基因經(jīng)常共同表達(dá)，且它們在HPV16陽性宮頸癌的活組織的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中異常豐富(Wettstein，1990；Seedorf等，1987)。充分的證據(jù)表明，E6和E7可讀框的共同表達(dá)對于多種哺乳動物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是必要且充分的(Munger等，1989)。而且，病毒基因組的E6和E7區(qū)域的連續(xù)表達(dá)似乎是保持惡性表型所必需的(vonKnebelDoeberitz等，1988)。一些HPV感染患者會產(chǎn)生子宮頸瘤，而另一些則不會。也觀察到很大比例的自發(fā)消退，這表明宿主的免疫作用。引入一種細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的反應(yīng)建立了針對病毒感染的主要防御機(jī)制；有時，一種病毒特異的CTL反應(yīng)可起到完全的保護(hù)作用而無需抗體反應(yīng)伴隨(Sastry等，1992；Bevan，1989；Lukacher，1984)?；诂F(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于抗HPV抗體，尤其是那些直接抗E7癌蛋白的抗體的廣泛增長和子宮頸疾病嚴(yán)重性之間的關(guān)系(Cason等，1992；Hamsikova等，1994；Jha等，1993)，表明了HPV特異的體液反應(yīng)可能不會對HPV相關(guān)的子宮頸疾病起到保護(hù)作用(Nakagawa等，1996)。另一方面，已經(jīng)報導(dǎo)帶有CMI缺陷個體的HPV相關(guān)子宮頸瘤的發(fā)病率增長，證明了T細(xì)胞參與控制人HPV相關(guān)的瘤的形成(Nakagawa等，1996；Tsukui等；1996；Feltkamp等，1993和Clerici等，1997)。在侵入性宮頸癌患者體內(nèi)，已經(jīng)觀察到IL-2產(chǎn)生量和對于促細(xì)胞分裂劑如PHA和伴刀豆球蛋白-A的增殖反應(yīng)的減少(Park等，1992)。已經(jīng)描述了大量體外和體內(nèi)策略從HPV-16的E6、E7肽，和LI蛋白鑒別誘導(dǎo)小鼠和人的T細(xì)胞活性的肽(Feltkamp等，1993；Strang等，1990；Tindel等，1991；Shepherd等，1992；Stauss等，1992；Kast等，1993)。典型地，誘導(dǎo)病毒特異的CTL可以通過感染表達(dá)病毒基因產(chǎn)物的病毒或重組病毒來實(shí)現(xiàn)。該病毒基因產(chǎn)物經(jīng)加工且以肽的形式存在于受感染細(xì)胞的表面，與MHCI類分子相結(jié)合，被CTL識別(Unanue，1989)。另外，研究也集中在引起病毒特異的CTL反應(yīng)的HIV肽的鑒別和描述上。Townsend等闡明了用蛋白質(zhì)中T細(xì)胞抗原決定基作為疫苗候補(bǔ)物質(zhì)的觀念，當(dāng)時他們的小組證明了流感核蛋白中的短合成肽作為抗原決定基對CTL反應(yīng)的作用(Townsend等，1986)。本發(fā)明者和其他人已經(jīng)報導(dǎo)了用合成肽體內(nèi)產(chǎn)生病毒特異的CTL(Kast等，1991；Aichele等，1990；Deres等，，1989；Sastry等，1992；Sastry等，1994；Casement等，1995)以抵抗流感，淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎，仙臺病毒和HIV。超過90％的宮頸癌表達(dá)人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7蛋白。這些獨(dú)特的抗原是開發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)用于抗癌免疫療法的理想目標(biāo)。相應(yīng)于HPV-16的E6和E7癌蛋白的合成肽已經(jīng)鑒別出來了，它對于體內(nèi)誘導(dǎo)HPV特異的CTL反應(yīng)是有效的(Sarkar等，1995)。最近，Nakagawa等報導(dǎo)了在許多沒有子宮頸損傷的處女和有性生活的婦女中，可檢測到針對HPV-16肽和蛋白的全身T細(xì)胞增殖反應(yīng)和CTL反應(yīng)，而在患有疾病的婦女體內(nèi)則檢測不出(Nakagawa等，1997)。類似地，Tsukui等報導(dǎo)了對HPV抗原的TH淋巴細(xì)胞反應(yīng)，尤其是IL-2的產(chǎn)生，在細(xì)胞學(xué)正常的婦女中比在有不同程度宮頸瘤進(jìn)程的婦女中要多(Tsukui等，1996)。而且，Clerici等發(fā)現(xiàn)，能潛在增強(qiáng)CMI的TH1細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)的產(chǎn)生在感染大量HPV的婦女體內(nèi)有缺陷，并且發(fā)現(xiàn)CIN的進(jìn)展與從TH1到TH2細(xì)胞因子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)變相關(guān)(Clerici等，1997)。使用長期體外刺激方案確定TH活性，Kadish等報導(dǎo)了對特定HPV肽的淋巴增殖反應(yīng)與HPV的清除和CIN的退化有關(guān)(Kadish等，1997)。另一方面，deGruijil等報導(dǎo)了針對HPV16E7肽的T細(xì)胞增殖反應(yīng)與HPV的持續(xù)感染相關(guān)，但是抗原特異的IL-2生產(chǎn)與病毒清除和宮頸損傷進(jìn)程均相關(guān)(deGruijil等，1996)。對于CIN患者的普通臨床治療方案包括切除或燒蝕治療。然而，進(jìn)一步的研究證明，有相當(dāng)數(shù)量的患者會復(fù)發(fā)。目前，在接受過針對CIN的燒蝕或切除治療的患者中，關(guān)于癌前期的或癌的生長，復(fù)發(fā)或康復(fù)狀況的發(fā)生不存在明確的認(rèn)識。需要更好且改進(jìn)的方法來有效治療與HPV相關(guān)的癌前期的或癌的生長和損傷疾病。發(fā)明概述本發(fā)明基于觀察到感染人乳頭瘤病毒(HPV)的患者對HPV的E6和/或E7肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答與其預(yù)后相關(guān)。對于泌尿生殖道，尤其對于子宮頸的癌前期的或癌的生長的發(fā)生，表現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答比那些不表現(xiàn)出細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的患者危險性減少；換句話說，尤其針對E6和/或E7肽顯示出陽性的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的患者，就發(fā)展HPV相關(guān)的癌前期的或癌的生長來說，會有良好的預(yù)后情況?；蛘哒f，一個對HPV的E6或E7蛋白質(zhì)化合物顯示無或低CMI反應(yīng)的患者，就HPV感染結(jié)果的生理性效應(yīng)而言，預(yù)后不良的危險性會更大。因而，本發(fā)明涉及鑒別患者有危險患HPV相關(guān)的高增殖性病情(包括疣，CIN和惡性腫瘤或其它癌前期的或癌的生長)的組合物和方法，；本發(fā)明尤其適于評價患者復(fù)發(fā)高增殖性病情的可能性。此處，術(shù)語“生長”和“損傷”可交替使用。并且，術(shù)語“癌前期的或癌的生長”指與HPV相關(guān)的生長。除子宮頸的癌前期的或癌的生長或損傷，這樣的腫瘤或損傷也可以出現(xiàn)在尿生殖道，包括會陰，陰戶和陰莖的瘤生長或損傷。適用于本方法的患者可以包括任何能夠感染HPV病毒的哺乳動物；在一些實(shí)施方案中，患者被特定為人，男性或女性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能確定感染人乳頭瘤病毒的患者發(fā)展或復(fù)發(fā)癌前期的或癌的生長的可能性的方法。在一些案例中，患者已經(jīng)治療了瘤生長。該方法包括以下步驟從患者體內(nèi)獲得樣品，用至少一種HPV的E6或E7肽溫育該樣品；以及測定樣品針對這些肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答。對E6或E7肽或其組合有細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，則表明比不顯示這一反應(yīng)的人，復(fù)發(fā)的危險性減少。在宮頸癌的發(fā)展中頻繁觀察到的一種前癌生長是宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變或CIN。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可適用于處于CIN任何階段(CIN1，CIN2，CIN3或鱗狀上皮內(nèi)損傷(SIL)，低度SIL(L-SIL)和高度SIL(HSIL))的患者。進(jìn)一步，在其它實(shí)施方案中，該方法可以適用于患有CIN以外的更嚴(yán)重的高增殖性生長的患者，如惡性或癌生長。在本發(fā)明中，術(shù)語“復(fù)發(fā)”是指癌前期的或癌的生長的出現(xiàn)，或最初生長的再現(xiàn)，或最初癌前期的或癌的生長在退化，消除，或治療之后的顯現(xiàn)。此處，術(shù)語“溫育”指將樣品露置或接觸含有肽的組合物。要求保護(hù)的方法適用于人乳頭瘤病毒的感染。所述人乳頭瘤病毒可以是高等級或高危型，如HPV16，18，31，45，56或58。在一些實(shí)施方案中，人乳頭瘤病毒是HPV16。在另一些實(shí)施方案中，人乳頭瘤病毒是中危型，如HPV33，35，37，51，52，59，66或68。更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，HPV是與疣相關(guān)的低危或低等型，如類型6，11，26，40，42，43，44，53，55，62，或66。所述樣品包括能夠引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，樣品是血液樣品或血清樣品，而在其它實(shí)施方案中，樣品通過灌洗，涂片或拭抹疑似感染或已感染的區(qū)域，如陰道，宮頸或陰莖的區(qū)域而獲得。外周血單核細(xì)胞(PBMC)能導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，且含有這種細(xì)胞的任何樣品也能用于本發(fā)明的方法。在一些實(shí)施方案中，考慮來自樣品的細(xì)胞在獲得之后和檢定之前在培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？紤]在檢定之前在培養(yǎng)基中該樣品可以培養(yǎng)1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多小時和多達(dá)1，2，3，4，5，6或7天，并多達(dá)1，2，3，4，5或更多星期，并且多達(dá)1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個月。也考慮細(xì)胞在檢定之前在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和/或在低于零攝氏度保藏。細(xì)胞自身或細(xì)胞培養(yǎng)上清液(培養(yǎng)液，不完整的細(xì)胞)可以用于隨后細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的分析。在一些實(shí)施方案中，先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞2-8小時(一些情況下6小時)，然后用流式細(xì)胞儀分析胞內(nèi)細(xì)胞因子。在其它實(shí)施方案中，先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞2天到20天(一些情況下15天)，然后用鉻釋放分析以確定細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。本發(fā)明的方法涉及確定患者是否顯示對HPV肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在個別實(shí)施方案中，所述肽是E6或E7肽，意味著它們的氨基酸序列在其長度上與E6或E7多肽的連續(xù)氨基酸序列具有至少90％的相同性。具體地，考慮使用5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多的SEQIDNO19(來自HPV16的E6)或SEQIDNO20(來自HPV16的E7)的連續(xù)氨基酸?？紤]在一些實(shí)施方案中，僅有一個序列的肽被檢測(如E6肽，或另一個實(shí)例，E7肽)，而在其他實(shí)施方案中，多序列可被檢測。在一個實(shí)施方案中，E6肽和E7肽在本發(fā)明中被使用。在其它實(shí)施方案中，至少兩個E6肽(指至少兩個不同的E6序列)，至少兩個E7肽(指至少兩個不同的E7序列)，或二者同時被檢測。可以考慮使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15或更多的E6或E7肽，也可以是任何E6或E7肽的組合。在更具體的方式中，E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，P10I，Q20P，R16R，或G10S，或其組合。在特定的實(shí)施方案中，以下的E6肽將單獨(dú)使用或作為包括以下一個或多個肽的混合物來使用，這些肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，或VIOC。而在其它實(shí)施方案中，E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C，或其混合物。在特定的實(shí)施方案中，以下的E7肽Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C單獨(dú)或作為混合物使用。此外，以下肽中包括至少一個E6肽和一個E7肽的混合物K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，Q19D，R9F，R9V，L9V或G10C。在一些實(shí)施方案中，特別考慮排除上述混合物中一個或多個肽。特別考慮涉及本發(fā)明診斷方法的組合物還可適用于本發(fā)明的預(yù)防和治療方法。本發(fā)明方法涉及抗人乳頭瘤病毒的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答。有不同的方法可以鑒別和評價細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(區(qū)別于血清或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，測定T細(xì)胞的增殖。T細(xì)胞增殖可通過測定氚化胸苷的摻入來分析。針對至少一個E6或E7肽的SI數(shù)值范圍等于或大于2.0的增殖反應(yīng)被認(rèn)為是陽性，它表示患者的癌前期的或癌的生長或損傷復(fù)發(fā)的危險減少。針對至少一個E6或E7肽的SI值等于或大于3.0的增殖反應(yīng)表明了細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，因此鑒定患者癌前期的或癌的生長方面改良的預(yù)后進(jìn)展。換句話說，SI低于2.0，包括SI值為零的患者被認(rèn)為對E6或E7肽具有低的或沒有細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并認(rèn)為他們的癌前期的或癌的生長有增加的發(fā)展或復(fù)發(fā)危險。細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答也可用非放射性方法如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)染料或還原測定法，這是一種活細(xì)胞(T細(xì)胞增殖)比色分析法(daCosta等，1999)，或alamarBlue分析法，它是另外一種測定IL-2-應(yīng)答性細(xì)胞的比色分析法(Gloeckner等，2001；Kwack等，2000)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，測定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括測量TH1或TH2細(xì)胞因子量。即使患者由T細(xì)胞增殖測定沒有顯示CMI應(yīng)答，復(fù)發(fā)增長的危險性仍與TH2細(xì)胞因子的產(chǎn)生相關(guān)，如IL-10。對E6和/或E7肽顯示產(chǎn)生TH1細(xì)胞因子的應(yīng)答的患者，如IFN-γ和IL-2，觀察到他們復(fù)發(fā)的危險性減少。在一些實(shí)例中，TH1細(xì)胞因子的量被測量，如IL-2，干擾素(IFN)γ，腫瘤壞死因子(TNF)α，或THF-β，IL-3，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17或IL-18。在一個具體的實(shí)施方案中，測量IL-18的量。在另外的實(shí)例中，測量TH2細(xì)胞因子的量，如IL-1，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-13或IL-14?？梢酝ㄟ^免疫測定法測定CMI應(yīng)答，如ELISA或放射免疫測定法或通過流式細(xì)胞儀。在一些實(shí)施方案中，來自患者的樣品可測試不止一次，以復(fù)份樣品或不同的測試。在一些實(shí)施方案中，來自患者的樣品可有多份。多份樣品可以是同類型的，如多份的血液樣品，或者它們可以是不同類型，如一份血液樣品和一份陰道拭擦樣品。適用于本發(fā)明方法的患者包括那些還沒有診斷出HPV但認(rèn)為有HPV的患者，曾經(jīng)感染有HPV但再也沒有顯示感染HPV征象的患者，已知感染了HPV的患者，在宮頸或其它泌尿生殖器區(qū)域或周圍有癌前期的或癌的生長，而她自己并不知道感染了HPV的患者，癌前期的或癌的生長已經(jīng)成功或不成功治療的患者，和至少一個癌前期的或癌的生長復(fù)發(fā)的患者。癌前期的或癌的生長或損傷是指生長不能控制的高增殖性細(xì)胞，包括前期瘤形成，如CIN和瘤形成(良性和惡性)，涉及鱗狀上皮細(xì)胞和不確定顯著的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)。考慮患者有不止一個腫瘤或損傷。任何腫瘤的治療既涉及外科(燒蝕或切除)手術(shù)，又涉及抗HPV的常規(guī)癌癥治療。這種治療包括化學(xué)療法，放射療法，激素療法，免疫療法，施用磷酸膽堿鈣，Thiovir，thiovir類似物(BioKeys)，podofilox，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，或5氟尿嘧啶(5-FU)，損傷內(nèi)或intransal干擾素，Imiquimid霜劑。燒蝕技術(shù)包括使用液氮，電炙或電解剖，外科切除，或激光技術(shù)。成功的治療指完全除去任何腫瘤征象的治療，而部分成功治療指影響腫瘤使其大小或生長率變小，或防止腫瘤的增大，或如果有多個腫瘤，減少腫瘤生長的數(shù)量。曾經(jīng)感染HPV的患者隨后可以不顯示HPV感染的跡象。然而，相信這樣的患者仍然經(jīng)受癌前期的或癌的生長復(fù)發(fā)的可能，象連續(xù)感染HPV征象的患者。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，評價了患者是否確定感染HPV。具體的，也包括HPV的血清型鑒定或其成為最初確定感染的部分。進(jìn)一步實(shí)施方案中，評價了患者是否有癌前期的或癌的生長，如果是癌癥，評價腫瘤為良性還是惡性。本發(fā)明的方法包括其中在治療癌前期的或癌的生長至少一個月后，從患者獲得樣品的實(shí)施方案?；颊呖梢詫χ辽僖粋€癌前期的或癌的生長接受治療，如通過某些形式的燒蝕。本發(fā)明也包括跟本發(fā)明的診斷方法一起使用的治療方法。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，癌前期的或癌的生長的復(fù)發(fā)進(jìn)展危險性增加的患者被鑒別?？梢圆捎迷诨颊弑徽J(rèn)為具有增長的危險性之前未考慮的措施。在一些實(shí)施方案中，對沒有另外被治療的患者進(jìn)行抗癌前期的或癌的生長的預(yù)防性治療或進(jìn)行經(jīng)常性檢查，或二者同時進(jìn)行。預(yù)防性治療是對缺乏癌前期的或癌的生長生理性病征時進(jìn)行的治療；“治療方法”包括對患者顯示的生理情況進(jìn)行內(nèi)科治療。預(yù)防性治療包括如上所述的，對HPV感染和與HPV相關(guān)的癌前期的和癌的生長治療的使用。在一些實(shí)施方案中，防御或減少癌前期的和癌的生長進(jìn)展危險的預(yù)防方法包括用本發(fā)明公開的HPV的E6和E7肽的免疫療法。如果患者被鑒定為對特別是E6或E7肽，或?qū)@些肽的組合具有低的或沒有細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，那么給患者施用E6或E7的肽序列，用以引發(fā)CMI應(yīng)答。這些肽包括任何E6或E7肽，尤其包括表3的全部或部分肽。并且，來自E6或E7多肽的肽，如本發(fā)明診斷方法中所論述的，也可以在預(yù)防性方法中施用?？紤]患者施用含有一或多種肽序列的組合物，在一些實(shí)施方案中，還包括輔藥，基于脂質(zhì)體的組合物，或二者。在其它實(shí)施方案中，患者不止一次被施用肽。在一些實(shí)施方案中，對感染了HPV的患者有一種通過用本發(fā)明方法中公開的方法鑒定患者有危險復(fù)發(fā)HPV相關(guān)腫瘤生長的防止癌前期的或癌的生長(如CIN)復(fù)發(fā)的方法；以及防止或治療任何復(fù)發(fā)的方法。治療方法包括外科手術(shù)(燒蝕或切除術(shù))，以及上述常規(guī)抗HPV的癌癥治療方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法是至少包括上述一個來自HPV的E6或E7肽的免疫療法治療。此外，本發(fā)明還包括確定曾感染有HPV并治療腫瘤生長的患者體內(nèi)癌前期的或癌的生長的復(fù)發(fā)可能性的試劑盒，該試劑盒在適當(dāng)?shù)脑噭┤萜髦邪ㄖ辽僖粋€來自HPV的E6或E7肽，和能夠檢測針對肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體附著在不起反應(yīng)的結(jié)構(gòu)上，樣品施加于其中，如帶有孔的板。在另一些實(shí)施方案中，不起反應(yīng)的結(jié)構(gòu)具有膜，這種膜能粘貼或附著在該結(jié)構(gòu)上。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可用于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測定來檢測，一些實(shí)施方案中，測定細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的數(shù)量。在另一些實(shí)施方案中，試劑盒包括一種本發(fā)明公開的抗TH1或TH2細(xì)胞因子抗體。其它方式包括檢測所含抗體的檢測試劑。檢測試劑是任何能檢測另一化合物的化合物，包括能在視覺上檢測的試劑，如比色檢測試劑。權(quán)利要求和/或說明書中使用“一”與術(shù)語“包括”連接可表示“一種”但也有“一或多種”，“至少一種”，“一種或更多”的意思。本發(fā)明的其它目的，特征和有益效果將通過以下詳細(xì)的描述清楚表明。然而，應(yīng)該理解，說明本發(fā)明特殊實(shí)施方案的詳細(xì)描述和特殊實(shí)施例僅為描述而給出，因此屬于本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)的各種變更和更改，本領(lǐng)域技術(shù)人員從這一詳細(xì)描述都可清楚得到。附圖簡要說明以下附圖形成本說明書的一部分，并且成為本發(fā)明某方面的進(jìn)一步說明。通過參考這些附圖的一幅或多幅結(jié)合本發(fā)明的特殊實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明可以得到更好的理解。圖1A-B各不相同的四組被研究婦女的PBMC對不同E6和E7合成肽的增殖反應(yīng)。第1組婦女正常(CIN(-)/HPV(-)，n＝6)，第2組婦女剛診斷為HPV相關(guān)的CIN(CIN(+)/HPV(+)，n＝31)，第3組是療后無疾病(Recur(-)，n＝22)，且第4組是有疾病復(fù)發(fā)的(Recur(+)，n＝10)。測定來自四個不同組婦女的PBMC對來自HPV-16的癌蛋白E6或E7的肽的增殖反應(yīng)。A.顯示了每個患者對各種被測肽的刺激指數(shù)(SI)值，該值是根據(jù)3[H]胸腺嘧啶摻入肽處理過的樣品超過培養(yǎng)基對照的倍數(shù)的增加來計(jì)算。B.各組對E6，E7肽或這兩種肽的陽性反應(yīng)的匯總。組數(shù)表示于x軸上，而陽性反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)表示于y軸上。圖2A-D.第3組(Recur(-))和第4組(Recur(+))對來自HPV-16癌蛋白E6和E7的合成肽的PBMC的增殖反應(yīng)。檢測這些組婦女的PBMC相對對照肽(對照)的，分別針對來自HPV-16癌蛋白E6和E7的7和8肽的增殖反應(yīng)。顯示表現(xiàn)SI值的代表數(shù)據(jù)，它們分別來自第3組(圖A和B)和第4組(圖C和D)的兩位患者。圖3.第3組婦女的PBMC對所選E6和E7肽刺激響應(yīng)的TH1細(xì)胞因子生產(chǎn)。第3組(Recur(-))和第4組(Recur(+))婦女的PBMC在E6肽Q15L和E7肽Q19D的存在下培養(yǎng)兩天，并且通過ELISA在各自的上清液中檢測各種TH1(IL-2，IFN-γ，IL-12)和TH2(IL-4，IL-10)細(xì)胞因子的存在。經(jīng)與培養(yǎng)基對照調(diào)節(jié)后，顯示第3和4組各被測患者產(chǎn)生的細(xì)胞因子數(shù)量。說明性實(shí)施方案的描述人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要危險因素，并且強(qiáng)的HPV-特異的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和CIN較小嚴(yán)重程度之間有關(guān)聯(lián)。對于CIN患者的普通臨床治療策略包括切除或燒蝕治療，然而隨后的研究表明相當(dāng)數(shù)量的患者經(jīng)歷了復(fù)發(fā)。目前，對于這些患者的病情復(fù)發(fā)或無病情況并沒有明確的認(rèn)識。對感染，沒有感染和復(fù)發(fā)患者而言，對CIN的預(yù)測和治療或預(yù)防性治療是關(guān)鍵。多數(shù)治療方法已經(jīng)試驗(yàn)并實(shí)施，但是它們還不能排除疾病或防止疾病復(fù)發(fā)。有相當(dāng)數(shù)量的患者CIN復(fù)發(fā)，但是還沒有可測試復(fù)發(fā)可能性的方法。本發(fā)明提供了一種確定CIN復(fù)發(fā)可能性的方法，該方法作為感染HPV并治療CIN患者的預(yù)后性和生物標(biāo)記物。該方法涉及檢測和分析針對HPV癌蛋白肽，如E6和E7，的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。該方法也幫助鑒別有復(fù)發(fā)CIN危險的感染有HPV的患者。進(jìn)一步，本發(fā)明利用定向傳輸系統(tǒng)，試劑盒和免疫療法來防止CIN復(fù)發(fā)并診斷有高度危險患CIN的患者。I.HPV在宮頸瘤形成和癌癥發(fā)展階段，人乳頭瘤病毒(HPV)先被作為一種重要的輔因子鑒別出來。然而感染HPV并不足以導(dǎo)致宮頸癌。并不是所有感染HPV的女性都會發(fā)展成宮頸癌。婦女通常治療在每年的巴氏(Pap)涂片中檢測到的宮頸發(fā)育異常疾病。盡管存在巴氏涂片檢測，流行病學(xué)研究繼續(xù)暗示HPV是產(chǎn)生宮頸瘤和癌癥僅有的最大危險因素。宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的一種宮頸癌。HPV與宮頸癌的發(fā)展相關(guān)，尤其是HPV型16，18，31，45，56和58。它們構(gòu)成HPV的高級型/高危型。中級/中危型包括HPV33，35，37，51，52，59，66和68。其它與疣相關(guān)的低級/低危型是類型6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，62和66。這些低級型性質(zhì)上不是惡性的。HPV基因組目前以游離基因形式(不完整的，環(huán)狀的)存在于CIN中，而在侵入性宮頸癌中，基因組通常完整地整合到宿主DNA中。HPV的高危型表達(dá)的E6和E7癌蛋白對于宮頸鱗狀上皮的惡性轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用，因?yàn)樗鼈兡軌蚪Y(jié)合然后失活兩個重要腫瘤抑制基因，p53和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(Rb)。這些腫瘤抑制蛋白的失活成為HPV致癌潛力的關(guān)鍵因素。A.宮頸癌的診斷和治療人乳頭瘤病毒被鑒定為與宮頸癌的發(fā)展有關(guān)，宮頸癌是宮頸上皮瘤(CIN)經(jīng)若干階段表現(xiàn)出惡性狀況。盡管存在巴氏涂片檢測，流行病學(xué)研究連續(xù)暗示HPV是發(fā)展CIN僅有的最大危險因素，許多研究繼續(xù)尋找能夠幫助鑒別處于CIN危險中的感染HPV的婦女的宿主和/或病毒標(biāo)記物。與此同等重要的是經(jīng)過治療的患者復(fù)發(fā)CIN的可能性。對經(jīng)過切除或燒蝕治療的患者跟蹤研究表明有相當(dāng)數(shù)量的患者復(fù)發(fā)。因此，能夠評價CIN復(fù)發(fā)可能性是非常重要的。預(yù)知復(fù)發(fā)可允許醫(yī)生考慮預(yù)防或治療的選擇。自從二十世紀(jì)八十年代初，HPV與宮頸癌相關(guān)的首次報導(dǎo)出現(xiàn)以來(zurHausen，1994)，人們已經(jīng)普遍承認(rèn)了高危HPV型有助于侵襲前的上皮內(nèi)損傷到癌癥的啟動和進(jìn)展。事實(shí)上，已經(jīng)注意到，在Pap涂片上明顯的細(xì)胞病理中HPV感染達(dá)到頂點(diǎn)，其特征為相關(guān)核異型性的核周清除(Kurman等，1994)。在修訂的Bethesda術(shù)語中，這些HPV改變與輕度發(fā)育不良結(jié)合定義為LSIL(Kurman和Solomon，1994)。HPV試驗(yàn)的有效性是復(fù)雜的，因?yàn)樾枰獏^(qū)分低危(L-SIL)和高危(H-SIL)HPV型(僅有后者引起與發(fā)育異?！┻M(jìn)展相關(guān)的重要危險)，和實(shí)際的進(jìn)展危險。在以前的病例中，新的針對HPV的雜種捕獲檢測區(qū)分了高危HPV型(Sherman等，1995；Poijak等，1999；Clavel等，2000)。除了本發(fā)明的方法，DNA圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)也可用來診斷處于宮頸損傷的患者(Lorenzato等，2001)。1.巴氏涂片在過去的五十年中，巴氏涂片(PapaniclaouSmear，″PapSmear″)已經(jīng)成為減少宮頸癌死亡率的基礎(chǔ)。巴氏涂片是有效的，因?yàn)樗荑b別出宮頸癌的最早期階段。目前估算，在美國每年要做6-7千萬個巴氏涂片。巴氏涂片因此成為檢驗(yàn)宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)。盡管它在醫(yī)學(xué)界有廣泛的可接受性，但研究表明巴氏涂片篩選未能發(fā)現(xiàn)50-80％的低級癌損傷和甚至15-30％的高級癌損傷。任何細(xì)胞學(xué)診斷方法的第一步是獲得合適的巴氏涂片細(xì)胞來觀察。在常規(guī)的巴氏涂片試驗(yàn)，細(xì)胞學(xué)家檢測到了脫落細(xì)胞樣品，它們獲自宮頸內(nèi)襯刮下的細(xì)胞，涂抹細(xì)胞于載玻片，并用巴氏染料染色。細(xì)胞學(xué)家在染了色的涂片上檢測到異常形態(tài)的細(xì)胞，這表明存在惡性病癥。術(shù)語“惡性病癥”指存在發(fā)育異常，包括原位腺癌(AIS)，侵入性癌(CA)，腫瘤，或類似的惡性或腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明方法中，脫落細(xì)胞樣品來自有或沒有惡性病癥的患者。這些樣品可以通過旋轉(zhuǎn)宮頸取樣裝置獲得，如沿宮頸或陰道粘膜部分的擦拭簽，刮刀，或細(xì)胞刷以獲得細(xì)胞樣品。合適的樣品應(yīng)含帶有鱗狀和/或腺細(xì)胞的宮頸內(nèi)膜細(xì)胞。脫落細(xì)胞樣品通常涂于載玻片，在載玻片表面形成一薄層樣品。然而，手工操作觀察細(xì)胞異?；蜃詣踊治黾?xì)胞學(xué)物質(zhì)可以通過在樣品載玻片上制備“單層”細(xì)胞來優(yōu)化。“單層”的定義實(shí)質(zhì)上是均勻分布的細(xì)胞物質(zhì)的二維的層，主要由單個細(xì)胞和小細(xì)胞簇組成。當(dāng)進(jìn)行巴氏涂片檢測時，婦科學(xué)家從宮頸表面收集到脫落細(xì)胞，并把它們置于載玻片上，交給細(xì)胞學(xué)家進(jìn)行進(jìn)一步檢測。然后細(xì)胞學(xué)家觀察置于載玻片上的細(xì)胞，并尋找異常細(xì)胞。如果發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞，則認(rèn)為該巴氏涂片為陽性。如果沒有異常細(xì)胞，則認(rèn)為該巴氏涂片為陰性。對于早期宮頸癌檢測，巴氏涂片篩選通常作為一種實(shí)用并經(jīng)濟(jì)的方法。在本發(fā)明中，通過Virapap/Viratype分析(TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)來確定HPV陽性。2.陰道鏡檢巴氏涂片處理設(shè)計(jì)為初期篩檢之用，而陰道鏡檢查及其相關(guān)方法通常用于確定巴氏涂片異常，癌癥等級和潛在癌損傷。自從1925年陰道鏡檢查被引進(jìn)以來，它作為經(jīng)巴氏涂片檢測有宮頸異?？赡苄曰颊叩暮罄^診斷方法，已經(jīng)被廣泛認(rèn)識。通常認(rèn)為利用陰道鏡檢查評價巴氏涂片異常的患者是非常有效的，因此它已成為西方社會對這種病情的醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)。在美國每年估計(jì)會進(jìn)行4百萬次陰道鏡檢查。3.熒光分光鏡檢查另一種檢測癌前期的和癌的生長或損傷的方法是熒光分光鏡檢查，其能快速的，非侵襲性的，定量探測出組織變?yōu)槟[瘤時，其生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)變化。腫瘤組織改變了的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)狀態(tài)反射為可測量的熒光的特性。美國專利6,258,576和6,135,965論述了宮頸鱗狀上皮(CIN)損傷的診斷并特別引入作為參考。3.癌前期的和癌的生長的治療治療意指腫瘤生長的消除，減少或延遲效果。癌生長可通過切除或燒蝕方法治療。除了下面將要詳細(xì)描述的免疫療法之外，也可以在本發(fā)明方法中使用以下治療或預(yù)防方法。i)化學(xué)療法癌癥療法還包括基于化學(xué)和放射治療兩者結(jié)合的多種組合療法。組合的化學(xué)療法，如順鉑(CDDP)，卡鉑，甲基芐肼，鹽酸氮芥，環(huán)磷酰胺，喜樹堿，異環(huán)磷酰胺，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，白消安，亞硝基脲(nitrosurea)，放線菌素D，紅比霉素，阿霉素，博來霉素，plicomycin，絲裂霉素，鬼臼亞乙苷(VP16)，他莫昔芬，雷洛昔芬，雌激素受體粘合劑，紫杉醇，gemcitabien，諾威本，法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，反鉑(transplatinum)，5氟尿嘧啶，長春新堿，長春滅瘟堿和氨甲蝶呤，或上述藥物的任何類似物或衍生物變異體。ii)放射療法其它導(dǎo)致DNA損傷的因素并廣泛使用的方法包括通常所說的γ射線，X射線和/或放射性同位素向腫瘤細(xì)胞定向的輸送。還包括其它形式的DNA損傷因素，如微波和UV照射。所有這些因素很可能影響大范圍的DNA損傷，前體DNA，和DNA的復(fù)制和修復(fù)，以及染色體的裝配和維持。X射線的劑量值從每日在50至200倫琴持續(xù)一段時間(3至4周)到2000至6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量值改變范圍很大，并且它依賴同位素的半衰期，放射的強(qiáng)度和類型，以及腫瘤細(xì)胞的吸收。當(dāng)用于細(xì)胞時，此處的術(shù)語“接觸”和“暴露于”描述的是治療的或診斷的肽或多核苷酸，或化學(xué)療法或放射性療法的試劑被送達(dá)靶細(xì)胞或直接與靶細(xì)胞并列放置的過程。為了獲得細(xì)胞致死或停滯，兩種試劑以有效殺死細(xì)胞或防止其分裂的結(jié)合總量送達(dá)細(xì)胞。iii)基因在另外一個實(shí)施方案中，次級治療采用基因療法，其中治療性多肽在本發(fā)明的嵌合多肽之前，之后或同時施用。嵌合多肽與編碼以下基因產(chǎn)物的第二載體結(jié)合的傳輸會在靶腫瘤上產(chǎn)生聯(lián)合的抗高增殖性效應(yīng)?；蛘?，可以使用編碼兩個基因的單個載體。本發(fā)明包括多種蛋白，包括細(xì)胞增殖誘導(dǎo)物(如生長因子受體)，細(xì)胞增殖抑制劑(如腫瘤抑制劑)，和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑。iv)燒蝕方法多數(shù)患有癌癥的人一般都要進(jìn)行一些類型的手術(shù)，包括預(yù)防性的，診斷性或分級的，治療或減輕性的手術(shù)。治療手術(shù)是對癌前期的或癌的治療方法，它可與其它療法結(jié)合應(yīng)用，如本發(fā)明所述的，化學(xué)療法，放射性療法，激素療法，基因療法，免疫和/或另外的療法。有療效的手術(shù)包括切除術(shù)，該手術(shù)中所有或部分的癌前期的或癌的組織被物理割除，切離，和/或破壞。腫瘤切除術(shù)指至少物理切除至少腫瘤的部分。除了腫瘤切除術(shù)，手術(shù)治療包括激光手術(shù)，冷凍手術(shù)，電外科手術(shù)和基因錯錄受控的手術(shù)(Mohs’surgery)。進(jìn)一步考慮本發(fā)明可聯(lián)合表面癌，前期癌或附帶一定正常組織的除去而使用。切除癌細(xì)胞，組織或腫瘤的所有和部分后，在體內(nèi)會形成一個腔。通過灌注，直接注射或在該區(qū)域局部施用另外的抗癌治療來完成治療。這樣的治療可以重復(fù)，如每1，2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3，4和5周，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個月。這種治療也可以改變劑量。v)其它藥劑也考慮其它藥劑與本發(fā)明的方法結(jié)合使用來改進(jìn)治療效果。這些附加藥劑包括免疫調(diào)節(jié)試劑，影響細(xì)胞表面受體和GAP連接的增量調(diào)節(jié)的藥劑，抑制細(xì)胞增長的和分化藥劑，細(xì)胞粘附抑制劑，或增加高增殖性細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感性的藥劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子，干擾素α，β，γ；IL-2和其它細(xì)胞因子；F42K和其它細(xì)胞因子類似物；或MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，以及其它趨化因子。進(jìn)一步還包括通過對高增殖性細(xì)胞建立自分泌或旁分泌效應(yīng)，細(xì)胞表面受體或它們的配體，如Fas/Fas配體，DR4或DR5/TRAIL，的增量調(diào)節(jié)能加強(qiáng)本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力。通過增加GAP連接數(shù)目增加細(xì)胞間信號傳導(dǎo)會提高相鄰高增殖性細(xì)胞群體的抗高增殖性效應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞生長抑制的或分化的藥劑可以與本發(fā)明聯(lián)合使用以提高該方法的抗高增殖效應(yīng)。還考慮使用細(xì)胞粘附抑制劑提高本發(fā)明的療效。考慮的細(xì)胞粘附抑制劑有粘著斑激酶(FAKs)抑制劑和洛伐他汀。此外還包括增加高增殖性細(xì)胞對凋亡的敏感性的其它試劑，如抗體c225可以結(jié)合本發(fā)明使用來提高療效。激素療法也可與本發(fā)明方法或上述其它任何癌癥療法結(jié)合使用。激素療法可用于治療某些癌癥如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌或?qū)m頸癌，以使某些激素，如睪丸素或雌激素的水平降低或阻止其作用。這種療法通常與至少一種其它癌癥療法結(jié)合使用，作為一種治療方法或減少轉(zhuǎn)移的危險性。v)抗病毒劑感染HPV的患者可以單獨(dú)使用抗病毒劑治療或與抗癌療法結(jié)合治療。“抗病毒劑”指一類組合物，它能防止或抑制病毒感染；防止或抑制病毒感染進(jìn)展；減少病毒的浸染性；防止，抑制或減少病毒感染的生理學(xué)癥狀；防止或減少病毒活化的發(fā)生率；抑制病毒宿主細(xì)胞；誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡；從全身或局部清除病毒；誘導(dǎo)病毒失活；或上述作用的任意結(jié)合。抗HPV劑包括施用如下藥物，磷酸膽堿鈣，Thiovir，thiovir類似物(BioKeys)，坡多非洛，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，5氟尿嘧啶(5-FU)，損傷部內(nèi)或intransal干擾素，或Imiquimid霜劑。其它試劑公開于美國專利6,245,568、6,238,659，和6,214,874。II.蛋白和肽的選擇、合成和應(yīng)用本發(fā)明中，肽被應(yīng)用于診斷和治療的方法。這些肽與HPV16癌蛋白相關(guān)。A.蛋白質(zhì)組合物在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的新的組合物，其至少包括一種如以下肽序列的蛋白質(zhì)分子SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，SEQIDNO13，SEQIDNO14，SEQIDNO15，SEQIDNO16，SEQIDNO17，SEQIDNO18，SEQIDNO19以及多肽SEQIDNO20和SEQIDNO21。此處，“蛋白質(zhì)分子”，“蛋白質(zhì)組合物”，“蛋白質(zhì)化合物”，“蛋白質(zhì)鏈”或“蛋白質(zhì)物質(zhì)”通常包括，但不限于，一種多于200個氨基酸的蛋白質(zhì)或從一個基因翻譯來的全長內(nèi)源性序列的蛋白質(zhì)；多于約100個氨基酸的多肽，和/或來自約3至約100個氨基酸的肽。上述所有的“蛋白質(zhì)”術(shù)語可在此交替使用。在某些實(shí)施方案中，至少一種蛋白質(zhì)分子包括的氨基酸長度是，但不限于，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1750，2000，2250，2500或更多氨基分子殘基，以及其中任何可變范圍。本發(fā)明的肽包括4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或直到包括100個來自SEQIDNOS1-21的相鄰氨基酸。SEQIDNOS1-10的肽來自HPV的E6多肽，SEQIDNOS11-19的肽來自HPV的E7多肽。SEQIDNOS20和21分別是來自HPV癌蛋白E6和E7的多肽。HPV16中E6的GenBank編號為AF327851(SEQIDNO26)，HPV16中E7的編號為U76404(SEQIDNO27)，它們都特別引入作為參考。根據(jù)表3可知，特別考慮作為本發(fā)明一部分的肽包括以下的E6肽K9L(SEQIDNO26的氨基酸18-26)，E10I(SEQIDNO26的氨基酸23-34)，C10R(SEQIDNO26的氨基酸37-46)，Q15L(SEQIDNO26的氨基酸43-57)，VIOC(SEQIDNO26的氨基酸49-58)，P9L(SEQIDNO26的氨基酸66-74)，P10I(SEQIDNO26的氨基酸102-111)，Q20P(SEQIDNO26的氨基酸97-116)，R16R(SEQIDNO26的氨基酸131-146)，G10S(SEQIDNO26的氨基酸141-150)，或其組合。根據(jù)表3，進(jìn)一步可知，特別考慮作為本發(fā)明的一部分的肽包括如下E7肽T10Q(SEQIDNO27的氨基酸7-15)，M9T(SEQIDNO27的氨基酸12-20)，D9L(SEQIDNO27的氨基酸14-22)，Q19D(SEQIDNO27的氨基酸44-62)，R9F(SEQIDNO27的氨基酸49-57)，R9V(SEQIDNO27的氨基酸66-74)，L9V(SEQIDNO27的氨基酸82-90)，G10C(SEQIDNO27的氨基酸85-94)，D20C(SEQIDNO27的氨基酸75-94)，或其組合。此處，“氨基分子”指任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的氨基酸，氨基酸衍生物或氨基酸類似物。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)分子的殘基是連續(xù)的，不存在任何非氨基分子中斷氨基分子殘基的序列。在其它實(shí)施方案中，所述序列可以包括一個或多個非氨基分子部分。在特定的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)分子的殘基序列可以被一個或多個非氨基分子部分中斷。因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)組合物”包括氨基分子序列，該序列含有存在于天然合成蛋白質(zhì)中20個普通氨基酸的至少一個氨基酸，或包括但不限于下表1所示的至少一個修飾的或非常見的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組合物包括至少一種蛋白質(zhì)，多肽或肽。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組合物包括一種生物相容的蛋白質(zhì)，多肽或肽。此處所用的術(shù)語“生物相容的”指以這里描述的方式和劑量施用或用藥到給定的生物體時，不產(chǎn)生明顯的不適反應(yīng)。生物體包括，但不限于，這樣的不適或不利反應(yīng)例如顯著毒性或不利的免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有生物相容的蛋白質(zhì)，多肽或肽的組合物通常是哺乳動物蛋白或肽或合成的蛋白或肽，它們基本上不含毒素，病原體或有害免疫原。蛋白質(zhì)組合物也可由任何本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備，包括通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)，多肽或肽，從天然源料中分離蛋白質(zhì)化合物，或化學(xué)合成蛋白質(zhì)物質(zhì)。不同基因的核苷酸和蛋白質(zhì)，多肽和肽序列已經(jīng)公開了，并可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫獲得。其中一個數(shù)據(jù)庫是美國國家生物技術(shù)信息中心Genbank和GenPept數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)?？梢杂帽景l(fā)明公開的技術(shù)或本領(lǐng)域公知的技術(shù)對這些已知基因的編碼區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和/或表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組合物可以為純化的。通?！凹兓摹敝附?jīng)分級分離除去不同的其它蛋白質(zhì)，多肽，或肽的某一特定蛋白質(zhì)，多肽，或肽組合物，并且該組合物基本仍保持其活性，并可測定，如通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，針對特殊的或目的蛋白質(zhì)，多肽或肽的蛋白質(zhì)測定。事實(shí)上可以使用含有任何蛋白質(zhì)，多肽或肽的成分用于本發(fā)明的組合物和方法。然而，蛋白質(zhì)物質(zhì)優(yōu)選為生物相容性的。在某些實(shí)施方案中，考慮形成更粘的組合物有利于組合物更加精確或更易施用于組織，并在整個過程中保持接觸組織。在這種情況下，考慮使用肽組合物，或更優(yōu)選地，使用多肽或蛋白質(zhì)組合物。粘度范圍包括，但不限于，大約40至100泊。在某些方面，優(yōu)選粘度為80至100泊。B.肽的選擇，合成和使用根據(jù)與現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述的已知T細(xì)胞表位相關(guān)的兩親性結(jié)構(gòu)和信息，選擇與HPV16的E6和E7癌蛋白相應(yīng)的肽序列。本發(fā)明的肽可以按照常規(guī)方法在溶液中或固體支持物上合成。各種自動合成器可以通過商業(yè)獲得并按照已知的步驟使用。通常，長度小于100個殘基的小的合成的肽序列通常通過逐步的固相合成法制備。這種固相合成法利用不溶性樹脂支撐低聚物的生長。預(yù)定包含目的聚合物的亞基序列在支持物上依次共同反應(yīng)。在起始反應(yīng)中末端氨基酸直接或通過連接劑連結(jié)在固體支持物上。該末端殘基依次與一系列進(jìn)一步的殘基如氨基酸類或阻斷的氨基酸部分反應(yīng)，以得到通過該末端殘基附著在固相物上的生長的寡聚體。在合成方案的每一步，未反應(yīng)的反應(yīng)物被洗掉或從與固相接觸中除去。這一循環(huán)以預(yù)選殘基序列一直持續(xù)直到所需聚合物完全形成，但仍保持與固相接觸。然后從固相支持物上切割該聚合物并純化有待使用。上述的常規(guī)合成方案是由R.B.Merrifield發(fā)明并用于制備某些肽(Merrifield，1986)。這些肽可以在改良的Vega250自動肽合成器中合成(VegaBiochemicals，Tucson，AZ)或利用Houghten提及的“口袋法”(″bagmethod″)合成(Houghten，1985)。也可參見，如Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；和Barany和Merrifield(1979)，這些都在此處引入作為參考。符合所述所選區(qū)域的短肽序列，或重疊肽的文庫，通常由6至35到50個氨基酸組成，能容易地合成，并且然后通過設(shè)計(jì)用來鑒定反應(yīng)肽的篩選方法進(jìn)行篩選。本發(fā)明包括SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11，SEQIDNO12，SEQIDNO13，SEQIDNO14，SEQIDNO15，SEQIDNO16，SEQIDNO17，SEQIDNO18，SEQIDNO19和SEQIDNO20，SEQIDNO21中至少含有4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或多達(dá)約100個連續(xù)的氨基酸殘基的肽。本發(fā)明使用的組合物可包括一種經(jīng)修飾能增強(qiáng)其活性或使其具有生物防護(hù)性的肽。如美國專利5,028,592(引入本申請作為參考)中公開的，生物防護(hù)性肽與非防護(hù)性肽相比在給病人施用時具有某些優(yōu)點(diǎn)，防護(hù)性肽通常顯示出增強(qiáng)的藥理學(xué)活性。用于本發(fā)明的組合物也可包含包括有所有L-氨基酸，所有D-氨基酸，或其混合物的肽。使用D-氨基酸可以對天然存在于人體的蛋白酶具有額外的抗性并且具有較少的免疫原性，因此預(yù)期能具有較長的生物半衰期。III.蛋白質(zhì)純化來自HPV的肽和蛋白質(zhì)可以通過多種方法純化。通常，“純化”是指經(jīng)分級除去各種其它的蛋白質(zhì)，多肽或肽的特定的蛋白質(zhì)，多肽或肽組合物，該組合物基本仍保持其活性，可通過如下文所述的蛋白質(zhì)測定，或通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法評估目的蛋白質(zhì)，多肽或肽。蛋白質(zhì)純化技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些技術(shù)在一個水平上包括，粗分級細(xì)胞成分與多肽和非多肽部分。從其它蛋白中分離出多肽后，可利用層析和電泳技術(shù)對目的多肽進(jìn)一步純化，達(dá)到部分或完全純化(純化至均質(zhì))。尤其適合制備純肽的分析方法是離子交換層析，排阻層析；聚丙稀酰胺凝膠電泳；等電聚焦電泳。尤其有效的純化肽的方法是快速蛋白液相層析或甚至是HPLC。本發(fā)明的某方面涉及純化，在特定的實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì)上涉及純化編碼的蛋白質(zhì)和肽，尤其來自E6或E7癌蛋白的肽。本發(fā)明使用的術(shù)語“純化的蛋白質(zhì)或肽”是指一種可從其它組分分離的成分，其中蛋白質(zhì)或肽純化到相對于其天然狀態(tài)的任何程度。因此純化的蛋白質(zhì)或肽也指離開其天然環(huán)境的蛋白質(zhì)或肽。通常，“純化的”指經(jīng)分級分離去除各種其它成分的蛋白質(zhì)或肽組合物，這些組合物實(shí)質(zhì)上仍保持其表達(dá)的生物活性。而術(shù)語“基本純化的”的使用，指蛋白質(zhì)或肽形成該組合物的主要成分，如占該組合物的蛋白質(zhì)的約50％，約60％，約70％，約80％，約90％，約95％或更多。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解定量蛋白質(zhì)或肽的純度的不同方法。這些方法包括，如確定一個活性級分的特定活性，或通過SDS/PAGE分析評估一個級分中的多肽數(shù)量。評估一個級分純度的優(yōu)選方法是算出這個級分的特定活性，將其與初提取物中的特定活性相比較，從而算出純度，此處通過“純化倍數(shù)”(-foldpurificationnumber)估值。當(dāng)然用來體現(xiàn)活性值的真實(shí)單位有賴于純化之后選擇的特定分析技術(shù)，以及表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽是否顯示可檢測的活性。各種適用于蛋白質(zhì)純化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些技術(shù)包括，如，用硫酸銨，PEG，抗體等沉淀，或通過加熱變性，然后離心；層析步驟如離子交換，凝膠過濾，反相，羥磷灰石，和親水層析；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術(shù)和其它技術(shù)的結(jié)合。正如本領(lǐng)域所公知的，可改變實(shí)施各純化步驟的順序，或可省略某些步驟，仍能得到基本純化的蛋白質(zhì)或肽的合適方法。通常不需要總是提供最純凈狀態(tài)的蛋白質(zhì)或肽。事實(shí)上，在某些實(shí)施方案中，基本不純的產(chǎn)物也具有可利用性。部分純化可以聯(lián)合使用較少的純化步驟，或使用相同常規(guī)純化方案的不同形式來完成。如，利用HPLC裝置進(jìn)行陽離子交換柱層析分離相比利用低壓層析系統(tǒng)的同樣技術(shù)通常會導(dǎo)致更高級別的純化。顯示相對較低純化程度的方法對于蛋白產(chǎn)物的總回收或保持所表達(dá)的蛋白的活性是有利的。已知多肽的遷移隨著SDS/PAGE的不同情況而變，有時會很明顯(Capaldi等，1977)。因此在不同的電泳條件下，須知純化的或部分純化的表達(dá)產(chǎn)物所表現(xiàn)的分子重量會不同。高效液相層析(HPLC)表征為具有非凡的峰分辨率的非?？焖俚姆蛛x。這是通過使用非常精細(xì)的微粒和高壓來保持足夠的流速達(dá)到的。分離可以在大約幾分鐘或至一小時內(nèi)完成。此外，只需要很少量的樣品，因?yàn)槲⒘７浅Ｐ∏姨畛涿軐?shí)，柱床體積中只有很小的部分是空隙體積。而且樣品的濃度也不需要很高，因?yàn)樽V帶很窄，樣品僅有很小的擴(kuò)散。凝膠層析或分子篩層析是基于分子大小的一種特殊類型的分離層析方法。凝膠層析法分離技術(shù)所依據(jù)的理論是，所述柱由含有小孔的惰性物質(zhì)微粒制成，當(dāng)溶液通過或路過孔隙時，柱根據(jù)分子大小將大分子物質(zhì)從小分子物質(zhì)中分離出來。只要微粒制成的物質(zhì)不吸收分子，決定流速的唯一因素就是分子大小。因此，只要性狀相對不變，分子按照減小的大小順序從柱中洗脫。對于分離不同大小的分子，凝膠層析是最好的，因?yàn)樵摲蛛x不依賴其它所有因素，如PH，離子強(qiáng)度，溫度等。并且該方法不存在吸收，較少有區(qū)帶擴(kuò)散，洗脫體積與分子量簡單相關(guān)。親和層析是一種依賴于被分離物質(zhì)與它能特定結(jié)合的分子之間的特定親和力的層析操作。這是一種受體-配體型相互作用。柱材料通過將其中的結(jié)合伙伴之一共價結(jié)合到不溶基質(zhì)上而合成。然后柱材料能特定吸附溶液中的物質(zhì)。通過將條件改為不發(fā)生結(jié)合的情況而發(fā)生洗脫(如改變PH，離子強(qiáng)度和溫度)。用于純化含糖化合物的特殊型親和層析是凝集素親和層析。凝集素是能結(jié)合各種多糖和糖蛋白的一類物質(zhì)。凝集素通常通過溴化氰連結(jié)到瓊脂糖上?！芭悸?lián)葡聚糖的伴刀豆球蛋白A”是第一種應(yīng)用并已廣泛應(yīng)用于分離多糖和糖蛋白的這類物質(zhì)，其它凝集素包括扁豆凝集素，用于純化N-乙酰葡糖胺殘基小麥胚芽凝集素和蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)凝集素。凝集素自身用帶有糖配體的親和層析方法純化。乳糖已用于從蓖麻子和花生中純化凝集素；麥芽糖用于從扁豆和刀豆中提取凝集素；N-乙酰-D半乳糖胺用于從大豆中純化凝集素；N-乙酰葡糖胺從小麥胚芽中結(jié)合凝集素；D-半乳糖胺用于從蛤和L-巖藻糖從蓮中結(jié)合凝集素?；|(zhì)應(yīng)是一種自身不以任何明顯度吸收分子并具寬范圍的化學(xué)，物理和熱穩(wěn)定性的物質(zhì)。配體應(yīng)以不影響其結(jié)合性的方式被偶聯(lián)。配體也應(yīng)提供相對緊密的結(jié)合。洗脫該物質(zhì)時應(yīng)盡可能不損傷樣品或配體。最常見的親和層析之一是免疫親和層析。適合用于本發(fā)明的抗體的生產(chǎn)在下文中論述。IV.核酸A.篩選DNA在本發(fā)明中，核酸篩選不僅用于篩選受感染的樣品，而且用于發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的可能性。依賴核酸雜交的篩選方式使得可能從任何生物體中分離任何基因序列，只要有適合的探針。與一部分編碼目的蛋白質(zhì)的序列相應(yīng)的寡核苷酸探針可以用化學(xué)法合成。這需要知道短的寡肽的氨基酸序列。編碼蛋白質(zhì)的DNA序列能從遺傳密碼中推出，然而必須考慮該密碼的簡并性。當(dāng)序列簡并時有可能進(jìn)行混合加成反應(yīng)。包括變性雙鏈DNA的異質(zhì)性混合。對于這種篩選，雜交作用最好在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進(jìn)行。雜交是在檢測cDNA克隆中尤為有用，其中cDNA克隆源于存在有極少量與目的多肽有關(guān)的mRNA序列的來源。換句話說，通過利用避免非特異結(jié)合的嚴(yán)緊雜交條件，有可能使得，如允許通過將靶DNA雜交混合物中與它完全互補(bǔ)的單個探針而自顯影特定cDNA(Wallace等，1981)。使用13到100個核酸的探針或引物，尤其是長度介于17至100個核酸的，或在本發(fā)明的一些方面，多達(dá)1至2千個堿基對或更長的探針或引物，可以形成既穩(wěn)定又有選擇性的雙鏈分子。通常優(yōu)選具有連續(xù)長度多于20個堿基的互補(bǔ)序列的分子，以增強(qiáng)所得雜交分子的穩(wěn)定性和/或選擇性。通常優(yōu)選設(shè)計(jì)用于雜交的核苷酸分子具有一個或多個含20至30個核苷酸或所需更長的互補(bǔ)序列。這樣的片段容易制備，如通過化學(xué)方法直接合成或通過將選擇性序列引入重組載體重組制得。因此，本發(fā)明的核酸序列根據(jù)其能力可用于選擇性形成具有DNA和/或RNA的互補(bǔ)序列的雙鏈分子，或?yàn)閺臉悠分袛U(kuò)增DNA或RNA而提供引物。根據(jù)使用需要，希望使用各種雜交條件獲得探針和引物對靶序列的不同等級的選擇性。對于需要高選擇性的應(yīng)用，典型地希望使用相對高度嚴(yán)緊的條件形成雜交物。例如，相對低鹽和/或高溫條件，如提供0.02M至約0.10M的NaCl濃度和約50℃至約70℃的溫度。這種高度嚴(yán)緊的條件幾乎不允許(如果存在的話)探針或引物與模板或靶鏈之間的錯配，特別適合分離特定基因或檢測特定mRNA轉(zhuǎn)錄。通過附加增加量的甲酰胺，可以致使條件更加嚴(yán)緊。對于某些應(yīng)用，如定點(diǎn)誘變，須知優(yōu)選使用較低嚴(yán)緊性的條件。在這種情況下，雖然雜交鏈的序列并沒有完全互補(bǔ)，也會發(fā)生雜交，只是在一個或多個位置錯配。通過增加鹽濃度和/或降低溫度，條件會變得不嚴(yán)緊。如，中等嚴(yán)緊程度的條件是0.1至0.25M的NaCl濃度在約37℃至約55℃，而低嚴(yán)緊度條件可以提供約0.15M至約0.9M的鹽濃度，和約20℃至55℃范圍的溫度。雜交條件可依據(jù)需要的結(jié)果方便的控制。在其它實(shí)施方案中，雜交可以在下述條件下進(jìn)行，如50mMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3mMMgCl2，1.0mM二硫蘇糖醇，溫度在約20℃至約37℃之間。其它使用的雜交條件包括約10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mMMgCl2，溫度范圍在約40℃至約72℃之間。在某些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明確定的核酸序列結(jié)合適當(dāng)?shù)姆椒?如標(biāo)記物)確定雜交是有利的。各種適當(dāng)?shù)闹甘緞楸绢I(lǐng)域公知，包括發(fā)熒光的，放射性的，酶的或其它配體的，如親和素/生物素，這些試劑能用于檢測。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宜使用熒光標(biāo)記物或酶標(biāo)記，如尿素酶，堿性磷酸酶或過氧化物酶，而不使用放射性的或其它對環(huán)境不利的試劑。在使用酶試劑的例子中，已知比色指示物能夠提供可看得見的或可分光光度檢測的檢測試劑，從而檢測同含互補(bǔ)核酸的樣品的特定雜交。通常，考慮這里描述的探針或引物在雜交溶液中作為試劑使用，如在PCRTM中，用于檢測相應(yīng)基因的表達(dá)，也用于利用固相的實(shí)施方案。在涉及固相的實(shí)施方案中，測試的DNA(或RNA)被吸收或粘貼到所選擇的基質(zhì)或表面上。該固定的單鏈核酸然后在所需條件下與所選的探針進(jìn)行雜交。這種條件的選擇取決于特定的環(huán)境(如取決于G+C的含量，靶核酸的類型，核酸的來源，雜交探針的大小等)。根據(jù)具體目的應(yīng)用來優(yōu)化雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。洗脫雜交分子去除非特異性結(jié)合的探針分子后，檢測雜交，和/或通過確定結(jié)合標(biāo)記的數(shù)量來定量。典型的固相雜交方法已經(jīng)公開于美國專利5,843,663、5,900,481和5,919,626中。其它可在本發(fā)明實(shí)踐中使用的雜交方法公開于美國專利5,849,481、5,849,486和5,851,772中。說明書這部分確定的這些或其它相關(guān)參考部分在此引入作為參考。B.合成DNA當(dāng)目的多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基全序列已知時，合成DNA序列是經(jīng)常選擇的方法。當(dāng)目的多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基全序列未知時，不可能直接合成DNA序，選擇的方法是合成cDNA序列。分離目的cDNA序列的標(biāo)準(zhǔn)程序是形成由質(zhì)?；蚴删w攜帶的cDNA文庫，該文庫獲自富含于供體細(xì)胞的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，該供體細(xì)胞具有高水平的基因表達(dá)。若使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)合成時，即使稀有的表達(dá)產(chǎn)物也能被克隆。在多肽氨基酸序列的主要部分已知的情況下，可以使用同靶cDNA中推定存在的序列的相同的已標(biāo)記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列的進(jìn)行DNA/DNA雜交，這種雜交對已變性為單鏈形式的cDNA的克隆的拷貝進(jìn)行。1.生物芯片在各種支持物上分離生物分子陣列(稱為生物芯片)的方法已經(jīng)發(fā)展并已用于DNA合成，測序，突變研究，基因表達(dá)分析和基因發(fā)現(xiàn)中。生物芯片可在本發(fā)明中使用，因?yàn)樗苁刮覀冭b定出病理狀態(tài)的標(biāo)記，在此是HPV感染，其可能具有后續(xù)診斷學(xué)價值。生物芯片的使用涉及將標(biāo)記的分子或分子集合雜交在生物芯片上固定的靶。標(biāo)記的分子通常是細(xì)胞或組織的mRNA的cDNA拷貝。在這種情況下，每種不同類型的cDNA的拷貝數(shù)反映了在最初分離物中相應(yīng)mRNA種類的拷貝數(shù)。通常，雜交到在生物芯片固定的靶上的強(qiáng)度與cDNA濃度成比例，因而雜交密度的測量能夠推算出最初分離物中mRNA的相對數(shù)量。不同mRNA分離物中相同mRNA的相對數(shù)量能通過比較兩個樣品之間的對該相同靶點(diǎn)的雜交密度來確定。這些測量方法可用于鑒別能具有后續(xù)診斷價值的特定細(xì)胞類型或病理狀態(tài)。或者，在給定的疾病中，特定mRNA的突然增加可能表明藥物攻擊的可能目標(biāo)，這樣提供了新的治療目標(biāo)。C.核酸擴(kuò)增反應(yīng)核酸分子可通過使用多種技術(shù)檢測，包括擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明包括使用這種擴(kuò)增反應(yīng)來檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或鑒別感染HPV和/或有癌前期的或癌的生長的患者。如，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能通過本發(fā)明公開的TH1或TH2細(xì)胞因子的RT-PCR檢測。1.聚合酶鏈反應(yīng)(PCRTM)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作方法(Sambrook，1989)，用作擴(kuò)增模板的核酸從生物樣品包含的細(xì)胞中分離。核酸可以是基因組DNA或部分或整體的細(xì)胞RNA。當(dāng)使用RNA時，需要將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。在允許選擇性雜交的條件下，選擇性雜交相應(yīng)于KATP通道蛋白質(zhì)或其突變體的核酸的引物對與分離的核酸相接觸。此處定義的術(shù)語“引物”包括在依賴模板的過程中能夠引發(fā)新生核酸合成的任何核酸。一般，引物是長度為10至20個堿基對的寡核苷酸，但也可使用更長的序列。引物可以單鏈或雙鏈形式供給，但優(yōu)選單鏈形式。一旦雜交，核酸引物復(fù)合物就接觸一個或多個促進(jìn)依賴模板的核酸合成的酶。多輪擴(kuò)增，也稱為“循環(huán)”被實(shí)施直到產(chǎn)生足夠數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。下一步，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些應(yīng)用中，檢測可通過可視的方法進(jìn)行。或者，檢測可涉及通過化學(xué)發(fā)光法，引入放射性標(biāo)記物的放射性閃爍法或熒光標(biāo)記法或甚至通過電或熱脈沖信號的方法(Affymax工藝)間接識別產(chǎn)物。許多依賴于模板的方法可以用來擴(kuò)增存在于給定模板樣品中的標(biāo)記序列。最著名的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(稱為PCRTM)，該方法已在美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159中詳細(xì)描述了，此處都完全引入作為參考。簡要地，在PCRTM中，制得互補(bǔ)于標(biāo)記序列的相反互補(bǔ)鏈區(qū)域的兩條引物序列。過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合酶(如Tap聚合酶)加入到反應(yīng)混合物中。如果標(biāo)記序列存在于樣品中，引物將結(jié)合標(biāo)記物，且聚合酶將通過增加核苷酸使引物沿著標(biāo)記序列延長。通過提高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物會從標(biāo)記物中分離出來形成反應(yīng)物，過量的引物將結(jié)合標(biāo)記物以及反應(yīng)物，并且重復(fù)該過程。為了量化mRNA擴(kuò)增數(shù)量或從目的mRNA制備cDNA，可以采用反轉(zhuǎn)錄酶PCRTM(RT-PCRTM)擴(kuò)增過程。反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA的方法是公知的并描述于Sambrook等，1989。可選擇的反轉(zhuǎn)錄方法利用耐熱的，依賴于RNA的DNA聚合酶。這些方法描述在1990年12月21日提交的WO90/07641中，此處引入作為參考。聚合酶鏈反應(yīng)是本領(lǐng)域公知的方法。2.其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)另一個擴(kuò)增方法是連接酶鏈反應(yīng)(″LCR″)，公開于EPANo.320308，此處全部引入作為參考。在LCR中，制備兩個互補(bǔ)探針對，在靶序列存在下，各對將結(jié)合靶序列相反的互補(bǔ)鏈?zhǔn)沟盟鼈兿噜?。在連接酶存在下，兩個探針對將連成單個序列。通過溫度循環(huán)(如同在PCR中)，結(jié)合的連接序列從靶上分離，然后作為“靶序列”連接過量的探針對。美國專利4,883,750描述了類似于LCR的方法以結(jié)合探針對到靶序列上。Qbeta復(fù)制酶也可用作本發(fā)明的另一種擴(kuò)增方法，該方法描述于PCT申請PCT/US87/00880中，此處全文引入作為參考。該方法中在RNA聚合酶存在時，將具有互補(bǔ)于靶的區(qū)域的RNA的復(fù)制序列加入到樣品中。聚合酶將拷貝該復(fù)制序列，其然后被檢測出。本發(fā)明還可使用了等溫擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸，該方法使用限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶完成靶分子的擴(kuò)增，所述靶分子在酶切位點(diǎn)的一條鏈上包含核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸。鏈置換擴(kuò)增(SDA)是進(jìn)行核酸等溫擴(kuò)增的另一方法，包括鏈置換和合成的多次循環(huán)，即切口平移。類似的方法，稱為修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)，包括在擴(kuò)增的靶區(qū)域中退火若干探針，然后在僅有四種堿基中的兩種堿基存在時發(fā)生修復(fù)反應(yīng)。另外兩種堿基可作為生物素化的衍生物被加入以便于檢測。類似的方法也應(yīng)用于SDA中。靶特異性的序列也可用循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)檢測。在CPR中，具有非特定DNA的3’和5’序列和特定RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交后，就用RNaseH處理反應(yīng)，且探針的產(chǎn)物鑒定為消化后釋放的不同產(chǎn)物。原始模板退火到另一個循環(huán)探針上，并重復(fù)反應(yīng)。還有另外的擴(kuò)增方法可用于本發(fā)明，這些方法公開于英國申請2202328和PCT申請PCT/US89/01025中，它們都全部引入本文作為參考。開始使用時，“修飾的”引物用于PCRTM類的，依賴模板和酶的合成。引物可通過標(biāo)記捕獲部分(如生物素)和/或檢測部分(如酶)來修飾。隨后的使用中，過量的標(biāo)記探針加入樣品中。靶序列存在下，探針結(jié)合并被催化切割。切割后，靶序列完整釋放以結(jié)合過量的探針。標(biāo)記探針的切割顯示了靶序列的存在。其它的核酸擴(kuò)增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SRGingeras等人，PCT申請WO88/10315，在此引入作為參考。在NASBA中，制備用于擴(kuò)增的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿提取，臨床樣品熱變性，用裂解緩沖液處理和小自旋柱分離DNA和RNA或氯化胍提取RNA。這些擴(kuò)增技術(shù)涉及將具有靶特定序列的引物退火。聚合之后，DNA/RNA雜交體被RnaseH消化，而雙鏈DNA分子再次加熱退火。在任一條件下，單鏈DNA通過添加第二靶特定引物完全雙鏈化，之后進(jìn)行聚合。然后雙鏈DNA分子通過RNA聚合酶如T7或SP6多重轉(zhuǎn)錄。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，然后該DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA，于是再次用RNA聚合酶如T7或T6轉(zhuǎn)錄。不論合成產(chǎn)物是截短的或完整的，都能指示靶特定序列。Davey等(EPANo.329822，此處全文引入作為參考)公開了一種核酸擴(kuò)增方法，其包括循環(huán)合成單鏈RNA(″ssRNA″)，ssDNA，和雙鏈DNA(dsDNA)，該方法可用于本發(fā)明。ssRNA是第一引物寡核苷酸的模板，它通過反轉(zhuǎn)錄酶延長(依賴RNA的DNA聚合酶)。然后通過核糖核酸酶H(RNaseH，一種特異于與DNA或RNA配對中的RNA的核糖核酸酶)的作用將RNA從所得DNARNA雙鏈體中去除。得到的ssDNA是第二引物的模板，也包括在其與模板的同源序列5’端的RNA聚合酶啟動子(以T7RNA聚合酶為例)的序列。該引物然后通過DNA聚合酶延長(以E.coliDNA聚合酶I的大″Klenow″片斷為例)，得到的雙鏈DNA(″dsDNA″)分子具有和最初引物之間的RNA相同的序列，此外在一端含有啟動子序列。通過適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶，該引物序列可用于制備該DNA的許多RNA拷貝。這些拷貝然后再進(jìn)入循環(huán)中導(dǎo)致非常迅速的擴(kuò)增。用適當(dāng)選擇的酶，這一擴(kuò)增能在等溫條件下進(jìn)行而不需在每個循環(huán)中添加酶。因?yàn)檫@一過程的循環(huán)本質(zhì)，起始序列可選擇為DNA或RNA形式之任一。Miller等(PCT申請WO89/06700，此處完全引入作為參考)公開了一種核酸序列擴(kuò)增方案，該方案基于雜交啟動子/引物序列到靶單鏈DNA(″ssDNA″)，然后轉(zhuǎn)錄該序列的許多RNA拷貝。該方案不循環(huán)，即不從合成的RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生新模板。其它擴(kuò)增方法包括″RACE″和″單側(cè)PCR″(Frohman，1990，引入作為參考)?；趦蓚€(或多個)寡核苷酸連接的方法也可以用于本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中，該方法在含有得到的“雙-寡核苷酸”序列的核酸存在的情況下擴(kuò)增雙-寡核苷酸。D核酸檢測經(jīng)過任何擴(kuò)增后，需要從模板和/或過量的引物中分離擴(kuò)增產(chǎn)物。核苷酸的檢測可用于鑒別細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，和感染HPV和/或有癌前期的或癌的生長的患者。在一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖，瓊脂糖丙稀酰胺或聚丙稀酰胺凝膠電泳用標(biāo)準(zhǔn)方法分離(Sambrook等，1989)?？蓮哪z中切下并洗脫來分離的擴(kuò)增產(chǎn)物。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，分離帶可通過加熱凝膠取出，然后提取該核酸。核酸分離也可利用本領(lǐng)域公知的層析分離技術(shù)。本發(fā)明的實(shí)例中可使用許多種層析技術(shù)，包括吸附層析，分配層析，離子交換層析，羥磷灰石層析，分子篩層析，反相層析，柱層析，紙層析，薄層層析，氣相層析和HPLC。在某些實(shí)施方案中，可顯現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。典型的顯現(xiàn)方法包括用溴化乙錠染色凝膠和在紫外光下的顯現(xiàn)條帶?；蛘?，如果用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的核苷酸整體標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，分離的擴(kuò)增產(chǎn)物可以暴光x-射線膠片或在合適的激發(fā)光譜下顯影。在一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物分離之后，標(biāo)記的核酸引物與擴(kuò)增的標(biāo)記序列接觸。該引物最好綴合發(fā)色團(tuán)，但也可放射性標(biāo)記。在另一個實(shí)施方案中，引物與結(jié)合伙伴綴合，如抗體或生物素，或其它帶有可檢測部分的結(jié)合伙伴。在特定的實(shí)施方案中，通過DNA印跡用標(biāo)記引物雜交進(jìn)行檢測。涉及DNA印跡雜交的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見Sambrook等，1989)。上述實(shí)例在美國專利5,279,721中已描述，其中公開了自動電泳和核酸轉(zhuǎn)移的儀器和方法，此處引入作為參考。允許電泳和印跡且不需要額外操作凝膠的儀器對于適合實(shí)施本發(fā)明方法是理想的。HPV感染也能通過催化放大DNA原位雜交比色信號而檢測(CSAC-ISH)(GenPointsystem，DAKO)(Birner等，2001)。其它用于實(shí)踐本發(fā)明核酸檢測的方法公開于美國專利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992，5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791中，均引入此處作為參考。V.細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)本發(fā)明要求保護(hù)的一些方法通過將T細(xì)胞應(yīng)答用作復(fù)發(fā)診斷指示或作為防止CIN發(fā)展的預(yù)防治療方法而利用T細(xì)胞應(yīng)答。更具體地，這些方法測定針對HPV16的E6和E7癌蛋白合成肽的CMI應(yīng)答。HPV16的E6和E7基因常常共同表達(dá)，且它們在HPV16陽性的宮頸癌活組織的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中最為豐富(Wettstein，1990；Seedorf等，1987)。充分的證據(jù)表明，E6和E7可讀框的共同表達(dá)對于各種哺乳動物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是必要且充分的(Munger等，1989)。而且，病毒基因組的E6和E7區(qū)域的連續(xù)表達(dá)似乎保持惡性表型所必須的(yonKnebelDoeberitz等，1988)。大多數(shù)有免疫能力的哺乳動物的病毒感染導(dǎo)致針對感染該病毒的細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且最終效應(yīng)為細(xì)胞溶解。病毒感染期間，為了包進(jìn)新的病毒粒子，病毒蛋白在細(xì)胞中合成。一些這樣的內(nèi)源性病毒蛋白也降解并傳送到I型抗原呈遞途徑，在這里結(jié)合與MHCI類分子相結(jié)合的外來抗原。該肽-MHC復(fù)合物然后傳送到呈現(xiàn)外來抗原的細(xì)胞表面，經(jīng)由自身MHC，達(dá)到細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。CTL是特定抗原效應(yīng)物細(xì)胞。淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物的研究可用于分析這種T細(xì)胞表面標(biāo)記物的存在，用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的各種方法，包括使用免疫熒光法和流式細(xì)胞儀。一旦識別出外來抗原，CTL就溶解靶細(xì)胞，破壞其完整性，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子相互作用或通過分泌在質(zhì)膜上產(chǎn)生洞的形成微孔的酶。這樣，CTL介導(dǎo)的免疫應(yīng)答對于清除感染病毒的細(xì)胞起了關(guān)鍵的作用。CTL效應(yīng)物細(xì)胞溶解病毒感染的靶細(xì)胞的能力通過基因和抗原的限制來調(diào)節(jié)。靶細(xì)胞必須攜帶與最初誘導(dǎo)CTL的病毒相同或等同的病毒抗原。靶細(xì)胞和誘導(dǎo)的CTL也必須帶有相同的I型MHC分子。A.外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖反應(yīng)從PBMC獲得。有少數(shù)方法可以分離PBMC。單核細(xì)胞在含20％胎牛血清(FCS)的RPMI1640中，通過附著于有或無膠原涂層的玻璃或聚乙烯組織培養(yǎng)容器上從非蓮座細(xì)胞中分離出來，通過鱟變形溶解分析確定其不含內(nèi)毒素；或者，自體血清，或10％AB+的正常供體血清作為血清源。不附著的細(xì)胞輕洗除去。利用這種方法，附著細(xì)胞通常有＞90％的單體細(xì)胞。如果組織分析暗示有T細(xì)胞，B細(xì)胞，或NK細(xì)胞的明顯污染，這些污染細(xì)胞用抗體混合物除去，包括抗-leu5b，抗-leu12和抗-leul1b和幼兔補(bǔ)體(Rossen等，1985)。在Teflon涂層容器中在37℃潮濕的含5％CO2的空氣中附著1小時或更長時間后，釋放單核細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(Crowe等，1987)。對細(xì)胞鋪于膠原涂層表面的情況，1mg/ml的1型膠原酶加入到培養(yǎng)基中。通過在含有5％FCS和EDTA的，不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液中培養(yǎng)15分鐘或更長時間來釋放細(xì)胞。用EDTA培養(yǎng)在冰上進(jìn)行。使用一次性細(xì)胞刮刀幫助去除細(xì)胞。刮下的細(xì)胞在不含鈣和鎂的Dulbecco的PBS中清洗兩次，并在Teflong培養(yǎng)罐中培養(yǎng)于RPMI1640和10％的AB+人血清，如Crowe等所述(1987)。分離外周血單核細(xì)胞的第二策略是根據(jù)Hester和Walker(1981)的Percoll密度梯度法，以增加非蓮座細(xì)胞群中單核細(xì)胞的濃度。富含單核細(xì)胞的群體，如需要用上文所述的抗體混合物和補(bǔ)體處理，以盡可能去除污染的T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞殘余物。通過這種方法回收的單核細(xì)胞直接培養(yǎng)在Teflon涂層的容器中，不存在單核細(xì)胞開始表面附著時必須出現(xiàn)的“活化作用”。然而，Percoll密度梯度步驟和/或暴露于抗體和補(bǔ)體也可“活化”這些細(xì)胞，可能以不同的方式進(jìn)行。分離外周血單核細(xì)胞的第三策略是利用單核細(xì)胞的折射性質(zhì)，用流式細(xì)胞儀的高速細(xì)胞分類功能以前向角光散射為基礎(chǔ)將其分類。它具有生產(chǎn)高純度細(xì)胞的潛力，而不會因與抗體或補(bǔ)體接觸受影響。B.T細(xì)胞應(yīng)答T細(xì)胞應(yīng)答可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的各種方法檢測。一些分析方法將在下文中詳細(xì)描述。1.3[H]胸腺嘧啶核苷摻入分析來自不同樣品的PBMC的增殖反應(yīng)可按照公開文獻(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)的3[H]胸腺嘧啶摻入分析確定(Nehete，1996；Nehete，1995)。T細(xì)胞對個別E6和E7肽的增殖反應(yīng)的顯著性(根據(jù)刺激指數(shù)[SI])可以暴露于肽的細(xì)胞超過沒有肽加入的對照組細(xì)胞的3[H]胸腺嘧啶核苷摻入的增加倍數(shù)來計(jì)算。當(dāng)SI值至少為2.0，包括至少2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0或更多時，認(rèn)為是陽性反應(yīng)。通常，SI值的計(jì)算通過測量培養(yǎng)基中用肽溫育的細(xì)胞的放射性(cpm)數(shù)量，除以無肽溫育(僅培養(yǎng)基)的細(xì)胞的放射性數(shù)量(只有培養(yǎng)基)得到。2.利用51[Cr]溶解細(xì)胞介導(dǎo)淋巴溶解(CML)可以用來指示T細(xì)胞反應(yīng)。靶細(xì)胞在暴露于效應(yīng)物細(xì)胞之前，可以用放射性鉻-51(51[Cr])標(biāo)記。釋放到培養(yǎng)基中的51[Cr]的數(shù)量與細(xì)胞介導(dǎo)的溶解水平成比例。3.γ-干擾素的產(chǎn)生伽馬干擾素(γ-干擾素)也稱為II型免疫干擾素，由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。它對于輔助性T細(xì)胞發(fā)展是關(guān)鍵的。因?yàn)槭亲畛醯木奘杉?xì)胞激活因子，其在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中是的強(qiáng)大細(xì)胞因子。γ-干擾素增加了MHCI類分子和MHCII類分子的表達(dá)水平，這兩種分子能提高抗原呈遞和其它識別反應(yīng)。而且它能放大TNF-α的效應(yīng)并能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)水平，這些分子使得T細(xì)胞粘附并外滲。4.四聚物分析四聚物分析方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。參見Altman，1996。5.細(xì)胞因子的產(chǎn)生細(xì)胞因子是在免疫應(yīng)答和不同細(xì)胞型分化途徑中起重要作用的蛋白質(zhì)。它們對T細(xì)胞調(diào)節(jié)和發(fā)育起關(guān)鍵作用，并且包括γ-干擾素，白介素1(IL-1)，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，淋巴毒素，MIF，TGF-β，TNF-α和其它趨化細(xì)胞因子。TH1細(xì)胞因子包括IL-2，干擾素(IFN)γ，腫瘤壞死因子(TNF)α，或TNF-β，IL-3，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17，或IL-18。TH2細(xì)胞因子包括IL-1，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-13，IL-14或IL-18。細(xì)胞因子的分析是本領(lǐng)域公知的，其中的一些在本發(fā)明中公開。6.細(xì)胞因子分析對TH1和TH2細(xì)胞因子可以通過ELISA，放射性免疫分析(RIA)或流式細(xì)胞儀(FACS)檢測。各種有用的免疫檢測方法的步驟已在科學(xué)文獻(xiàn)中有描述，如Doolittle和Ben-Zeev，1999；Gulbis和Galand，1993；以及DeJager等，1993，此處都引入作為參考。7.免疫分析在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合，純化，去除，量化和/或其它一般檢測生物組分蛋白質(zhì)，多肽或肽的免疫檢測方法。在一些實(shí)施方案中，免疫測定用于檢測針對HPV肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。一些提到的免疫檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射性免疫測定(RIA)，免疫放射測定，熒光免疫測定，化學(xué)發(fā)光測定，生物發(fā)光測定，和蛋白質(zhì)印跡。各種有用的免疫檢測方法的步驟已公開于科學(xué)文獻(xiàn)如DoolittleMH和Ben-ZeevO，1999；GulbisB和GalandP，1993；和DeJagerR等，1993；此處都引入作為參考。通常，免疫結(jié)合方法包括獲得疑似含有蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的樣品，并在能有效形成免疫復(fù)合物的條件下(視情況而定)將根據(jù)本發(fā)明的樣品與抗體接觸。例如，在本發(fā)明中，E6或E7肽可用來激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。抗體可以針對作為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答結(jié)果產(chǎn)生的細(xì)胞因子，或針對T細(xì)胞上的細(xì)胞因子受體?；蛘撸刹捎每笴D69或CD45，或抗它們二者的抗體。這些方法包括從細(xì)胞器，細(xì)胞，組織或生物體樣品中純化蛋白質(zhì)，多肽和/或肽。在這些例子中，抗體從樣品中去除蛋白質(zhì)，多肽和/或肽?？贵w優(yōu)選與固相支持物相連，如柱狀基質(zhì)，并且將疑似含有蛋白質(zhì)，多肽和/或肽抗原成分的樣品施加到固定化的抗體上。不需要的成分將從柱上洗掉，留下免疫復(fù)合于固定化的抗體上的抗原，將被洗脫。對于細(xì)胞因子應(yīng)答的檢測，被測生物樣品可以是疑似含有細(xì)胞因子的任何樣品，例如，組織切片或標(biāo)本，均質(zhì)的組織提取物，細(xì)胞，細(xì)胞器，上述任何含抗原成分的分離和/或純化形式，或甚至是任何與細(xì)胞或組織接觸的生物流體，包括血液和/和血漿，盡管如此，優(yōu)選組織樣品或提取物。在有效條件下，經(jīng)過足以允許形成免疫復(fù)合物(初級免疫復(fù)合物)的一段時間，將所選擇的生物樣品與抗體接觸通常是簡單地將抗體成分加入到樣品中并培養(yǎng)混合物足夠長的時間，使抗體與存在的任何抗原形成(即，結(jié)合為)免疫復(fù)合物。之后，通常沖洗樣品-抗體復(fù)合物，如組織切片，ELISA板，斑點(diǎn)印跡或蛋白質(zhì)印跡，以除去任何非特異性結(jié)合的抗體種類，而只允許留下與初級免疫復(fù)合物特異性結(jié)合的待測抗體。通常，檢測免疫復(fù)合物的形成是本領(lǐng)域公知的，并可通過許多方法實(shí)現(xiàn)。這些方法通常基于檢測標(biāo)記或標(biāo)記物，如任何放射性的，熒光的，生物的和酶促的標(biāo)記。美國專利，包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241涉及這些標(biāo)記的應(yīng)用，它們均引入此處作為參考。當(dāng)然，正如本領(lǐng)域所知的，通過利用第二結(jié)合配體可得到附加益處，如第二抗體和/或生物素/親和素配體結(jié)合方案。用于檢測的抗原抗體可以本身連接有可檢測的標(biāo)記，然后我們僅需檢測該標(biāo)記，由此確定混合物中初級免疫復(fù)合物的量。或者，與初級免疫復(fù)合物結(jié)合的第一抗體可以通過對該抗體有結(jié)合親和性第二結(jié)合配體檢測。在這種情況下，第二結(jié)合配體可與可檢測的標(biāo)記結(jié)合。第二結(jié)合配體本身通常是一種抗體，它可稱為“第二”抗體。在有效條件下，初級免疫復(fù)合物與標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體相接觸足夠長的時間以形成第二免疫復(fù)合物。然后第二免疫復(fù)合物通常洗掉任何非特異性結(jié)合的標(biāo)記的第二抗體或配體，且然后在第二免疫復(fù)合物中檢測出保留的標(biāo)記物。進(jìn)一步的方法包括用兩步法檢測初級免疫復(fù)合物。用對抗體有結(jié)合親和性的第二結(jié)合配體，如一種抗體，形成第二免疫復(fù)合物，如上文所述。漂洗過后，再次在有效條件下，第二免疫復(fù)合物與與對第二抗體有結(jié)合親和性的第三結(jié)合配體或抗體接觸足夠的時間以第三級免疫復(fù)合物。該第三配體或抗體連接到可檢測的標(biāo)記物上，能檢測到這樣形成的第三級免疫復(fù)合物。如果需要，這一系統(tǒng)可提供信號放大作用。由CharlesCantor設(shè)計(jì)的一種免疫檢測方法使用兩種不同的抗體。第一步生物素化的單克隆或多克隆抗體，用于檢測靶抗原，第二步，抗體然后用于檢測與復(fù)合的生物素相連的生物素。在該方法中，要檢測的樣品首先在含有第一步的抗體的溶液中溫育。如果靶抗原存在，一些抗體結(jié)合抗原形成生物素化的抗體/抗原復(fù)合物。然后通過在鏈霉抗生物素蛋白(或親和素)，生物素化的DNA，和/或互補(bǔ)的生物素化的DNA的連續(xù)溶液中培養(yǎng)該抗體/抗原復(fù)合物將其放大，每一步在抗體/抗原復(fù)合物上增加生物素位點(diǎn)。重復(fù)放大步驟，直到獲得適當(dāng)?shù)姆糯笏?，在此將樣品在含有抗生物素的第二步抗體的溶液中培養(yǎng)。該第二步抗體被標(biāo)記，如用酶，其可通過組織酶學(xué)用顯色底物能檢測抗體/抗原復(fù)合物存在。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆糯?，產(chǎn)生肉眼可見的綴合。另一個已知的免疫檢測方法利用了免疫-PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法。PCR方法與Cantor方法類似，直到與生物素化的DNA培養(yǎng)的步驟，然而，該方法并沒有使用多次循環(huán)的鏈霉抗生物素蛋白和生物素化的DNA培養(yǎng)，而是用釋放抗體的低PH或高鹽緩沖液清洗DNA/生物素/鏈霉抗生物素蛋白/抗體復(fù)合物。用適當(dāng)?shù)囊锖瓦m當(dāng)?shù)膶φ諏λ玫降南闯鲆哼M(jìn)行PCR反應(yīng)。該方法提供了一種有用的鑒定感染HPV的婦女群體患有宮頸癌或CIN的方式。另一種確定感染HPV的患者是否有癌前期的或癌的生長的方法是通過雜交捕獲，如公開于Birner等，2001和Clavel等，2000，二者均引入作為參考。本發(fā)明的免疫檢測方法對于疾病的診斷和預(yù)后具有明顯的效用，疾病如特異性表達(dá)如癌癥特異性基因產(chǎn)物等的各種疾病。這里使用疑似感染了能導(dǎo)致CIN的HPV的生物學(xué)的和/或臨床樣品。然而，這些實(shí)施方案也應(yīng)用于非臨床樣品，如在抗原或抗體樣品中效價的測定中，如對雜交瘤的選擇中。a.ELISA如上所述，免疫檢測，以其最簡單和/或直接的含義，指結(jié)合測定。某些優(yōu)選的免疫檢測是本領(lǐng)域公知的各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)和/或放射性免疫檢測(RIA)。利用組織切片的免疫組織化學(xué)檢測也非常有用。然而，容易理解，檢測并沒有局限于這些技術(shù)，和/或蛋白質(zhì)印跡，斑點(diǎn)印跡，F(xiàn)ACS檢測等的技術(shù)也可以使用。在一個典型的ELISA中，本發(fā)明中針對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物的抗體(包括抗原)被固定化于所選擇的顯示蛋白質(zhì)親和性質(zhì)的表面，如聚苯乙烯微量滴定板上的孔中。然后，向孔中加入疑似含有抗原的被測組分，如一份臨床樣品。結(jié)合和/或清洗以除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，可以檢測出結(jié)合的抗原。檢測是通過加入另一個連接于可檢測標(biāo)記上的抗體實(shí)現(xiàn)。這種ELISA是一種簡單的“三明治ELISA”，檢測也可以通過加入第二抗體，然后加入對第二抗體有結(jié)合親和力的第三抗體，第三抗體與可檢測標(biāo)記連接。在另一個典型的ELISA中，疑似含有抗原的樣品固定于孔表面和/或然后將其與抗體接觸，該抗體通過抗細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(包括抗原)產(chǎn)生。經(jīng)過結(jié)合和/或清洗除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，檢測出結(jié)合抗體。在最初的抗體結(jié)合于可檢測標(biāo)記的地方，可以直接檢測到免疫復(fù)合物。同樣，免疫復(fù)合物也可用與第一抗體具有結(jié)合親和性的第二抗體檢測，該第二抗體連接有可檢測標(biāo)記。另一個其中抗原被固定的ELISA涉及在檢測中利用抗體競爭。在這種ELISA中，標(biāo)記的抗一種抗原的抗體被加入到孔中，使其結(jié)合，和/或通過其標(biāo)記來檢測。在用被包被的孔培養(yǎng)的過程中，通過將樣品與標(biāo)記的抗該抗原的抗體混合，可確定未知樣品中的抗原數(shù)量。樣品中抗原的存在產(chǎn)生減少了能夠結(jié)合孔上的抗該抗原抗體數(shù)量的作用，從而減少了最終的信號。這種方法也適合檢測未知樣品中的抗某個抗原的抗體，其中未標(biāo)記的抗體結(jié)合到抗原包被的孔上，并且也減少了能夠結(jié)合標(biāo)記的抗體的抗原數(shù)量。不管利用何種形式，ELISA具有某些共同的特征，如包被，溫育和結(jié)合，清洗除去非特異性吸附物質(zhì)種類，和檢測結(jié)合的免疫復(fù)合物。這些將在下文中描述。在用抗原或抗體包被一塊板時，通常用抗原或抗體溶液溫育板內(nèi)的小孔，過夜或經(jīng)過數(shù)小時。然后清洗板上的小孔以除去不完全吸附的物質(zhì)。然后用非特異性蛋白“包被”小孔的任何殘留的可利用的表面。這種非特異性蛋白對于試驗(yàn)的抗血清是抗原中性的，其包括牛血清蛋白(BSA)，酪蛋白或奶粉溶液。這種包被能封閉固定化的表面的非特異性吸附位點(diǎn)，從而減少抗血清在表面的非特異性吸附所導(dǎo)致的背景。在ELISA中，可能更常使用第二或第三級檢測方法，勝于使用直接方法。這樣，將蛋白質(zhì)或抗體結(jié)合到小孔上之后，用非反應(yīng)材料包被板以減少背景，清洗以除去未結(jié)合的材料，在允許免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的有效條件下，將固定化的表面與待測生物樣品接觸。需要標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體來檢測免疫復(fù)合物，并且第二結(jié)合配體或抗體與標(biāo)記的第三抗體或第三結(jié)合配體連接。“在允許免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的有效條件下”意指該條件優(yōu)選包括用溶液如BSA，牛丙球蛋白(BGG)或磷酸緩沖鹽(PBS)/Tween稀釋的抗原和/或抗體。這些加入的試劑也傾向于幫助減少非特異性背景?！昂线m的”條件也指培養(yǎng)是在足以允許有效結(jié)合的一定溫度或一段時間。典型的培養(yǎng)步驟是從約1至2至4小時左右，優(yōu)選溫度大約是25℃至27℃，或如在約4℃過夜。在ELISA的所有溫育步驟之后，清洗接觸表面以除去非復(fù)合物質(zhì)。優(yōu)選的清洗方法包括用溶液如PBS/Tween，或硼酸鹽緩沖液來清洗。在待測樣品和原先的結(jié)合物質(zhì)之間形成特異性的免疫復(fù)合物，并隨之清洗后，即使微小數(shù)量的免疫復(fù)合物的存在也可以被檢測到。為提供一種檢測方法，第二或第三抗體將與標(biāo)記物結(jié)合用于檢測。優(yōu)選地，標(biāo)記物是一種當(dāng)與適當(dāng)?shù)陌l(fā)光物質(zhì)培養(yǎng)時能顯色的酶。從而，需要在適于進(jìn)一步形成的免疫復(fù)合物顯影的條件下(例如在含有PBS的溶液中，如PBS-Tween中，室溫下培養(yǎng)2小時)，第一或第二免疫復(fù)合物與尿素酶，葡萄糖氧化酶，堿性磷酸酶或過氧化物酶綴合的抗體接觸或培養(yǎng)一段時間。與標(biāo)記的抗體培養(yǎng)過后，并且接下來清洗去除未結(jié)合的物質(zhì)，定量標(biāo)記數(shù)量，如在酶標(biāo)記的情況，通過與發(fā)光基質(zhì)如尿素，或溴甲酚紫，或2，2’-連氮基-二-(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，或H2O2培養(yǎng)。然后通過測量產(chǎn)生的顏色程度來定量，如，用可視光譜的分光光度計(jì)。b.免疫組織化學(xué)法抗體也可用于與新鮮-冷凍的和/或福爾馬林固定的，石蠟包埋的組織塊結(jié)合，該組織塊為免疫組織化學(xué)法(IHC)的研究而制備。從這些特殊標(biāo)本制備組織塊的方法已經(jīng)成功地用于先前的各種預(yù)測因素的IHC研究，和/或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知(Brown等，1990；Abbondanzo等，1990；Allred等，1990)。簡要地，冷凍切片可通過以下步驟制備，在室溫下，于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，在小塑料膠囊中將50ng的冷凍的“粉碎”組織再水化；離心沉淀微粒；在粘性包埋介質(zhì)(OCT)中將其再懸浮；翻轉(zhuǎn)膠囊和/或再次離心沉淀；迅速冷凍于70℃的異戊烷中；切割塑料膠囊和/或取出冷凍柱狀組織；將該柱狀組織固定于低溫恒溫器切片機(jī)卡盤上；和/或切割25-50個連續(xù)切片。永久切片可通過類似的方法制備，包括在一個塑料微夏普列斯超速離心管(microfugetube)再水化50mg樣品；沉淀；在10％的福爾馬林中再懸浮4小時以固定；清洗/沉淀；在2.5％的暖瓊脂中再懸??；沉淀；在冰水中冷卻以固化瓊脂；從管中取出組織/瓊脂塊；將塊浸潤和/或包埋于石蠟中；和/或切割成50個連續(xù)的永久切片。c.熒光分類細(xì)胞譜蛋白質(zhì)也可以通過流式細(xì)胞儀檢測，如在Fujishima等，1996中所述。在該方法的實(shí)例中，細(xì)胞被固定，然后與抗要檢測的所表達(dá)蛋白的單克隆抗體溫育。結(jié)合抗體然后與標(biāo)記的抗體IgG(舉例來說)接觸以檢測。典型的標(biāo)記物是FITC。然后用流式細(xì)胞儀檢測熒光密度，如OrthoCytron，Orthodiagnostics，或FACScan；BectonDickinson。FACS可以最初分離細(xì)胞的亞群，根據(jù)細(xì)胞經(jīng)過激光束時它們的光散射性質(zhì)。前向光散射(FALS)與細(xì)胞大小相關(guān)，并且直角光散射與細(xì)胞濃度，細(xì)胞輪廓和核質(zhì)比相關(guān)。由于細(xì)胞被熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記，因而它們能被進(jìn)一步檢測，通過熒光強(qiáng)度以及設(shè)置于FACS上收集明亮熒光和暗熒光的陽性和陰性窗口。細(xì)胞以大約3000個細(xì)胞每秒的流速被分類，并收集陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。d.蛋白質(zhì)印跡本發(fā)明的組合物可用于免疫印跡和蛋白質(zhì)印跡分析。肽可用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。本發(fā)明的抗體可用作高親和性初始試劑來檢測蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)固定于固相支持物上，如硝酸纖維素，尼龍或其聯(lián)合。與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合，之后采用凝膠電泳，其可以作為單步試劑用于檢測抗原，用于檢測該抗原的第二試劑針對該抗原引起不利背景。當(dāng)被研究的抗原是免疫球蛋白時，該方法尤其有用(排除使用結(jié)合細(xì)菌的細(xì)胞壁成分的免疫球蛋白)，被研究抗原與檢測試劑交叉反應(yīng)，或者它們以作為交叉反應(yīng)信號的相同的相對分子量遷移。用于協(xié)同蛋白質(zhì)印跡的基于免疫學(xué)的檢測方法包括酶促的-，放射性標(biāo)記-，或熒光標(biāo)記抗蛋白質(zhì)部分的第二抗體，在此認(rèn)為有特殊作用。VIII免疫療法作為一種感染或癌癥治療的方法，免疫療法基于攜帶抗原的腫瘤細(xì)胞刺激產(chǎn)生特異性的抗體和/或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的前提。A.免疫療法的類型如下文所述，癌癥的免疫療法可廣法地分為繼承型，被動和主動型。1.被動免疫存在許多不同的被動免疫途徑。它們可以廣泛分為以下幾類僅注射抗體；注射偶聯(lián)有毒素或化療劑的抗體；注射偶聯(lián)有放射性同位素的抗體；注射抗-個體基因型的抗體；以及最后，清除骨髓中的腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，在被動免疫中應(yīng)用人單克隆抗體，因?yàn)樗鼈冊诨颊唧w內(nèi)產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生副作用。然而，其應(yīng)用在某種程度上因缺乏而受局限，并迄今為止僅在損害內(nèi)施用人單克隆抗體?？股窠?jīng)節(jié)苷脂抗原的人單克隆抗體已經(jīng)被施用到患有皮膚性復(fù)發(fā)黑色素瘤的患者創(chuàng)傷內(nèi)(Irie&Morton，1986)。經(jīng)過每天或每周對損害部位的注射，10位患者中，其中6位觀察到消退。在另一個研究中，經(jīng)向損害部位注射兩種人單克隆抗體，取得了一定成功(Irie等，1989)。優(yōu)選施用直接抗兩個不同抗原的一種以上的單克隆抗體或甚至帶有多種抗原特異性的抗體。治療方案也包括施用淋巴因子或其它免疫增強(qiáng)劑，如Bajorin等(1988)中所述。說明書的其它部分進(jìn)一步詳細(xì)描述人單克隆抗體的開發(fā)。2.主動免疫在主動免疫中，抗原的肽，多肽或蛋白質(zhì)，或自體或異源的腫瘤細(xì)胞組合物或“疫苗”，通常與獨(dú)特的細(xì)菌輔助劑一起施用(Ravindranath&Morton，1991；Morton&Ravindranath，1996；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。在黑色素瘤的免疫治療中，引起高IgM反應(yīng)的患者經(jīng)常比不引起或引起低IgM抗體的患者活的更好(Morton等，1992)。IgM抗體往往是短暫抗體，與常規(guī)例外的是抗神經(jīng)節(jié)苷脂或抗糖的抗體。3.繼承性免疫療法在繼承性免疫療法中，患者的循環(huán)淋巴細(xì)胞，或腫瘤滲透的淋巴細(xì)胞在體外被分離，通過淋巴因子如IL-2被活化，或用基因轉(zhuǎn)換以使腫瘤壞死，并且再給藥(Rosenberg等，1988；1989)。為達(dá)到這點(diǎn)，向動物，或人類患者施用免疫學(xué)有效量的活性淋巴細(xì)胞，結(jié)合此處描述的整合有輔助劑的抗原性肽組合物?；钚粤馨图?xì)胞最優(yōu)選是患者自己的細(xì)胞，它較早地從血液或腫瘤樣品中分離出來并在體外活化(或“擴(kuò)展”)。這種形式的免疫治療已經(jīng)產(chǎn)生了一些黑色素瘤和腎癌消退的病例，但是有應(yīng)答的百分率相比那些沒有應(yīng)答的百分率要少。B.疫苗注射本發(fā)明包括使用來自HPV的E6和E7肽誘導(dǎo)或改善細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫療法。針對HPV的E6和/或E7肽不產(chǎn)生或產(chǎn)生低CMI應(yīng)答的患者，這種方法尤為顯著。包含所有或部分SEQIDNO1至19氨基酸的肽或多肽作為治療和防止HPV感染的有效疫苗在臨床上很重要，包括防止與HPV相關(guān)的癌前期的和癌的生長，誘導(dǎo)患者體內(nèi)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。一旦生產(chǎn)、合成和/或純化，本發(fā)明的肽和多肽可以制成疫苗施用于患者。本發(fā)明的肽，多肽和疫苗也與其它疫苗或疫苗成分結(jié)合，如其它額外的抗原，以刺激抗原的免疫應(yīng)答。在這種實(shí)施方案中，優(yōu)選的附加抗原是那些暗示在癌和高增殖性條件下特異或優(yōu)選表達(dá)的抗原?？紤]與本發(fā)明的肽，多肽和疫苗結(jié)合的額外抗原和疫苗包括那些在美國專利5,840,317和5,882,654中所述的，此處引入作為參考。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能預(yù)想用于測試的一些潛在的治療劑和輸送方式。如，潛在的抗HPV和抗腫瘤試劑可以是天然產(chǎn)物或是由人工設(shè)計(jì)的合成分子。此外，該模式提供了從一組已知的和新的化合物中選擇有效試劑的手段。任何特定的潛在治療劑的劑量和輸送方式可基于已確立的制備藥學(xué)活性成分的指南來確定。例如，試驗(yàn)的化合物可以通過靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，肌內(nèi)，局部，口服的方式，或其它藥學(xué)上有效的方式給藥。使用由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的動物，研究者首次能夠評價針對高危人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的疾病，可能包括病毒的復(fù)制和傳播的預(yù)防和治療試劑。其中包括化學(xué)型藥物，基因治療，反義抑制策略，或預(yù)防或治療性疫苗。許多對評價建議療法的實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果的方法是公知的。根據(jù)宿主種類，也可使用各種佐劑以增加免疫應(yīng)答，它們包括但不限于，弗氏(完全和不完全)，無機(jī)凝膠劑如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，聚醚多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，鑰孔戚血藍(lán)蛋白，二硝基酚，和對人非常有用的佐劑如BCG(細(xì)菌Calmetter-Guerin)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。佐劑除了用于本發(fā)明的免疫治療，還可用于在本發(fā)明范圍內(nèi)增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的檢測。C.定向輸送系統(tǒng)在本發(fā)明要求的一些實(shí)施方案中，為了檢測病毒特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，HPV多肽或肽可以被輸送到靶細(xì)胞，在它們的表面表達(dá)病毒蛋白片段，以達(dá)到產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答的目的。不同的輸送方法包括灌注，表達(dá)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染，病毒載體，和下文公開的其它方法。1.通過灌注轉(zhuǎn)移本發(fā)明要求的一個實(shí)施方案通過灌注法轉(zhuǎn)移肽或肽的組合物到細(xì)胞中。也包括表達(dá)構(gòu)建體和病毒構(gòu)建體的連續(xù)灌注。在連續(xù)灌注中傳輸?shù)臉?gòu)建體或肽數(shù)量可由所需攝取的數(shù)量決定。本發(fā)明公開了一個灌注的實(shí)例，其中初始濃度為106個細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)物可先被標(biāo)記，清洗，并且然后在100ug的合成肽中培養(yǎng)兩小時。2.表達(dá)載體治療肽的輸送可利用表達(dá)載體來完成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，HPV多肽和肽通過使用表達(dá)構(gòu)建體被輸送到靶細(xì)胞。這一應(yīng)用過程中，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”指包括含有編碼HPV多肽的核酸的任何遺傳結(jié)構(gòu)。“病毒載體”指主要從病毒序列中衍生出的表達(dá)構(gòu)建體。為了構(gòu)建體有效地表達(dá)，編碼HPV多肽的多核苷酸將受啟動子的轉(zhuǎn)錄控制。“啟動子”指被宿主細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識別的DNA序列，該機(jī)器是啟動特定基因轉(zhuǎn)錄所必須的。短語“受轉(zhuǎn)錄控制”指啟動子在相對于多核苷酸的正確位點(diǎn)上，以控制RNA多聚酶的啟動和多核苷酸的表達(dá)。術(shù)語啟動子用于此處指聚簇于RNA聚合酶II啟動位點(diǎn)的一組轉(zhuǎn)錄控制基序。許多關(guān)于啟動子怎樣組織的思考得自對一些病毒的分析，包括HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元。通過最近工作的擴(kuò)展，這些研究已經(jīng)顯示啟動子由不連續(xù)的功能基序組成，每個由將近7-20bp的DNA組成，并包含一個或多個轉(zhuǎn)錄激活蛋白或阻遏蛋白識別位點(diǎn)。在每個啟動子中至少一個基序的功能是定位RNA合成的起始位點(diǎn)。其中最著名的實(shí)例是TATA框，但在一些缺少TATA框的啟動子中，如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因和SV40晚期基因的啟動子，覆蓋于起始位點(diǎn)的不連續(xù)元件本身幫助固定起始位置。另外的啟動子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄啟動的頻率。典型地，它們位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域，盡管最近已顯示出許多啟動子在起始位點(diǎn)的下游也含有功能元件。啟動子元件之間的間隔是靈活的，以至于當(dāng)元件顛倒或彼此之間相對移動時，啟動子功能仍保存。在tk啟動子中，啟動子元件間的間隔在活性開始下降之前可以增加到相隔50bp。依賴于啟動子，各個元件可協(xié)同地或獨(dú)立地對激活轉(zhuǎn)錄起作用。用于控制HPV多核苷酸表達(dá)的特殊啟動子并非關(guān)鍵，只要它能在靶細(xì)胞中表達(dá)該多肽。這樣，當(dāng)以人細(xì)胞為目標(biāo)時，最好將多核苷酸的區(qū)域編碼置于鄰近并受控制于能在人細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的位置。一般而言，這樣的啟動子包括人啟動子或病毒啟動子。利用其它病毒或哺乳動物細(xì)胞的或細(xì)菌噬菌體的啟動子(本領(lǐng)域公知的)來獲得多核苷酸的表達(dá)也被考慮，只要表達(dá)水平足以誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。通過利用具有公知性質(zhì)的啟動子，可以優(yōu)化轉(zhuǎn)染后的多核苷酸的表達(dá)水平和模式。如，選擇在特定細(xì)胞中有活性的啟動子，如酪氨酸酶(黑色素瘤)，α-胎蛋白和清蛋白(肝腫瘤)，CC10(肺腫瘤)和前列腺特異性抗原(前列腺腫瘤)允許HPV多核苷酸的組織特異性表達(dá)。進(jìn)一步，選擇針對特異生理信號應(yīng)答被調(diào)節(jié)的啟動子允許可誘導(dǎo)的HPV多肽構(gòu)建物的表達(dá)。增強(qiáng)子最初作為增強(qiáng)位于相同DNA分子遠(yuǎn)處位點(diǎn)的啟動子轉(zhuǎn)錄的遺傳因子被發(fā)現(xiàn)。在對原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的經(jīng)典研究中，這一遠(yuǎn)距離起作用的能力幾乎沒有先例。后來的工作顯示，有增強(qiáng)子活性的DNA區(qū)域組織形式很像啟動子。即，它們由很多單獨(dú)的元件組成，每個都結(jié)合一個或多個轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)。增強(qiáng)子和啟動子之間的基本差別是操作性的。所有的增強(qiáng)子區(qū)域作為一個整體必須能激發(fā)遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)錄，對于啟動子區(qū)域或它的組成元件則不必具備這點(diǎn)。另一方面，啟動子必須具有一個或多個直接啟動RNA合成的元件，尤其在特殊位點(diǎn)或特殊定向，而增強(qiáng)子缺少這些特征。啟動子和增強(qiáng)子經(jīng)常重疊并接近，往往表面上具有相似的基序組織。此外，可用任何啟動子/增強(qiáng)子的結(jié)合(按照EukaryoticPromoterDataBaseEPDB)來驅(qū)動HPV多核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)。使用T3，T7或SP6細(xì)胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是另一種可能的實(shí)施方案。如果提供適當(dāng)?shù)募?xì)菌噬菌體聚合酶，真核細(xì)胞能支持從某一細(xì)菌噬菌體啟動子的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄，或作為輸送復(fù)合物的一部分，或作為附加的基因表達(dá)載體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體的輸送可通過在表達(dá)載體內(nèi)包含的標(biāo)記在體外或體內(nèi)鑒定。對于允許鑒別表達(dá)的受轉(zhuǎn)染細(xì)胞，標(biāo)記會產(chǎn)生可識別的變化。通常，包括藥物選擇性標(biāo)記幫助克隆和選擇轉(zhuǎn)化體。或者，可使用酶，如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)(真核的)或氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)(原核的)。也可使用免疫標(biāo)記。可選擇性標(biāo)記的使用并非重要，只要它能與編碼HPV多肽的多核苷酸一起表達(dá)。可選擇性標(biāo)記更多的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。人們一般以包括多腺苷酸化信號來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適當(dāng)?shù)木巯佘账峄?。多腺苷酸化信號的性質(zhì)對于成功實(shí)踐本發(fā)明并非重要，可以使用任何這樣的序列。發(fā)明者已使用了SV40多腺苷酸化信號，因?yàn)樗芊奖?，并且已知在靶?xì)胞的使用中功能良好。也作為表達(dá)結(jié)構(gòu)的要素之一的是終止子。這些要素可用來增強(qiáng)信號水平并使減少從構(gòu)建體到其它序列的通讀。3.病毒載體在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包括病毒或來源于病毒基因的改造的構(gòu)建體。某些病毒經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的能力，在一些情況下，與細(xì)胞染色體整合的能力，已使它們成為將基因轉(zhuǎn)至哺乳動物細(xì)胞的有吸引力的候選物。然而，由于已經(jīng)證明，直接攝入裸DNA疫苗，和受體介導(dǎo)的DNA復(fù)合物(下文論述)，表達(dá)載體的攝入不必是病毒的，卻可以是在哺乳動物細(xì)胞中能支持編碼基因表達(dá)的任何質(zhì)粒，粘粒，或噬菌體結(jié)構(gòu)，如pUC或BluescriptTM質(zhì)粒系列。a.逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒被細(xì)分為三個主要的組腫瘤病毒，如鼠白血病病毒；慢病毒，和泡沫病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是單鏈RNA病毒，由在受感染細(xì)胞中通過反向轉(zhuǎn)錄將其RNA轉(zhuǎn)為雙鏈DNA的能力而表征(Coffin，1990)。然后，得到的DNA作為前病毒整合到細(xì)胞的染色體中，并指導(dǎo)合成病毒蛋白質(zhì)。這種整合導(dǎo)致病毒基因序列保留于受體細(xì)胞與其后代。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三種基因gag，pol，和env分別編碼衣殼蛋白，聚合酶，和包膜成分。發(fā)現(xiàn)于gag基因上游的序列，稱為ψ，功能是將包裹基因組到病毒中的信號。兩個長末端重復(fù)(LTR)序列存在于該病毒基因組的5’和3’末端。它們包含強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子序列并且也必需整合到宿主細(xì)胞基因組中(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼HPV多肽的核苷酸被插入到病毒基因組的某些病毒序列中以產(chǎn)生復(fù)制缺陷的病毒。或者，可使用不能導(dǎo)致HPV感染的突變的HPV病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，構(gòu)造含有g(shù)ag，pol和env基因，但沒有LTR和ψ組分的包裝細(xì)胞系(Mann，1983)。當(dāng)含有人的cDNA重組質(zhì)粒連同逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和ψ序列，被引入到該細(xì)胞系(例如通過磷酸鈣沉淀)時，ψ序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被包裝到病毒粒子中，然后分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Mann，1983)。然后收集含有重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選濃縮，用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染多種類型的細(xì)胞。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)要求宿主細(xì)胞分裂(Paskind，1975)。最近開發(fā)了一種設(shè)計(jì)為允許逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特異性靶向的新方法，該方法基于通過化學(xué)添加乳糖殘基到病毒包膜來化學(xué)修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒。這一修飾可允許通過唾液酸糖蛋白受體特異地感染肝細(xì)胞。設(shè)計(jì)了一種不同的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶向方法，其中應(yīng)用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和抗特定細(xì)胞受體的生物素化的抗體。通過使用鏈霉抗生物素蛋白，抗體經(jīng)生物素成分偶聯(lián)起來(Roux，1989)。通過使用抗主要組織相容性復(fù)合物I類和II類抗原的抗體，他們表明在體外用外生的病毒感染帶有那些表面抗原的人細(xì)胞。(Roux，1989)。b.腺病毒人的腺病毒是雙鏈DNA腫瘤病毒，其基因組長度接近36kb(Tooze，1981)。作為真核生物基因表達(dá)的模式系統(tǒng)，腺病毒被廣泛地研究和充分鑒定，這使得發(fā)展腺病毒成為有吸引力的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。這類病毒相對容易生長和復(fù)制，并在體內(nèi)和體外顯示了較寬的宿主范圍。在裂解感染的細(xì)胞時，腺病毒能關(guān)閉宿主的蛋白合成，指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)器合成大量的病毒蛋白，并產(chǎn)生大量的病毒?；蚪M的E1區(qū)域包括E1A和E1B和一些細(xì)胞基因，E1A和E1B編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄的蛋白。E2的表達(dá)(包括E2A和E2B)能合成病毒復(fù)制功能，如DNA結(jié)合蛋白，DNA聚合酶，和最初引發(fā)復(fù)制的末端蛋白。E3基因產(chǎn)物通過CTL和腫瘤壞死因子防止細(xì)胞溶解，并對病毒增殖顯示重要性。與E4相關(guān)的功能包括DNA復(fù)制，后期基因表達(dá)，和宿主細(xì)胞關(guān)閉。后期基因產(chǎn)物主要包括病毒衣殼蛋白，它們僅在大多數(shù)從主要晚期啟動子的一次主要轉(zhuǎn)錄過程出現(xiàn)之后表達(dá)。主要晚期啟動子(MLP)在感染的晚期顯示高效性(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)。由于僅有一小部分的病毒基因組顯示需要順式(Tooze，1981)，所以當(dāng)使用與如293細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞系時，腺病毒衍生載體對于取代大DNA片段顯示了極好的潛力。Ad5-轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系(Graham，1977)已被開發(fā)以提供必要的反式病毒蛋白。腺病毒的性質(zhì)使得它們成為用于體內(nèi)靶向細(xì)胞的良好的后選物(Grunhaus和Horwitz，1992)。用腺病毒體系輸送外源蛋白到細(xì)胞的特別優(yōu)勢包括(i)由外源DNA取代相對大片段病毒DNA的能力；(ii)腺病毒重組體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(iii)腺病毒施于人類的安全性；(iv)腺病毒感染與癌癥或惡性腫瘤之間無任何已知的相關(guān)性；(v)獲得高效價病毒重組體的能力；(vi)腺病毒的高感染性。通常，腺病毒基因傳輸體系基于重組體，它為由于一部分基因組缺失而不能復(fù)制的改造的腺病毒，如缺失E1，但還保留它的感染能力。當(dāng)在腺病毒基因組中增加缺失時，編碼相對大的異源蛋白的序列可以被表達(dá)。如，缺失E1和E2區(qū)域的腺病毒能攜帶10kb的外源DNA并能在293細(xì)胞中高效價產(chǎn)生(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)。腺病毒浸染后，轉(zhuǎn)基因意外的永久表達(dá)也已被報導(dǎo)。c.AAV載體腺伴隨病毒(AAV)是本發(fā)明用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種有吸引力的載體系統(tǒng)，由于它能高頻整合并能感染非分裂的細(xì)胞，這使得它具有輸送基因到哺乳動物細(xì)胞的用途，如，在組織培養(yǎng)中(Muzyczka，1992)或在體內(nèi)。AAV具有廣泛的宿主感染范圍(Lebkowski，1988；McLaughlin，1988；Laughlin，1986；Tratschin，1984)。關(guān)于rAAV的產(chǎn)生和使用的詳細(xì)資料在美國專利5,139,941和美國專利4,797,368中描述，此處均引入作為參考。說明AAV用于基因傳輸?shù)难芯堪↙aFace等(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；和Walsh等(1994)。重組AAV載體已成功地用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記基因(Kaplitt，1994；Shelling和Smith，1994；Yoder，1994；Zhou，1994；Samulski，1989；Lebkowski，1988；McLaughlin，1988；Tratschin，1985；Hermonat和Muzyczka，1984)和涉及人疾病的基因(Luo，1994；Walsh，1994；Wei，1994；Flotte，1992；Ohi，1990)。近來，AAV載體已經(jīng)允許用于囊性纖維化病治療的I期人體試驗(yàn)。AAV是一種需要在培養(yǎng)細(xì)胞中與其它病毒(腺病毒或皰疹病毒的成員之一)協(xié)同感染才能有效感染的依賴性細(xì)小病毒(Muzyczka，1992)。在缺少輔助病毒協(xié)同感染時，野生型AAV基因組通過它的末端整合到人染色體19中，它以潛伏狀態(tài)作為前病毒駐留于此處(Samulski，1991；Kotin，1990)。然而rAAV并沒有因整合被限制到染色體19上，除非AAVRep蛋白也被表達(dá)(Shelling和Smith，1994)。當(dāng)運(yùn)輸AAV前病毒的細(xì)胞被輔助細(xì)胞雙重感染，AAV基因組從染色體或重組質(zhì)粒中被“援救”出來，從而建立了通常的有效感染(Muzyczka，1992；Kotin，1990；Samulski，1989；McLaughlin，1988)。典型地，重組AAV病毒(rAAV)通過協(xié)同轉(zhuǎn)染一個在目的基因兩翼含有兩個AAV末端重復(fù)序列的質(zhì)粒(McLaughlin，1988；Samulski，1989；分別引入此處作為參考)，和一個含有無末端重復(fù)序列的野生型AAV編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒制成，例如pIM45(McCarty，1991；此處引入作為參考)。細(xì)胞也可感染或轉(zhuǎn)染載有AAV所需輔助功能的腺病毒基因的腺病毒或質(zhì)粒。以這種方式制得的rAAV病毒原液被腺病毒污染，后者必須從rAAV微粒中物理分離(如通過氯化銫密度離心)。或者，可使用含有AAV編碼區(qū)域的腺病毒載體或含有AAV編碼區(qū)域的細(xì)胞系和一些或所有的腺病毒輔助基因(Clark，1995；Yang，1994)。也可以使用載有rAAVDNA作為一種整合前病毒的細(xì)胞系(Flotte，1995)。d.其它作為表達(dá)構(gòu)建體的病毒載體在本發(fā)明中可以使用其它病毒載體作為表達(dá)構(gòu)建體。可以使用來自病毒的載體如牛痘病毒(Coupar，1988；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和皰疹病毒。這些病毒對各種哺乳動物細(xì)胞提供了一些有吸引力的特性(Horwich，1990；Friedmann，1989；Coupar，1988；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。隨著近來對乙型肝炎病毒的認(rèn)識，對于不同的病毒序列的結(jié)構(gòu)功能也產(chǎn)生了新的認(rèn)識。體外試驗(yàn)顯示，盡管缺失了基因組的80％，病毒仍能保持其依賴輔助病毒包裝和反轉(zhuǎn)錄的能力(Horwich，1990)。這意味著大部分的基因組可以通過外源基因物質(zhì)代替。對于肝定向基因的轉(zhuǎn)移，趨肝性和存活率(整合)是尤為有吸引力的特性。Chang(1991)最近將氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)基因引入到鴨乙型肝炎病毒基因組中聚合酶的位置，表面和前表面編碼區(qū)域。它在鳥類肝癌細(xì)胞系中與野生型病毒協(xié)同轉(zhuǎn)染。含有高效價病毒重組體的培養(yǎng)基被用來感染原代小鴨肝細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后的至少24天，檢測到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang，1991)。e.非病毒轉(zhuǎn)移方法本發(fā)明也設(shè)計(jì)了一些非病毒方法以轉(zhuǎn)移表達(dá)載體到培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。它們包括磷酸鈣沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe，1990)DEAE-右旋糖(Gopal，1985)，電穿孔(Tur-Kaspa，1986；Potter，1984)，直接顯微注射(Harland和Weintraub，1985)，負(fù)載DNA的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley，1979)和脂轉(zhuǎn)染胺-DNA復(fù)合物，細(xì)胞超聲處理(Fechheimer，1987)，用高速微粒轟擊基因(Yang，1990)，聚陽離子(Boussif，1995)，和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1988；Wu和Wu，1987)。這些技術(shù)中的一些可以成功地適于體內(nèi)或離體的應(yīng)用。D.膠態(tài)分散體系膠態(tài)分散體系構(gòu)成定向傳輸載體。這些分散體系包括大分子復(fù)合物，毫微囊復(fù)合物，毫微囊，微球體，小珠，和包括水包油型乳劑，膠粒，混合的膠粒和脂質(zhì)體的脂基系統(tǒng)。本發(fā)明中優(yōu)選的膠態(tài)體系就是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種人工膜泡囊，用作體外和體內(nèi)的輸送載體。已經(jīng)顯示，范圍在0.2-4.0um的大單層泡囊(LUV)可以包裹足夠量的大分子的水緩沖液。RNA，DNA和完整的病毒粒子可被包裹到水性內(nèi)部，并以生物學(xué)活性的形式輸送到細(xì)胞(Fraley，等)。除了哺乳動物細(xì)胞，脂質(zhì)體已經(jīng)用于在植物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞中輸送多核苷酸。為了使脂質(zhì)體成為有效的基因傳遞載體，需要存在如下特征(1)以高精度包裹目的基因，而不破壞它們的生物學(xué)活性；(2)同非靶細(xì)胞比較，優(yōu)先并充分結(jié)合靶細(xì)胞；(3)高效輸送泡囊的水狀內(nèi)含物到靶細(xì)胞質(zhì)；和(4)正確而有效地表達(dá)遺傳信息(Manning，等，Biotechniques，6682，1988)。本發(fā)明的實(shí)施方案提出合成肽可以制劑為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂，尤其是高相轉(zhuǎn)移溫度的磷脂的組合，通常結(jié)合類固醇，尤其是膽固醇。也可使用其它磷脂或其它磷脂。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)取決于PH，離子強(qiáng)度，和二價陽離子的存在。在脂質(zhì)體生產(chǎn)中有用的脂類的例子包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘脂，腦苷脂，和神經(jīng)節(jié)苷脂。尤其有用的是二?；字８视停渲兄|(zhì)部分含有14-18個碳原子，尤其是16-18個碳原子，并且是飽和的。例證性的磷脂包括蛋卵磷脂，二棕櫚酰卵磷脂，二硬脂酰卵磷脂。脂質(zhì)體的靶向可以基于結(jié)構(gòu)分類和機(jī)制因素分類。結(jié)構(gòu)學(xué)的分類是基于選擇性水平，如器官特異的，細(xì)胞特異的和細(xì)胞器特異的。機(jī)制靶向目標(biāo)的區(qū)分是基于它是主動或被動的。在含有竇狀毛細(xì)管的器官中，被動靶向目標(biāo)利用脂質(zhì)體向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞分配的天然趨勢。相反，主動靶向目標(biāo)涉及脂質(zhì)體的改變，通過將脂質(zhì)體與特定配體如，單克隆抗體，糖，糖脂或蛋白質(zhì)結(jié)合，或通過改變組成或脂質(zhì)體的大小以靶向器官和細(xì)胞型，而不是定位于自然發(fā)生的位點(diǎn)。被定向的傳輸體系的表面可以各種方式修改。在脂質(zhì)體的定向傳輸體系中，為了使定向配體保持與脂質(zhì)體雙分子層穩(wěn)定接觸，脂基可以被結(jié)合到脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層中。各種連接基團(tuán)可被用于將質(zhì)鏈結(jié)合到定向配體上。E.藥物組合物本發(fā)明包括合成肽在形成藥物組合物中的使用。一般來講藥物組合物包括有效量的一或多種蛋白質(zhì)序列、核酸或抗體或溶解或分散在藥學(xué)可接受載體中的附加試劑。短語“藥物或藥學(xué)可接受的”是指分子實(shí)體和組分，當(dāng)它們被適當(dāng)?shù)厥┯糜谀撤N動物時，如人，不會產(chǎn)生不利的、過敏性的或其它不良反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知包含至少一種蛋白質(zhì)序列、核酸或抗體或附加活性成分的藥物組合物的制備，如Remington’sPharmaceuticalSciences(18thEd.MackPrintingCompany，1990)所例示的，此處引入作為參考。此外，對于動物(例如人)的給藥，應(yīng)該了解，制備應(yīng)符合FDA所要求的無菌、致熱性、一般安全性和純度的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。如在這里所用的，“藥學(xué)可接收的載體”包括任何和所有溶劑、分散培養(yǎng)基、涂料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(比如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)，吸收延遲劑、鹽類、防腐劑、麻醉劑、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、分散劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等或其組合，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的(例如參見Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，Mack印刷公司，1990，pp.1289-1329，此處引入作為參考)。除了任何常規(guī)的載體與活性成分不相容的情況，考慮其在治療性的或藥物組合物中的使用。蛋白質(zhì)序列、核酸或抗體可包含不同的載體類型，這取決于它是否以固體、液體或氣霧劑的形態(tài)被施用，也取決于在以某種方式施用，如注射方式時，是否需要無菌。本發(fā)明可以通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、損傷內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、葉鞘內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、腫瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、泡內(nèi)、粘膜內(nèi)、心包內(nèi)、口服、局部、局部地施藥，使用氣霧劑、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞，通過導(dǎo)液管、通過灌洗、在乳液內(nèi)、在脂類組合物中(例如脂質(zhì)體)，或通過其它的方式或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的前述方法的結(jié)合(參見，如Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，Ed.Mack印刷公司，1990，此處引入作為參考)。本發(fā)明的組合物施用于動物患者的用量取決于身體和生理因素，如體重、病情的嚴(yán)重程度、被治療的疾病類型、先前或并存治療的干涉、患者原發(fā)病和給藥途徑。在任何情況下，負(fù)責(zé)施藥的專業(yè)醫(yī)生決定組合物中活性成分的濃度和針對個體患者的適當(dāng)劑量。在某些具體方式中，藥物組合物可包含，例如，約0.1％的活性化合物。在其它實(shí)施方案中，例如，一種活性化合物可能包含2％左右到75％左右的單位重量，或25％左右到60％左右，或其中可導(dǎo)出的任何范圍。在其它非限制性的例子中，劑量可以包含從約1微克/千克/體重、5微克/千克/體重、10微克/千克/體重、50微克/千克/體重、100微克/千克/體重、200微克/千克/體重、350微克/千克/體重、500微克/千克/體重、1毫克/千克/體重、5毫克/千克/體重、10毫克/千克/體重、50毫克/千克/體重、100毫克/千克/體重、200毫克/千克/體重、350毫克/千克/體重、500毫克/千克/體重、到約1000毫克/千克/體重或更多，也可以是其中可導(dǎo)出的任何范圍。基于上文所描述的數(shù)量，從此處所列出的數(shù)字可導(dǎo)出的非限制性的例子中，可以施用范圍從約5毫克/千克/體重到約100毫克/千克/體重、約5微克/千克/體重到約500微克/千克/體重的范圍等。在任何情況下，該組合物可包括各種抗氧化劑來阻止一種或多種組分的氧化。另外，通過防腐劑可以防止微生物的作用，例如各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，包括但不局限于對羥基苯甲酸酯類(如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、工汞硫代水楊酸鈉或其組合。蛋白質(zhì)序列、核酸或抗體可以配制成游離堿，中性的或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽，包括酸加成鹽，如，與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的，或與無機(jī)酸形成的，如鹽酸或磷酸，或某種有機(jī)酸如醋酸，草酸，酒石酸或苦杏仁酸。帶有游離羧基的鹽形式也可由無機(jī)堿衍生，如鈉，鉀，銨，鈣或鐵的氫氧化物；或某種有機(jī)堿如異丙胺，三甲胺，組氨酸或普魯卡因。在組合物為液體形式的實(shí)施方案中，載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，包括但不局限于水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、類脂(如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)及其組合。保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如，通過使用如磷脂酰膽堿的包衣；通過由在載體例如液體多元醇或脂類中的分散保持所需顆粒的大??；通過使用如羥丙基纖維素的表面活性劑；或這些方式的組合。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲試劑，如，糖，氯化鈉或其組合。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中也可施用滴眼液，鼻溶液或噴霧劑，或氣霧劑或吸入劑。某些組合物通常被設(shè)計(jì)為與靶組織型相兼容的。在非限制性的實(shí)例中，鼻溶液是一種水溶液，通常被設(shè)計(jì)為以滴加或噴灑方式施用到鼻通道上。制備鼻溶液使其在很多方面類似于鼻分泌物，并由此保持正常的纖毛功能。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，水性鼻溶液通常是等滲的或有輕微緩沖以保持約5.5至約6.5的PH。此外，如果需要，該制劑可包括類似用于眼藥制劑的抗微生物防腐劑，藥品，或適當(dāng)?shù)乃幬锓€(wěn)定劑。例如，各種商品鼻制劑已知的并包括藥品，如抗生素或抗組胺劑等。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)序列，核酸或抗體的給藥可以通過某些途徑如口服。在這些實(shí)施方案中，該固體組合物可包括如，溶液，懸浮液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊(如硬或軟殼膠囊)，持續(xù)釋放制劑，含服組合物、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑或其組合。口服組合物可直接與食物結(jié)合。口服給藥的優(yōu)選載體包含惰性稀釋液、可吸收的食用載體或其組合。本發(fā)明的其它方面，口服組合物可被作為糖漿劑或酏劑制備。糖漿劑或酏劑也可包括，如，至少一種活性成分，甜味劑，防腐劑，風(fēng)味劑，染料，防腐劑，或其組合。.在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，口服組合物可包括一或多種粘合劑，賦形劑，分散劑，潤滑劑，風(fēng)味劑，及其組合。在某些實(shí)施方案中，組合物可包括一或多種如下試劑粘合劑，如，黃蓍膠，阿拉伯樹膠，玉米淀粉，明膠或其組合；賦形劑，如，磷酸二鈣，甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂，或其組合；分散劑，如，玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，海藻酸或其組合；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如蔗糖，乳糖，糖精，或其組合；風(fēng)味劑，如薄荷，鹿蹄草油，櫻桃香料，桔子香料等；或上述物質(zhì)的組合。當(dāng)所述單位的劑型是膠囊時，除了上述類型的物質(zhì)，它可包括載體，如液體載體。各種其它物質(zhì)可以作為包衣存在，或以不同的方式改變單位藥劑的物理形式。適用于其它給藥方式的另一劑型包括栓劑。栓劑是各種重量和形狀的固體制劑形式，通常通過插入直腸，陰道或尿道用藥。插入后，栓劑變軟，融化或溶解到腔內(nèi)體液中。通常，對于栓劑可使用常規(guī)載體，如，聚(亞烷基)二醇，甘油三酯或其組合。在某些實(shí)施方案中，栓劑可混合物形成，其包括如，活性成分約0.5％至約10％，并優(yōu)選約1％至約2％。無菌可注射溶液是通過在過濾滅菌后，在適當(dāng)?shù)娜軇┲屑尤胨枇康幕钚曰衔锖透鞣N上文列舉的其它成分制備而成。通常，通過加入各種無菌活性成分到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和/或其它成分的無菌載體中制備分散體。當(dāng)無菌粉末用于制備無菌可注射溶液，懸浮液或乳狀液時，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，它能從先前的無菌過濾的液體介質(zhì)中產(chǎn)生出活性成分加任何所需附加成分的粉末。如果必要，液態(tài)介質(zhì)應(yīng)該被適當(dāng)緩沖，并且在注射之前，液體稀釋劑首先用足夠的鹽或糖進(jìn)行等滲。也設(shè)計(jì)制備用于直接注射的高濃度組合物，其中考慮使用DMSO作為溶劑以導(dǎo)致非?？焖俚臐B透，輸送高濃度的活性成分到小面積。組合物在制造和貯藏條件下必須穩(wěn)定，并保存于抗微生物如細(xì)菌和真菌污染條件下。應(yīng)該了解，內(nèi)毒素污染應(yīng)該控制到最小水平，如少于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收劑，如一硬脂酸鋁，明膠或其組合而實(shí)現(xiàn)。由于肽可以作為一種免疫治療劑施用于患者，基于脂類的組合物也與本發(fā)明相關(guān)。這些將在下文中詳細(xì)論述。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種新的組合物，其包括與至少一種肽聯(lián)合的一或多種類脂。脂類是一種特性不溶于水并可用有機(jī)溶劑萃取的物質(zhì)。脂類包括，如天然出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)的脂肪滴，以及這類本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化合物種類，它們都含有長鏈脂肪族烴類及其它衍生物，如脂肪酸，醇，胺，氨基醇和醛。當(dāng)然，不同于在此特別描述的化合物，其它本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的作為脂類的化合物也包括在本發(fā)明的化合物和方法中。脂類可以是天然存在的或合成的(如人工設(shè)計(jì)或生產(chǎn)的)。然而，脂類通常是生物物質(zhì)。生物脂類是本領(lǐng)域公知的，包括如中性脂肪，磷脂，磷酸甘油酯，類固醇，萜，溶血脂類(lysolipid)，鞘糖脂，糖脂，硫化物(sulphatide)，帶有醚和脂連接脂肪酸的脂類和可聚合的脂類，以及其組合。II.脂類類型中性脂肪包括甘油和脂肪酸。典型的甘油是三碳醇。脂肪酸通常由末端帶有酸性部分(如，羧酸)的長碳鏈組成。典型的脂肪酸碳鏈可以是任何長度的，但是，優(yōu)選的碳鏈長度是從約2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29到約30或更多的碳原子，以及由它們導(dǎo)出的任何范圍。然而，脂肪酸的鏈部分優(yōu)選的范圍是從約14至24個碳原子，在某些實(shí)施方案中尤其優(yōu)選約16至約18個碳原子。在某些實(shí)施方案中，脂肪酸碳鏈可包括奇數(shù)個碳原子，而在某些實(shí)施方案中優(yōu)選包括偶數(shù)個碳原子。在碳鏈上僅含有單鍵的脂肪酸被稱為飽和的，而在碳鏈上包含至少一個雙鍵的脂肪酸被稱為不飽和的。具體的脂肪酸包括，但不限于亞油酸，油酸，棕櫚酸，亞麻酸，硬脂酸，月桂酸，豆蔻酸，花生酸，棕櫚油酸，花生四烯酸，蓖麻油酸，結(jié)核硬脂酸，乳桿酸。一個或多個脂肪酸的酸性基團(tuán)共價結(jié)合到甘油的一個或多個羥基上。因此，單脂酰甘油酯由一個甘油和一個脂肪酸組成，一個二脂酰甘油酯由由一個甘油和兩個脂肪酸組成，一個三脂酰甘油酯由一個甘油和三個脂肪酸組成。磷脂通常包括甘油或鞘氨醇部分，產(chǎn)生兩性化合物的磷酸鹽離子基團(tuán)，和一或多個脂肪酸。磷脂的類型包括，如甘油磷酯，其中磷酸鹽基團(tuán)與二脂酰甘油酯中甘油的第一個碳原子相連；和鞘磷脂(如神經(jīng)鞘磷脂)，其中磷酸基團(tuán)被鞘氨醇的氨基醇酯化。另一個鞘磷脂的實(shí)例是硫苷脂，其中包括一個硫酸鹽離子基團(tuán)，它使得該分子具有兩性。當(dāng)然，磷脂也包括更多的化學(xué)基團(tuán)，例如，與磷酸基團(tuán)相連的醇。這些醇基團(tuán)包括絲氨酸，乙醇胺，膽堿，甘油和肌醇。因此，特定的磷酸甘油酯包括磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇。其它的磷脂包括磷脂酸或二乙酰磷酸。一方面，磷脂酰膽堿包括二油酰基磷脂酰膽堿(如心磷脂)，蛋磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，單豆蔻酰磷脂酰膽堿，單棕櫚酰磷脂酰膽堿，單硬脂酰磷脂酰膽堿，單油酰磷脂酰膽堿，二丁酰磷脂酰膽堿，二戊酰磷脂酰膽堿，二癸酰磷脂酰膽堿，二庚酰磷脂酰膽堿，二辛酰磷脂酰膽堿或二硬脂酰磷脂酰膽堿。糖脂與鞘磷脂相關(guān)，但包含連接鞘氨脂的伯羥基的糖基團(tuán)而不是磷酸基團(tuán)。一種類型的糖脂稱為腦苷脂，包含一個糖基(如，葡萄糖或半乳糖)連接伯羥基。另一個糖脂的實(shí)例是神經(jīng)節(jié)苷脂(如，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，GM1)，它包含大約2，3，4，5，6，7左右個糖基，其可為支鏈的，連接伯羥基。在另外的實(shí)施方案中，糖脂是神經(jīng)酰胺(如，乳糖酰神經(jīng)酰胺)。類固醇是菲的四元環(huán)體系衍生物。類固醇通常在細(xì)胞，組織和有機(jī)體中有調(diào)節(jié)功能，包括如，結(jié)合孕激素中的激素和相關(guān)的化合物(如孕酮)，糖皮質(zhì)激素(如氫化可的松)，鹽皮質(zhì)激素(如醛甾酮)，雄激素(如睪酮)和雌激素(如雌酮)系列。膽固醇是類固醇的另一實(shí)例，并通常提供結(jié)構(gòu)而非調(diào)節(jié)功能。維生素D是另一個固醇的實(shí)例，它涉及從小腸內(nèi)吸收鈣。萜是包含一或多個五碳異戊二烯基團(tuán)的脂類。萜有各種生物功能，包括，如維生素A，輔酶Q和類胡蘿卜素(如番茄紅素和β-胡蘿卜素)。B.帶電荷的和中性的脂類組合物在某些實(shí)施方案中，組合物的脂類成分是不帶電的或原本不帶電的。在一個實(shí)施方案中，組合物的脂類成分包括一或多種中性脂類。另一方面，組合物的脂類成分實(shí)質(zhì)上可以不含陰離子的和陽離子的脂類，如某些磷脂(如磷脂?；憠A)和膽固醇。在某些方面，不帶電的或原本不帶電的脂類組合物包含約95％，96％，97％。98％，99％，100％的不帶任何電荷的脂類成分，基本不帶電的脂類，和/或帶有等量正電荷和負(fù)電荷的脂類混合物。在其它方面，脂類組合物可以是帶電荷的。如，根據(jù)本發(fā)明，帶電荷的磷脂可用于制備脂類組合物，并可以帶有陽性凈電荷或陰性凈電荷。在非限制性實(shí)例中，二乙酰磷酸可用來使脂類組合物帶負(fù)電荷，且硬脂酰胺可用來使脂類組合物帶正電荷。C.制造脂類如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，脂類可由天然來源，商品或化學(xué)合成獲得。例如，磷脂可從天然來源獲得，如雞蛋或大豆磷脂酰膽堿，腦磷脂酸，腦或植物磷脂酰肌醇，心磷脂和植物或細(xì)菌磷脂酰乙醇胺。在另一個實(shí)例中，適于根據(jù)本發(fā)明使用的脂類可以從商業(yè)來源中獲得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰膽堿(“DMPC”)可從SigmaChemicalCo.獲得，聯(lián)十六烷基磷酸(“DCP”)從K&K實(shí)驗(yàn)室(Plainview，NY)獲得，膽固醇從Calbiochem-Behring獲得，二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它可以從AvantiPolarLipids，Inc.(Birmingham，Ala.)獲得的脂類。在某些實(shí)施方案中，在氯仿或氯仿/甲醇中的脂類原液可貯存于約-20℃下。優(yōu)選地，氯仿作為唯一的溶劑，因?yàn)樗燃状几渍舭l(fā)。D.脂類組合物結(jié)構(gòu)在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，肽與脂類相連。與脂類相連的肽可被分散到含有脂類的溶液中，用脂類溶解、乳化、混合、聯(lián)合，共價結(jié)合到脂類上，以懸浮液包含于脂類中，用膠束或脂質(zhì)體包含或混合，或與脂類或脂類結(jié)構(gòu)相連。本發(fā)明的脂類或脂類/嵌合多肽聯(lián)合的組合物不局限于任何特殊結(jié)構(gòu)。例如，它們也可僅被散布在溶液中，可能形成大小或性狀不統(tǒng)一的聚合體。在另一個實(shí)例中，它們可以存在于一個雙層結(jié)構(gòu)中，如膠束，或用一個“塌陷的”結(jié)構(gòu)。在另一個非限制性的實(shí)例中，脂轉(zhuǎn)胺(GibcoBRL)-嵌合多肽或Superfect(Qiagen)-嵌合多肽復(fù)合物也被考慮。在某些實(shí)施方案中，脂類組合物可包括約1％，約2％，約3％，約4％約5％，約6％，約7％，約8％，約9％，約10％，約11％，約12％，約13％，約14％，約15％，約16％，約17％，約18％，約19％，約20％，約21％，約22％，約23％，約24％，約25％，約26％，約27％，約28％，約29％，約30％，約31％，約32％，約33％，約34％，約35％，約36％，約37％，約38％，約39％，約40％，約41％，約42％，約43％，約44％，約45％，約46％，約47％，約48％，約49％，約50％，約51％，約52％，約53％，約54％，約55％，約56％，約57％，約58％，約59％，約60％，約61％，約62％，約63％，約64％，約65％，約66％，約67％，約68％，約69％，約70％，約71％，約72％，約73％，約74％，約75％，約76％，約77％，約78％，約79％，約80％，約81％，約82％，約83％，約84％，約85％，約86％，約87％，約88％，約89％，約90％，約91％，約92％，約93％，約94％，約95％，約96％，約97％，約98％，約99％，約100％或從中導(dǎo)出的任何范圍的特定脂類，脂類型或非脂類成分，如藥物，蛋白質(zhì)，糖，核苷酸或其它本發(fā)明公開的或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的物質(zhì)。在非限制性的實(shí)例中，脂類組合物可包括約10％到約20％的中性脂類，和約33％至約34％的腦苷脂類，和約1％的膽固醇。在另一個非限制性的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可以包括約4％至約12％的萜，其中約1％的膠束是特定的番茄紅素，剩余約3％至約11％的脂質(zhì)體由其它萜組成；且還包括約10％至約35％的磷脂酰膽堿和約1％的藥。因此，本發(fā)明的脂類組合物可以以任何組合或百分比范圍包括任何脂類，脂類型或其它成分。1.乳劑脂類可被包含于乳劑中。脂類乳劑基本永久的異源液體混合物，它由兩種或多種通?；ゲ蝗芙獾囊后w通過機(jī)械攪拌或通過加入少量已知的乳化劑添加物質(zhì)獲得。制備脂類乳劑的方法和加入的添加成分是本領(lǐng)域公知的(如，ModernPharmaceutics，，1990，此處引入作為參考)。例如，一種或多種脂類被加入到乙醇或氯仿或任何其它合適的有機(jī)溶劑中并用手工或機(jī)械技術(shù)攪拌。然后該溶劑從混合物中蒸發(fā)，留下干的脂類光滑面。該脂類在水性介質(zhì)中重懸，如磷酸緩沖鹽，最后得到乳劑。為了得到大小分布更均質(zhì)的乳化脂類，可以用常規(guī)的超聲處理技術(shù)超聲處理該混合物，使用顯微流態(tài)化處理進(jìn)行進(jìn)一步乳化(如，使用Mierofluidizer，Newton，Mass.)，和/或高壓(如在600psi)下擠壓利用ExtruderDevice(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)。2.膠束脂類可被包含在膠束中。膠束是脂類組合物的群集物或聚集體，通常是脂單層形式，并通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何膠束生產(chǎn)步驟制備(如，Canfieldetal.，1990；El-Gorabetal，1973；Shinodaetal.，1963；和Fendleretal.，1975，分別引入此處作為參考)。例如，一或多種脂類在有機(jī)溶劑中一般制成懸浮液，蒸發(fā)該溶劑，該脂類重懸在水溶液中，超聲處理，然后離心。3.脂質(zhì)體在特定實(shí)施方案中，脂類由脂質(zhì)體組成?！爸|(zhì)體”是一個專業(yè)術(shù)語包括通過產(chǎn)生封閉的脂類雙分子層或聚集體形成的各種單或多層脂類媒介物。脂質(zhì)體可以表征為帶有雙分子層膜的膜泡結(jié)構(gòu)，通常包括磷脂，和通常包含水性組合物的內(nèi)部介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個脂類層。當(dāng)含有磷脂的脂類懸浮于過量的水溶液中時，多層脂質(zhì)體自然形成。在形成封閉結(jié)構(gòu)之前，脂類組分進(jìn)行自身重排，并且在脂類雙分子層之間捕獲水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。親脂性或帶有親脂區(qū)域的分子也可以溶解或結(jié)合到脂類雙分子層中。在某些較不優(yōu)選的實(shí)施方案中，天然來源的磷脂，如蛋或大豆磷脂酰膽堿，腦磷脂酸，腦或植物磷脂酰肌醇，心磷脂和植物或細(xì)菌磷脂酰乙醇胺最好不要用作主要的磷脂，即不構(gòu)成50％或更多的總磷脂組成或脂質(zhì)體，因?yàn)榈玫街|(zhì)體會不穩(wěn)定性和有易漏性。在特定的實(shí)施方案中，脂類和/或嵌合多肽可以，例如，包裹在脂質(zhì)體的水性內(nèi)部，散布在脂質(zhì)體的脂類雙分子層內(nèi)，通過與脂質(zhì)體和嵌合多肽相連的連接分子連接到脂質(zhì)體上，被脂質(zhì)體捕獲，與脂質(zhì)體復(fù)合等。a.制備脂質(zhì)體如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知，根據(jù)本發(fā)明使用的脂質(zhì)體可以通過不同的方法制備。當(dāng)磷脂分散到水中時，根據(jù)脂類與水的比例，它可以形成非脂質(zhì)體的各種結(jié)構(gòu)。低比率時，脂質(zhì)體是優(yōu)選結(jié)構(gòu)。例如，磷脂(AvantiPolarLipids，Alabaster，AL)，如中性磷脂，二油?；字Ｄ憠A(DOPC)溶解于叔丁醇中。該脂類然后混合嵌合多肽，和/或其它成分。在該脂類混合物中加入Tween20，使得Tween20占組合物重量的5％。過量的叔丁醇加入到該混合物中，使得該叔丁醇的體積至少占95％。該混合物被渦旋混合，冷凍在干冰/丙酮浴中并過夜凍干。該凍干的制劑貯存于-20℃，并可使用三個月。當(dāng)需要時，凍干的脂質(zhì)體在0.9％的鹽水中重構(gòu)。用于封閉嵌合多肽的微粒用Tween20獲得，它們的平均粒徑是約0.7至1.0um?；蛘撸|(zhì)體可以在容器中通過在溶劑中混合脂類制備，如，玻璃的，梨形燒瓶。該容器的體積應(yīng)該大于要求的脂質(zhì)體懸浮液體積的十倍。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，溶劑在真空中接近40℃時被除去。該溶劑通常在約5分鐘至2小時之內(nèi)被除去，這取決于需要的脂質(zhì)體的體積。該組合物可以在干燥器中進(jìn)一步被干燥。由于隨著時間有變質(zhì)的趨勢，干燥的脂類通常在約一周后丟棄。在無菌的、無熱原的水中以25-50mM的磷脂重構(gòu)干燥的脂類，通過振蕩直到所有的脂類薄層被重懸。該含水脂質(zhì)體然后被等分，分別裝入到小瓶中，凍干并在真空中密封。在其它可選擇性的方法中，脂質(zhì)體可以按照其它已知的實(shí)驗(yàn)方法制備(如，參見Banghametal.，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster1983，Szoka和Papahadjopoulos，1978，分別在相關(guān)部分引入作為參考)。這些方法因它們各自捕獲含水物質(zhì)的能力以及它們各自的間隙與脂類的比率而不同。按照上文制得的干燥的脂類或凍干的脂質(zhì)體可以在抑制肽的溶液中脫水和重構(gòu)，并可用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩胶线m的濃度，如DPBS。然后在渦旋混合器中用力晃動該混合物。未包封的添加物質(zhì)，如藥劑(包括但不限于激素，藥物，核苷酸組成等等)通過在29,000Xg下離心除去，而脂質(zhì)體沉淀被清洗。清洗的脂質(zhì)體以適當(dāng)?shù)目偭字瑵舛戎貞?，如約50-200mM。包封的添加物質(zhì)或活性劑的數(shù)量可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法確定。脂質(zhì)體制備中包封的附加物質(zhì)或活性劑的數(shù)量確定后，脂質(zhì)體可溶解于適當(dāng)?shù)臐舛炔①A存于4℃?zhèn)溆?。包含脂質(zhì)體的藥物組合物通常包括一種無菌的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，如水或鹽水。根據(jù)合成方法，脂質(zhì)體的大小可變。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以是多種大小。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體很小，如外徑小于約100nm，約90nm，約80nm，約70nm，約60nm，或小于約50nm。制備這種脂質(zhì)體時，可以使用此處描述的任何方法或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法。其它制備脂質(zhì)體的非限制性實(shí)施例描述于美國專利4,728,578、4,728,575，4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；國際申請PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；英國專利申請GB2193095A；Mayeretal.，1986；Hopeetal.，1985；Mayhewetal.1987；Mayhewetal.，1984；Chengetal.，1987；和Gregoriadis，1984，分別引入此處作為參考)。懸浮于水溶液的脂質(zhì)體通常是球形囊泡狀，具有一或多個脂類雙層分子的同心層。每層由式XY代表的分子的平行排列組成，其中X是親水部分，Y是疏水部分。在水懸浮液中，同心層排列使親水部分傾向于保持與水相接觸而疏水區(qū)域傾向于自聯(lián)合。例如，當(dāng)水相既存在于脂質(zhì)體內(nèi)又存在于脂質(zhì)體外時，脂類分子可以形成一個排列為XY-YX的雙分子層，即通常所說的薄層。當(dāng)一個以上的脂類分子的親水和疏水部分開始互相結(jié)合時，可以形成脂類聚集體。這些聚集體的大小和形狀依賴許多不同的變量，如溶劑的性質(zhì)和溶液中其它化合物的存在。在(I)反相蒸發(fā)(II)脫水-再水合(III)洗滌劑透析和(IV)薄膜水合之后，通常通過超聲處理或脂質(zhì)體混合物的連續(xù)排出得到脂類制劑產(chǎn)品。一方面，在某些實(shí)施方案中制備脂質(zhì)體的方法包括熱超聲處理，和通過過濾器或孔徑減小的膜的連續(xù)排出，從而得到小的，穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。這種制備只產(chǎn)生適當(dāng)和均一大小的脂質(zhì)體/嵌合多肽或脂質(zhì)體，它們的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且產(chǎn)生極大的活性。該技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，如Martin，1990)。只要生產(chǎn)出來，脂類結(jié)構(gòu)可用于包裹有毒性的(如化學(xué)療法)或在循環(huán)中不穩(wěn)定的(如核酸)化合物。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)依賴PH，離子強(qiáng)度和/或二價陽離子的存在。脂質(zhì)體可顯示對離子和/或極性物質(zhì)的低滲透性，但是相變過程溫度的升高明顯地改變了它們的滲透性。相變涉及從密集的，有序的結(jié)構(gòu)(稱為明膠態(tài))到松散包裹的，無序的結(jié)構(gòu)(稱為液態(tài))。該現(xiàn)象發(fā)生于特有的相變溫度和/或?qū)е聦﹄x子，糖和/或藥物的滲透性的增長。脂質(zhì)體包裹已經(jīng)使得這些化合物的毒性降低并且血清半衰期增長(Gabizonetal.，1990)。脂質(zhì)體通過四種不同的機(jī)制影響細(xì)胞傳輸藥劑通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細(xì)胞的胞吞作用，如巨噬細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞；通過非特異性的弱疏水力和/或靜電力吸附到細(xì)胞表面，和/或通過與細(xì)胞表面組分的特異性相互作用；通過將脂質(zhì)體的脂類雙分子層插入質(zhì)膜與質(zhì)膜融合，同時釋放脂質(zhì)體內(nèi)含物到細(xì)胞質(zhì)中；和/或通過轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體脂類到細(xì)胞膜和/或亞細(xì)胞膜上，和/或反過來同樣，而不需要與任何脂質(zhì)體內(nèi)含物聯(lián)合。雖然不止一種機(jī)制可以同時操作，但脂質(zhì)體制劑可以改變哪種機(jī)制有效。許多疾病的治療使用基于脂類的基因轉(zhuǎn)移策略以強(qiáng)化常規(guī)療法或建立新的療法，尤其是針對高增殖性疾病的療法。脂質(zhì)體制劑的進(jìn)展已經(jīng)改善了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的效率(Templetonetal.，1997)并且考慮通過這些方法制備脂質(zhì)體。為傳輸核酸的基于脂質(zhì)體的另一制備方法已有描述(WO99/18933)。在另一個脂質(zhì)體制劑中，一種稱為溶劑稀釋微載體(SDMC)的兩性載體能夠?qū)⑻囟ǚ肿诱系街愝d體的雙分子層中(美國專利5,879,703)。SDMC可用于傳輸脂多糖，多肽，核酸等。當(dāng)然，制備脂質(zhì)體的任何其它方法可被技術(shù)人員使用以獲得本發(fā)明中需要的脂質(zhì)體配方。b.定向配體定向配體既可以被固定于復(fù)合物的疏水部分，也可以連接到復(fù)合物親水部分的反應(yīng)性末端基團(tuán)上。定向配體可通過一個對反應(yīng)基團(tuán)的連接而結(jié)合脂質(zhì)體，如在親水聚合物的遠(yuǎn)端。優(yōu)選的反應(yīng)基團(tuán)包括氨基，羧基，酰基和硫醇基。定向配體與親水聚合物的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有機(jī)化學(xué)方法進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，定向配體的總濃度可從約0.01至約10％mol。定向配體是對目標(biāo)區(qū)域特定組分特異的任何配體。優(yōu)選的定向配體包括蛋白質(zhì)如多克隆或單克隆抗體、抗體片斷或嵌合抗體，酶或激素類，或糖類如單-，寡-和多糖(參見Heathetal.，1986)。例如，二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2是一種腫瘤抗原，它已經(jīng)鑒別為神經(jīng)外胚層起源的腫瘤，如成神經(jīng)細(xì)胞瘤，黑色素瘤，小細(xì)胞肺癌瘤，膠質(zhì)瘤和某些肉瘤(Mujooetal.，1986，Schulzetal.，1984)。含有抗二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2單克隆抗體的脂質(zhì)體已經(jīng)被用于輔助將脂質(zhì)體定向到表達(dá)腫瘤抗原的細(xì)胞上(Montaldoetal.，1999；Paganetal.，1999)。在另一個非限制性的實(shí)施例中，乳腺癌和婦科癌癥抗原特異的抗體描述于美國專利5,939,277中，此處引入作為參考。在進(jìn)一步非限制性的實(shí)施例中，前列腺癌特異抗體公開于美國專利6,107,090中，此處引入作為參考。因此，考慮此處描述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的抗體可以用于與本發(fā)明組合物和方法結(jié)合靶向特異的組織和細(xì)胞型。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，考慮的定向配體與整聯(lián)蛋白，蛋白多糖，糖蛋白，受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用。合適的配體包括任何對目標(biāo)器官細(xì)胞特異的物質(zhì)，或?qū)δ繕?biāo)器官的結(jié)構(gòu)特異的物質(zhì)，該目標(biāo)器官由于局部病理如腫瘤而暴露于循環(huán)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，為了提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加對目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或?yàn)榱讼拗撇恍枰?xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抗體或環(huán)狀肽的定向部分(配體)與脂類復(fù)合物相連。這種方法是本領(lǐng)域公知的。例如，特異性靶向哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的脂質(zhì)體已被進(jìn)一步描述(美國專利5,786,214，此處引入作為參考)。脂質(zhì)體基本由N-戊二酰磷脂酰乙醇胺，膽固醇和油酸組成，其中對神經(jīng)膠質(zhì)特異的單克隆抗體與脂質(zhì)體綴合。一種單克隆抗體或抗體片斷可用于向動物體內(nèi)的特異性細(xì)胞，組織或器官如腦，心臟，肺，肝等的定向傳輸。更進(jìn)一步，通過受體介導(dǎo)的傳輸和/或含有脂類或脂質(zhì)體的定向載體，嵌合多肽可以輸送到靶細(xì)胞。它們利用，發(fā)生在靶細(xì)胞上的受體介導(dǎo)的胞吞作用對大分子選擇性的攝取。鑒于各種受體的細(xì)胞型特異的分布，這一傳輸方法另外增加了本發(fā)明的特異性程度。因此，在本發(fā)明的某些方面，選擇相應(yīng)于特異性表達(dá)于目標(biāo)細(xì)胞群受體的配體。細(xì)胞特異性的嵌合多肽輸送和/或定向載體可包括與脂質(zhì)體結(jié)合的特定的結(jié)合配體。將要傳輸?shù)那逗隙嚯陌庥谥|(zhì)體中并且特異的結(jié)合配體功能性地結(jié)合于脂質(zhì)體膜上。從而該脂質(zhì)體特異性地結(jié)合到目標(biāo)細(xì)胞的受體上并將內(nèi)含物傳輸?shù)郊?xì)胞中。這一系統(tǒng)已顯示其功能，使用其中例如上皮生長因子(EGF)用于將核酸經(jīng)受體介導(dǎo)傳輸?shù)斤@示EGF受體上調(diào)的細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，受體介導(dǎo)的傳輸和/或定向載體包括細(xì)胞受體特異的配體和肽。其它包括細(xì)胞受體特異的配體，將要傳輸?shù)碾挠行нB接到該配體上。例如，一些受體已被用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Wu和Wu，1987；Wagneretal.，1990；Peralesetal.，1994；Myers，EPO0273085)，它證實(shí)了該技術(shù)的可操作性。在另一個實(shí)施例中，在另一種哺乳動物細(xì)胞類型中的特異性的傳輸已經(jīng)被公開(Wu和Wu，1993；此處引入作為參考)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，特異性的結(jié)合配體可以包括一或多種指導(dǎo)細(xì)胞特異性結(jié)合的脂類或糖蛋白。例如，乳酰神經(jīng)酰胺，半乳糖末端去唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，已經(jīng)結(jié)合到脂質(zhì)體中并觀察到肝細(xì)胞對胰島素基因攝取量的增加(Nicolauetal.，1987)。含有末端半乳糖殘基的去唾液酸糖蛋白，去唾液酸胎球蛋白也已被證明了將脂質(zhì)體靶向肝臟的作用(SpanjerandScherphof，1983；Haraetal.，1996)。當(dāng)與多肽的主鏈結(jié)合時，糖類甘露酰、海藻酰或N-乙酰葡糖胺結(jié)合高親和性甘露糖(manose)受體上(美國專利5,432,260，此處整體特別引入作為參考)。本發(fā)明的細(xì)胞或組織特異性的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體可以類似的方式被特異地傳輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞。在另一個實(shí)施例中，乳酰神經(jīng)酰胺和靶向LDL受體相關(guān)蛋白的肽，如載脂蛋白E3(″ApoE″)用于將脂質(zhì)體靶向肝(SpanjerandScherphof，1983；WO98/0748)。葉酸和葉酸受體用于細(xì)胞定向也已被公開(美國專利5,871,727)。在此實(shí)施例中，維生素葉酸結(jié)合到復(fù)合物上。葉酸受體對其配基具有高親和性，并且在一些哺乳動物細(xì)胞系中過量表達(dá)，包括肺、乳房和腦腫瘤中?？谷~酸，如氨甲蝶呤也可用作定向配體。轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的傳輸系統(tǒng)靶向大范圍的表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的復(fù)制性細(xì)胞(Gillilandetal.，1980)。c.脂質(zhì)體/核酸組合物在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體/嵌合多肽可包括核酸，如一種寡核苷酸，多核苷酸或核酸構(gòu)建體(如一種表達(dá)載體)。當(dāng)在將要轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的DNA構(gòu)建體中應(yīng)用細(xì)菌啟動子時，在脂質(zhì)體中包含一種合適的細(xì)菌聚合酶是有利的。當(dāng)脂質(zhì)體/嵌合多肽組合物考慮為包括細(xì)胞或組織特異的核酸時，該技術(shù)在本發(fā)明中具有適用性。在某些實(shí)施方案中，基于脂類的非病毒制劑提供了病毒基因治療的另一方案。盡管許多細(xì)胞培養(yǎng)研究已經(jīng)證明了基于脂類的非病毒基因轉(zhuǎn)移，但通過基于脂類的制劑的系統(tǒng)性基因傳輸有限制。非病毒的基于脂類的基因傳輸?shù)闹饕拗剖顷栯x子脂類的毒性，該陽離子脂類包含非病毒傳輸載體。脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性說明了體外和體內(nèi)之間基因轉(zhuǎn)移結(jié)果的差異。另一個構(gòu)成這一對立數(shù)據(jù)的因素是在和無血清蛋白時脂質(zhì)體穩(wěn)定性的差異。脂質(zhì)體和血清蛋白之間的相互作用對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性具有驚人的影響(Yang和Huang，1997)。陰離子脂質(zhì)體吸引并結(jié)合帶負(fù)電的血清蛋白。包有血清蛋白的脂質(zhì)體被溶解或被巨噬細(xì)胞吸收，使得它們從循環(huán)中清除?，F(xiàn)有的體內(nèi)脂質(zhì)體傳輸方法使用煙霧化，皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)或顱內(nèi)注射，以避免循環(huán)中陽離子脂類相關(guān)的毒性和穩(wěn)定性問題。脂質(zhì)體和血漿蛋白之間的相互作用是造成體外(Felgneretal.，1987)與體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效果差異的重要原因(Zhuetal.，1993；Philipetal.，1993；Solodinetal.，1995；Liuetal.，1995；Thierryetal.，1995；Aksentijevichetal.，1996)。d.脂類的施用施于患者的脂類組合物(如，脂質(zhì)體-嵌合多肽)的實(shí)際劑量取決于身體或生理因素，如體重，病情的嚴(yán)重性，患者的原發(fā)病和給藥的途徑?？紤]到這些因素，可以容易的確定適于特定患者和/或治療過程的脂類組合物的劑量。本發(fā)明可以通過靜脈那，皮內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，損傷內(nèi)，顱內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，前列腺內(nèi)，胸膜內(nèi)，氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，玻璃體內(nèi)，葉鞘內(nèi)，直腸內(nèi)，局部，腫瘤內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，膜泡內(nèi)，粘膜，心包內(nèi)，口服，局部，局部地給藥和/或利用氣霧劑，注射，連續(xù)灌注，直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞或通過導(dǎo)管和/或灌洗。IX.試劑盒本發(fā)明的某些實(shí)施方案關(guān)于診斷和治療試劑盒。肽可以試劑盒的形式利用來確定帶有HPV的患者發(fā)展和復(fù)發(fā)癌前期的或癌的生長的可能性。試劑盒可以確定T細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖的激發(fā)和/或T輔助1細(xì)胞因子產(chǎn)量的增加。各種試劑盒的組分可以貯藏于合適的容器中。該容器通常包括至少一個小瓶，試管，燒瓶，瓶子，注射器或其它容器，肽試劑被放置于其內(nèi)，優(yōu)選適當(dāng)?shù)胤峙?。試劑盒也包括第二容器，用來盛放無菌的，藥學(xué)可接受的緩沖液或其它溶液。本發(fā)明的試劑盒也典型地包括一種緊密盛放小瓶的器具，用于商業(yè)銷售，如注射劑或吹模制的塑料容器，其中所需小瓶被保留。試劑盒可含有檢測樣品與抗體之間的相互作用的試劑(檢測試劑)。提供的試劑可被放射性物質(zhì)，熒光或酶標(biāo)記。試劑盒可包含一種已知的放射性標(biāo)記的試劑，能夠與抗體結(jié)合或相互作用，該抗體允許檢測和/或測量細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這些方法包括首先獲得疑似含有這些蛋白質(zhì)，肽或抗體的樣品，按照本發(fā)明的方法將樣品與抗體或肽接觸，根據(jù)具體情況，在允許免疫復(fù)合物形成的有效條件下，檢測免疫復(fù)合物的形成。在一些實(shí)施方案中，在一個合適的容器中包括一或多種E6和/或E7肽。樣品可與該肽接觸或溫育，然后檢測該樣品針對該肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這樣，在一些實(shí)施方案中，試劑盒中含有一種非反應(yīng)性結(jié)構(gòu)，在一些實(shí)施方案中，該非反應(yīng)性結(jié)構(gòu)可以是塑料或一些其它的合成材料。非反應(yīng)性結(jié)構(gòu)可以是一種盛樣品的容器，如帶有小孔的容器。作為本發(fā)明的一部分，也包括帶有多孔的容器。在一些情況下，該結(jié)構(gòu)被劃線或附有膜。一個用膜劃線分割的小孔可用于溫育E6或E7肽，然后用同樣的容器檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這一過程可通過利用檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抗體來進(jìn)行。該抗體包括抗TH1或TH2細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體或任何其它T細(xì)胞上指示細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的受體的抗體。檢測試劑也包括在試劑盒中。試劑盒的試劑可以液體溶液，附著于固相支持物的或干粉的形式被供給。當(dāng)試劑以液體溶液形式被供給時，該液體溶液是水溶液。優(yōu)選地，當(dāng)試劑被附著到固相支持物上被供給時，固相支持物可以是層析介質(zhì)，多孔檢測板，或載玻片。當(dāng)被供給的試劑是一種干粉時，粉末通過添加合適溶劑重構(gòu)的方式供給。通常，對免疫復(fù)合物形成的檢測是本領(lǐng)域公知的并可通過使用許多方法獲得。例如，本發(fā)明考慮使用ELISA，RIA，免疫印跡(如斑點(diǎn)印跡)，ELISPOT，間接免疫熒光技術(shù)以及類似方法。通常免疫復(fù)合物的形成通過使用標(biāo)記物來檢測，如放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記(如堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，或其類似物)。當(dāng)然，我們發(fā)現(xiàn)使用第二結(jié)合配體，如第二抗體或生物素/親和素配體的結(jié)合配置時具有附加的優(yōu)點(diǎn)，正如本領(lǐng)域公知的。為了達(dá)到檢測目的，事實(shí)上可以使用任何疑似含有能發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的樣品，視情況而定。樣品可包括細(xì)胞，細(xì)胞上清液，細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞提取物，酶級分，蛋白提取物，或其它疑似含有能產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的細(xì)胞的非細(xì)胞組合物。一般而言，符合本發(fā)明的試劑盒包括至少一種E6或E7肽和抗與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)組合物的抗體，以及免疫檢測試劑和容納抗體，肽，和試劑的容器。免疫檢測試劑典型地包括與抗體或抗原，或與第二結(jié)合配體相連的標(biāo)記物。示例的配體可包括與標(biāo)記物相連的抗第一抗體或抗原或生物素或親和素(或鏈霉抗生物素蛋白)配體的第二抗體。當(dāng)然，如上文提到的，許多典型的標(biāo)記物是本領(lǐng)域公知的并且所有這些標(biāo)記物都可在本發(fā)明的相關(guān)之處應(yīng)用。容器中通常包括其中可以放置抗體、抗原或檢測試劑的小瓶，優(yōu)選容器被適當(dāng)?shù)氐确?。本發(fā)明的試劑盒也典型地包括用來緊密容納抗體、抗原、和試劑的容器的器具，用于商業(yè)銷售。容器可包括注射劑或吹模制的塑料容器，所需小瓶被保留在里面。在一個實(shí)施方案中，診斷試劑盒包括探針和引物，用于核酸的檢測方法。在生物樣品中檢測肽標(biāo)記物必需的所有材料和試劑都一起裝配到試劑盒中。這通常包含為特定標(biāo)記物預(yù)選的引物。也包括適合擴(kuò)增核酸的酶，這些酶包括各種聚合酶(RT，Taq，etc.)，以及脫氧核苷酸和緩沖液，以提供擴(kuò)增所必需的反應(yīng)混合物。這樣的試劑盒通常以適當(dāng)?shù)姆绞皆诓煌萜髦邪鞣N單獨(dú)的試劑和酶，以及針對各種標(biāo)記物的引物對。優(yōu)選的擴(kuò)增核苷酸的引物被選擇用來擴(kuò)增SEQIDNO1-19或其互補(bǔ)序列中的特定序列。在另一個實(shí)施方案中，這種試劑盒包含特異性于與SEQIDNO1-19描述的序列或其互補(bǔ)序列相應(yīng)的雜交探針。以適當(dāng)?shù)姆绞剑@種試劑盒通常在不同容器中包含各種單獨(dú)的試劑和酶，以及雜交探針。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于上述免疫檢測方法的免疫檢測試劑盒。由于所述肽通常是蛋白質(zhì)、多肽或肽，因此該肽優(yōu)選包括在試劑盒中。免疫檢測試劑盒因此在適當(dāng)?shù)娜萜髦邪ㄔ撾?，和任選的免疫檢測試劑。試劑盒的免疫檢測試劑可以有一或多種形式，包括那些與給出的抗體相聯(lián)系或連接的可檢測的標(biāo)記物。與第二結(jié)合配體相聯(lián)系或結(jié)合的可檢測的標(biāo)記物也被考慮。典型的第二配體是與第一抗體有結(jié)合親和力的第二抗體。試劑盒可進(jìn)一步包括被合適等分的野生型或突變體蛋白、多肽或肽組合物，標(biāo)記的或非標(biāo)記的，用于繪制檢測分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑盒也包含抗體標(biāo)記綴合物，以完全綴合形式、以中間物形式，或作為單獨(dú)部分由試劑盒使用者綴合的形式。試劑盒的成分可以包裝于水介質(zhì)中或?yàn)閮龈尚问健１景l(fā)明的治療試劑盒是包含肽序列SEQIDNO1-19肽的試劑盒。上述試劑盒通常在適當(dāng)?shù)娜萜髦泻兴帉W(xué)可接受的多肽、肽、生物功能等效物、免疫片斷、功能區(qū)、抑制因子、抗體、基因、多核苷酸，核酸或補(bǔ)體的制劑或以藥學(xué)可接受的形式表達(dá)上述任何物質(zhì)的載體。試劑盒可以只有一個容器，或者每種化合物可具有不同的容器。當(dāng)試劑盒的組分在一或多種液體溶液中供給時，該液體溶液是水溶液，尤其優(yōu)選無菌水溶液。肽組分也可以被制成可注射組和物的形式。在這種情況下，容器本身可以是注射器，移液管，或其它類似的儀器，制劑可以從中應(yīng)用到身體的感染部位，注射到動物體內(nèi)，或甚至應(yīng)用于試劑盒的其它組分中并與之混合。然而，試劑盒的成分還可以干粉的形式供給。當(dāng)以干粉提供試劑或成分時，粉末通過添加適當(dāng)?shù)娜軇┍恢貥?gòu)。預(yù)想該溶劑可以在另一個容器中供給。試劑盒的容器通常包括至少一個小瓶，試管，燒瓶，瓶子，注射器或其它容器，其中可放置抗體，且優(yōu)選適當(dāng)?shù)氐确?。?dāng)多肽或肽，或第二或第三結(jié)合配體或附加組分被供給時，試劑盒也通常包括第二，第三或其它附加容器，其中可以放置這種配體或組分。本發(fā)明的試劑盒也典型地包括一種器具，用來緊密容納抗體，抗原和任何其它試劑的容器，用于商業(yè)銷售。容器可以包括注射劑或吹模制的塑料容器，所需小瓶被保留在其中。不管容器的數(shù)量或類型，本發(fā)明的試劑盒也可包含或被包裝有儀器來輔助注射/給藥或在體內(nèi)放置最終的肽。這種儀器可以是注射器，移液管，鑷子，或任何醫(yī)學(xué)上允許的輸送工具。實(shí)施例以下包括的實(shí)例顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，由發(fā)明者揭示的公開于實(shí)施例的技術(shù)在實(shí)踐本發(fā)明時功能很好，該技術(shù)是代表技術(shù)，因而被認(rèn)為它構(gòu)成了實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容了解到，在公開的特定實(shí)施方案中，可以做出一些改變，并仍能獲得類似或同樣的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1材料和方法患者本發(fā)明的實(shí)施方案中包含一組被研究群體，她們選自在德克薩斯州大學(xué)M.D.安德森癌癥中心的陰道鏡檢查診所受診的患者。征得病人的同意，根據(jù)研究院內(nèi)倫理委員會批準(zhǔn)的協(xié)議，實(shí)施所有規(guī)程。這些婦女年齡為17歲或更大，且沒有懷孕，沒有免疫病史。該研究鑒定了四組婦女。第1組由六個無CIN細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷并且具有HPV陰性試驗(yàn)的婦女組成(CIN(-)/HPV(-))。第2組包括31個帶有CIN組織學(xué)診斷并且HPV陽性試驗(yàn)(CIN(+)/HPV(+))的婦女。第3和4組選自在研究之前在陰道鏡檢查診所經(jīng)過CIN燒蝕或切除治療至少6個月的婦女。第3和4組的婦女在CIN治療之前是(CIN(+)/HPV(+))。然而，在登記時，也就是CIN治療后最少6個月之后，這些婦女僅被評估病情。第3組由22個沒有復(fù)發(fā)CIN跡象的婦女組成(Recur(-))，第4組包括10個組織學(xué)診斷復(fù)發(fā)CIN的婦女(Recur(+))。HPV陽性利用Virapap/Viratype檢測確定的(TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)。在這一程序中，對HPV的RNA的斑點(diǎn)印跡雜交是利用來自宮頸擦拭簽的脫落的宮頸上皮細(xì)胞完成的。檢測方法包括使用32P標(biāo)記DNA探針組，它鑒定HPV型號6/11，16/18，和31/33/35。根據(jù)廠商的說明書分離并處理細(xì)胞。在研究時，這種檢測被用作陰道鏡檢查時的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理步驟的部分。HPV陽性通過PCR進(jìn)一步被確定，該P(yáng)CR使用從如先前所述的石蠟包被的組織活檢中提取的DNA(Ting等，1990；Schiffman等，1991)。用于PCR分析的一致引物來自乳頭瘤病毒的LI開放可讀框(MY11，GCMCAGGGWCATAAYAATGG(SEQIDNO23)和MY09，CGTCCMARRGGAWACTGATC(SEQIDNO24)；其中M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，Y＝C+T)。HPV-16陽性利用特異寡核苷酸探針CATACACCTCCAGCACCTAA(SEQIDNO25)證實(shí)。研究的受檢者的臨床性狀，包括HPV狀態(tài)列于表2。研究受檢者的性狀性狀總計(jì)第1組第2組第3組第4組患者數(shù)量696312210平均年齡3131313227年齡范圍17-5417-4321-5018-5420-39人種白色人種52(75.4％)3(50％)26(83.9％)15(68.2％)8(80％)西班牙人8(12.6％)3(50％)1(3.2％)4(18.2％)0(0％)非洲-美州人8(12.6％)0(0％)33(9.7％)3(13.6％)0(0％)亞洲人1(1.4％)0(0％)1(3.2％)0(0％)0(0％)HPV狀態(tài)陰性6(8.7％)6(100％)0(0％)0(0％)0(0％)陽性63(91.3％)0(0％)31(100％)22(100％)10(100％)HPV-1657(90.5％)0(0％)31(100％)17(77.3％)9(90％)其它HPV類型6(9.5％)0(0％)0(0％)5(22.7％)1(10％)最初診斷結(jié)果*陰性6(8.7％)6(100％)0(0％)0(0％)0(0％)CIN14(5.8％)0(0％)0(0％)4(18.2％)0(0％)CIN2&359(85.5％)0(0％)31(100％)18(81.8％)10(100％)*注第3組中，在招來研究時對CIN診斷是陰性，而第4組中，對于CIN2/3的診斷為陽性。肽基于相關(guān)現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述的已知的T細(xì)胞表位的兩性結(jié)構(gòu)和信息選擇相應(yīng)于HPV-16的E6和E7癌蛋白的肽序列。表3列出了用于本發(fā)明研究的肽。所有的肽的制備如早期報導(dǎo)的(Sarkar等，1995)用Merrifield固相方法(Merrifield，1963)或者在改良的Vega250自動肽合成機(jī)上合成(VegaBiochemicals，Tucson，AZ)或利用Houghten，1985描述的“袋”方法合成。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，使用的肽的純度近似為70-80％，在一些實(shí)驗(yàn)中，使用顯示純度＞95％的肽，也具有同樣的結(jié)果。除了E6和E7肽之外，我們使用了來自c-mos原癌基因的肽[氨基酸158-170，STRTPEDSNSLGT(SEQIDNO22)]作為陰性對照。肽的貯存液在PBS(pH7.0)中制備并過濾滅菌。T細(xì)胞增殖分析通過靜脈穿刺從研究的參與者中收集肝素化的血，在Ficoll-Hypaque密度梯度下離心分離PBMC(Histopaque-1073；SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。用PHA，c-mou肽，或個別的E6和E7肽刺激以后，不同個體中的PBMC增殖反應(yīng)用先前描述的[3H]胸腺嘧啶摻入分析來確定(Nehete等，1996)(表4)。簡要地，各樣品在96孔微量滴定板上接種三份，并于37℃在潮濕的含5％CO2的空氣中培養(yǎng)7天。在最后的16-18小時，加入1μCi的3[H]胸腺嘧啶(6.7Ci/mmol；ICNBiomedicals，Inc.，CostaMesa，CA)。在過濾條上收集細(xì)胞以估計(jì)3[H]胸腺嘧啶的摻入。經(jīng)各種添加劑處理的細(xì)胞的特異放射性在所有情況下通過減去僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)值來計(jì)算。預(yù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，在5ug/ml，各種肽產(chǎn)生一致的增殖水平。針對個別E6和E7肽的T細(xì)胞增殖反應(yīng)的顯著性(根據(jù)刺激指數(shù)[SI])，可以計(jì)算為暴露于肽的細(xì)胞超過未加入肽的對照組細(xì)胞的3[H]胸腺嘧啶摻入的增加倍數(shù)。當(dāng)SI值＞3.0時，被認(rèn)為是陽性反應(yīng)，它可用于所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以確定增殖反應(yīng)的顯著性與疾病解除或疾病復(fù)發(fā)狀況的關(guān)系。在所有的實(shí)驗(yàn)中，三份樣品的數(shù)據(jù)相當(dāng)，其標(biāo)準(zhǔn)誤差＜10％。在已測試的四個研究組中，沒有婦女顯示出特異于對照c-mos肽的增殖反應(yīng)(SI＜2.0)。表3來自HPV-16的E6和E7肽的氨基酸序列aa，氨基酸細(xì)胞因子分析在該檢測中使用冷藏的PBMC。PBMC(1×105)與各種HPV肽在RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10％的胎牛血清)中，于37℃在96孔圓底板的三個等同的孔中培養(yǎng)48小時。離心后，上清液(100ul)從各孔中取出，并于-70℃冷凍貯存在另一塊96孔板中。然后解凍該板，并按照廠商的說明，用細(xì)胞篩選免疫分析試劑盒(BiosourceInternational，Camarillo，CA)檢測上清液的各種細(xì)胞因子(IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10和IL-12)。統(tǒng)計(jì)分析利用PearsonX2和Fisher精確試驗(yàn)(exacttest)評估患者組之間的SI值的差別。為了統(tǒng)計(jì)分析，顯著的增殖反應(yīng)被定義為SI≥3.0。統(tǒng)計(jì)顯著性被設(shè)置在p＜0.05。實(shí)施例2年齡范圍從17至54歲(平均31歲)的一共69個婦女參與該研究。在這些69個婦女中，52個白種人，非洲裔美國人和西班牙人各8人，1個亞洲人(表2)。分析來自這些婦女的PBMC針對合成的肽的增殖反應(yīng)，這些肽相應(yīng)于HPV-16癌蛋白E6和E7的抗原序列(表3)(圖1A)。在不同的四組患者中，對各種E6和E7肽特異的增殖反應(yīng)的分析顯示第3組的大多數(shù)患者(Recur(-))對所有測試的七種E6肽和7/8的E7肽顯示陽性反應(yīng)(SI≥3.0)(圖1A)。另一方面，在第2組(CIN(+)/HPV(+))中僅5/31的未治療患者顯示了對任何測試的肽的反應(yīng)，第1組(CIN(-)/HPV(-))和第4組(Recur(+))中對任何測試的肽沒有反應(yīng)。圖1B概括了上述內(nèi)容。在第3和4組的婦女中，對E6和/或E7肽的增殖反應(yīng)與治療后疾病狀況之間的關(guān)系顯示于表4。盡管第4組(Recur(-))的患者沒有顯示出對任何試驗(yàn)的E6或E7肽的反應(yīng)，但在第3組中，有64％的患者對于E6肽(p＝0.001)具有顯著的增殖反應(yīng)，82％對E7肽(p＜0.001)，和86％對E6或E7肽(p＜0.001)中的至少一種顯示明顯的增殖反應(yīng)。第3組和第4組對普通的促細(xì)胞分裂原如PHA(p＝0.912，未顯示數(shù)據(jù))的增殖反應(yīng)沒有區(qū)別，這表明這些患者的先天免疫狀況并沒有損傷。這些結(jié)論強(qiáng)烈表明針對來自HPV-16的E6和E7癌蛋白的合成肽的增殖反應(yīng)與CIN治療后的無疾病情況有關(guān)。發(fā)明者確定了針對兩種分別來自E6((Q15L和V10C)和E7(Q19D和R9F)肽的高水平增殖反應(yīng)。據(jù)SI值，典型的增殖反應(yīng)示于圖2，它們分別來自第3和4組的2個患者對HPV-16的E6癌蛋白的7個合成肽和E7癌蛋白的8個合成肽的增殖反應(yīng)。針對這四個肽的增殖反應(yīng)的比較顯示了第3組和第4組的婦女之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上的明顯差異(表5)。雖然在第4組中沒有觀察到對這些肽的增殖反應(yīng)，但在第3組中總計(jì)11個婦女對肽Q15L(p＝0.006)顯示出反應(yīng)，10人對肽VIOC(p＝0.006)，13人對肽Q19D(p＝0.002)，和10人對肽R9F(p＝0.013)有反應(yīng)。如表3所示，在E6肽V10C中10個氨基酸中有9個與Q15L肽的重疊。同樣地，E7肽R9F的9個氨基酸與Q19D肽的氨基酸重疊。對這四種肽特異的增殖反應(yīng)一起包括了在第3組(Recur(-))中觀察到的所有反應(yīng)(19/22的婦女)。這些結(jié)果表明，對于HPV特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，分別在HPV-16癌蛋白E6和E7中的Q15L和Q19D肽可能是免疫決定區(qū)域。在被研究群體的分樣品中，發(fā)明者也測試這些肽是否也誘導(dǎo)各種TH1和TH2細(xì)胞因子的生產(chǎn)。來自第三組(Recur(-))的8位婦女和第四組(Recur(+))6位婦女的冷藏的PBMC在體外用肽Q15L和Q19D刺激。培養(yǎng)物上清液中各種TH1細(xì)胞因子(IL-2，IL-12，和IFN-□)，和TH2細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)的數(shù)量在相對未刺激培養(yǎng)物矯正以后，示于圖3。第三組(Recur(-))中8位中的7位(87.5％)，和8位中的5位(62.5％)婦女的PBMC顯示IFN-□和IL-2的生產(chǎn)，分別響應(yīng)于Q15L和Q19D兩者(表6)。另外，在這一組8位婦女的3位中觀察到響應(yīng)于Q15L的IL-12的產(chǎn)生，而Q19D介導(dǎo)的IL-12生產(chǎn)在8位婦女的6位中明顯。另一方面，這一組婦女的PBMC不響應(yīng)于用肽Q15L或Q19D刺激而分泌IL-4，而只有3個婦女顯示出響應(yīng)于上述任一肽的IL-10的生產(chǎn)。與第三組(Recur(-))的婦女相反，第四組(Recur(+))的婦女突出顯示IL-10的生產(chǎn)(5/6由于Q15L，6/6由于Q19D)。當(dāng)用兩種試驗(yàn)肽中任一刺激PBMC時，觀察到這組的6位婦女中的1位顯示IL-4的生產(chǎn)(表6)?？偟膩碚f，這些結(jié)果顯示，第三組(Recur(-))中的患者主要顯示出TH1細(xì)胞因子生產(chǎn)(IL-2，IFN-γ和IL-12)，而第四組(Recur(+))中的婦女盡管不顯示直接針對HPV肽的特定增殖反應(yīng)，但卻顯示一種TH2細(xì)胞因子，IL-10的生產(chǎn)。表4針對HPV-16癌蛋白E6和/或E7的所有合成肽的增殖反應(yīng)與CIN治療后的病情之間的相關(guān)性增殖反應(yīng)第3組(無疾病)第4組(復(fù)發(fā))顯著性E6肽是a14(64％)0否b8(36％)10(100％)p＝0.001E7肽是a18(82％)0否b4(18％)10(100％)p＜0.001任何E6或E7肽是a19(86％)0否b3(14％)10(100％)p＜0.001aSI≥3.0bSI＜3.0表5對HPV-16癌蛋白E6和/或E7的特定的合成肽的增殖反應(yīng)與CIN治療后的病情之間的相關(guān)性增殖反應(yīng)第3組第4組顯著性(無疾病)(n＝22)(復(fù)發(fā))(n＝10)E6肽Q15L是a11(50％)0否b11(50％)10(100％)P＝0.006V10C是a11(50％)0否b11(50％)10(100％)P＝0.006E7肽Q19D是a13(59％)0否b9(41％)10(100％)P＝0.002R9F是a10(46％)0否b12(54％)10(100％)P＝0.013aSI≥3.0bSI＜3.0表6響應(yīng)于HPV-16a的E6和E7癌蛋白合成肽刺激的第3和4組患者PBMC細(xì)胞因子生產(chǎn)細(xì)胞因子b第3組(n＝8)第4組(n＝6)Q15LcQ19DdQ15LQ19DIFN-γ7/87/80/60/6IL-25/85/80/60/6IL-123/86/80/60/6IL-40/80/81/61/6IL-103/83/85/66/6a陽性患者數(shù)量/測試人數(shù)b細(xì)胞因子生產(chǎn)的陽性是基于用于每個細(xì)胞因子的檢測試劑盒的靈敏度的值，按照濃度pg/mlIL-2＝8.7，IFN-y＝4.0，IL-12＝1.0，IL-4＝2.0，和IL-10＝5.0。c來自HPV-16中E6癌蛋白的Q15L肽d來自HPV-16中E7癌蛋白的Q19D肽根據(jù)本發(fā)明的公開，不需要過多的實(shí)驗(yàn)就可以制成和實(shí)施此處公開和要求保護(hù)的所有組合物和方法。雖然根據(jù)優(yōu)選方式已經(jīng)描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然，可以改變所述組合物和方法和方法的步驟和步驟的順序，而不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地，某些化學(xué)上和物理上相關(guān)的試劑明顯地可替代本發(fā)明在此所述的試劑，并且可獲得相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯了解所有這些類似的取代和改變都包含于本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)，作為附加的權(quán)利被限定。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)特別引入本文作為參考。U.S.Patent3,817,837U.S.Patent3,850,752U.S.Patent3,939,350U.S.Patent3,996,345U.S.Patent4,162,282U.S.Patent4,275,149U.S.Patent4,277,437U.S.Patent4,310,505U.S.Patent4,533,254U.S.Patent4,683,195U.S.Patent4,683,202U.S.Patent4,728,575U.S.Patent4,728,578U.S.Patent4,737,323U.S.Patent4,797,368U.S.Patent4,800,159U.S.Patent4,883,750U.S.Patent4,921,706U.S.Patent5,028,592U.S.Patent5,139,941U.S.Patent5,279,721U.S.Patent5,432,260U.S.Patent5,786,214U.S.Patent5,840,317U.S.Patent5,840,873U.S.Patent5,843,640U.S.Patent5,843,651U.S.Patent5,843,663U.S.Patent5,846,708U.S.Patent5,846,717U.S.Patent5,846,726U.S.Patent5,846,729U.S.Patent5,849,481U.S.Patent5,849,486U.S.Patent5,849,487U.S.Patent5,851,772U.S.Patent5,853,990U.S.Patent5,853,992U.S.Patent5,853,993U.S.Patent5,856,092U.S.Patent5,861,244U.S.Patent5,863,732U.S.Patent5,863,753U.S.Patent5,866,331U.S.Patent5,871,727U.S.Patent5,879,703U.S.Patent5,882,654U.S.Patent5,900,481U.S.Patent5,905,024U.S.Patent5,910,407U.S.Patent5,912,124U.S.Patent5,912,145U.S.Patent5,919,626U.S.Patent5,919,630U.S.Patent5,925,517U.S.Patent5,928,862U.S.Patent5,928,869U.S.Patent5,929,227U.S.Patent5,932,413U.S.Patent5,935,791U.S.Patent5,939,277U.S.Patent6,107,090U.S.Patent6,135,965U.S.Patent6,214,874U.S.Patent6,238,659U.S.Patent6,245,568U.S.Patent6,258,576EPANo.320,308EPANo.329,822EPO0273085GBApplicationNo.2202328GBApplicationNo.2193095APCTApplicationNo.PCT/US85/01161PCTApplicationNo.PCT/US87/00880PCTApplicationNo.PCT/US89/01025PCTApplicationNo.PCT/US89/05040；PCTApplicationWO88/10315PCTApplicationWO89/06700WO90/07641WO98/0748WO99/18933Abbondanzo，etal.，AmJClinPathol.，93(5)698-702，1990.Abe，etal.，NeurosciRes.，38(4)325-9，2000.Aichele，etal.，JExpMed.，171(5)1815-20，1990.Aksentijevichetal.，HumGeneTher.，7(9)1111-22，1996.Allred，etal.，ArchSurg.1990Jan；125(1)107-13.Review.Altmanetal.，Science，27494-96，1996.Baichwaletal.，“VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAvirusesTransientandstableexpressionoftransferredgenes，”InGeneTransfer，Kucherlapati，R.，ed.，Bajorin，etal.，JClinOncol.，6(5)786-92，1988.Bangham，etal.，JMol.Biol.，13238-252，1965.Barany，etal.，“Solid-PbasePeptideSynthesis，”InThePeptidesAtalysis，Synthesis，Biology，GrossandMeinhofer，eds.，AcademicPress、NewYork，pp.3-284，1980.Bevan，etal.，Nature，342(6249)478-9，1989.Birner，etal.，ModPathol.，14(7)702-9，2001.Boussifetal.，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，927297-7301，1995.Brinton，etal.，InN.Munoz，F(xiàn).X.Bosch，K.V.Shah，andA.Meheus(eds.)，TheEpidemiologyofCervicalCancerandHumanPapillomavirus(IARCScientificPublications，119)，pp.3-23.LyonOxfordUniversityPress，1992.Brown，etal.，AmJVetRes.，51(9)1476-80，1990.Cantieldetal.，MethodsinEnzymology，189，418-422，1990.Capaldi，etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，74(2)425-433，1977.Casement，etal.，Virology，211(1)261-7，1995Cason，etal.，Int.J.Cancer，50349-355，1992.Changetal.，Hepatology，14134A，1991.Chen，etal.，Mol.CellBiol.，72745-2752，1987.Cheng，etal.，InvestigativeRadiology，vol.22，pp.47-55(1987).Clarketal.，HumanGeneTherapy，61329-1341.1995Clave，etal.，Diagn.Mol.Pathol.，9(3)145-150，2000.Clerici，etal.，J.Natl.CancerInst.，89245-250，1997.Coffin，InVirology，F(xiàn)ieldsetal.，eds.，RavenPress，NewYork，pp.1437-1500，1990.Couparetal.，Gene，681-10，1988.Crowe，etal.，AIDSResHumRetroviruses，3(2)135-45，1987.daCosta，etal.，Biocell，23(1)65-72，1999.DeGruijil，etal.，J.Gen.Virol.77，2183-2191，1996.DeJager，etal.，SeminNuclMed.1993Apr，23(2)165-79.Review.Deamer，etal.，inLiposomes(M.Ostro，ed.)，MarcelDekker，Inc.，NewYork(1983)，pp.27-52.Deres，etal，Nature.1989Nov30；342(6249)561-4.Doolittle，etal.，MethodsMolBiol.1999；109215-37.ReviewelGorab，etal.，BiochimBiophysActa，306(1)58-66，1973.Fechheimeretal，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，848463-8467，1987.Felgneretal.，ProcNatlAcadSciUSA.，84(21)7413-7，1987.Feltkamp，etal.，Eur.J.Immunol，232242-2249，1993.Fendleetal.，CatalysisinMicellarandMacromolecularSystems，AcademicPress，NewYork，1975.Flotteetal.，GeneTherapy，229-37，1995.Flotte，etal.，Am.J.RespirCellMol.Biol.，7349-356，1992.Fraleyetal.，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，763348-3352，1979.Fraley，etal.，TrendsBiochem.Sci，677，1981Friedmann，Science，2441275-1281，1989.Frohman，PCRProtocolsAGuideToMethodsandApplications，AcademicPress，NewYork，1990.Fujishima，etal.，Cytometry.，24(4)382-9，1996.Gabizonetal.，CancerRes.，50(19)6371-8，1990.Ghosh，etal.，InWuG.WuCed.，Liverdiseases，targeteddiagnosisandtherapyusingspecificreceptorsandligands，NewYorkMarelDekker，pp.87-104，1991.Gillilandetal.，CancerRes.，40(10)3564-9，1980.Gloeckner，etal.，J.Immunol.Methods，252(1-2)131-8，2001.Gopal，Mol.CellBiol.，51188-1190，1985.Grahametal.，J.Gen.Virol.，3659-72，1977.Graham，etal.，Virology，52456-467，1973.Gregoriadis，etal.，BiochemBiophysResCommun.，89(4)1287-1293，1979.Gregoriadis，G.，ed.，LiposomeTechnology，vol.I，pp.30-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22>(6)<223>M＝A，C，或R<220><221>修飾的堿基<222>(8)..(9)<223>R＝A和G<220><221>修飾的堿基<222>(13)<223>W＝A和T<400>24cgtccmarrggawactgatc20<210>25<211>20<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒<400>25catacacctccagcacctaa20<210>26<211>98<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒16型<400>26MetHisGlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGln151015ProGluThrThrAspLeuTyrCysTyrGluGlnLeuSerAspSerSer202530GluGluGluAspGluIleAspGlyProAlaGlyGlnAlaGluProAsp354045ArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheCysCysLysCysAspSerThr505560LeuArgLeuCysValGlnSerThrHisValAspIleArgThrLeuGlu65707580AspLeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleValCysProIleCysSerGln859095LysPro<210>27<211>151<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒16型<400>27MetPheGlnAspProGlnGluArgProArgLysLeuProGlnLeuCys151015ThrGluLeuGlnThrThrIleHisAspIleIleLeuGluCysValTyr202530CysLysGlnGlnLeuLeuArgArgGluValTyrAspPheAlaPheArg354045AspLeuCysIleValTyrArgAspGlyAsnProTyrAlaValCysAsp505560LysCysLeuLysPheTyrSerLysIleSerGluTyrArgHisTyrCys65707580TyrSerValTyrGlyThrThrLeuGluGlnGlnTyrAsnLysProLeu859095CysAspLeuLeuIleArgCysIleAsnCysGlnLysProLeuCysPro100105110GluGluLysGlnArgHisLeuAspLysLysGlnArgPheHisAsnIle115120125ArgGlyArgTrpThrGlyArgCysMetSerCysCysArgSerSerArg130135140ThrArgArgGluThrGlnLeu145150權(quán)利要求1.一種確定感染有人乳頭瘤病毒(HPV)或疑似感染有HPV的患者癌前期的或癌的生長的復(fù)發(fā)可能性的方法，其中所述患者也在宮頸上或?qū)m頸周圍有或曾經(jīng)有過癌前期的或癌的生長，該方法包括a)來自患者的樣品與至少一種HPV的E6或E7肽溫育；和b)測定該樣品針對該肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品與至少兩種E6肽或至少兩種E7肽溫育。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品與HPV的E6肽溫育。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，P10I，Q20P，R16R或G10S。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C或其組合。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品與HPV的E7肽溫育。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述E7肽是Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或其組合。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品與至少一種E6肽和至少一種E7肽溫育。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者已知感染了HPV。11.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括確定所述患者是否感染有HPV。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者有或有過癌前期的生長。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述癌前期的生長是宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)。14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者不再有癌前期的或癌的生長。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者不再有癌前期的生長。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述癌前期的生長是CIN。17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是血液。18.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品通過陰道擦拭簽獲得。19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包含外周血單核細(xì)胞。20.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在獲得樣品之后在介質(zhì)中溫育該樣品。21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測定包括將樣品與肽接觸并測量樣品的T細(xì)胞增殖。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中通過測定氚化胸腺嘧啶核苷的摻入測定所述T細(xì)胞的增殖。23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述樣品具有大于或等于2.0的SI值，表明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述樣品具有大于或等于3.0的SI值，表明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。25.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測定包括測量TH1或TH2細(xì)胞因子的量。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述TH1細(xì)胞因子的量被測量。27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述TH1細(xì)胞因子是IL-2，IFN-γ，TNF-α或THF-β。28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述TH2細(xì)胞因子的量被測定。29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述TH2細(xì)胞因子是IL-4，IL-5，IL-10或IL-13。30.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述TH1或TH2細(xì)胞因子通過免疫測定測量。31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述免疫測定是ELISA或放射免疫測定法。32.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述TH1或TH2細(xì)胞因子用流式細(xì)胞儀測量。33.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品被測量不止一次。34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述樣品用不同的測定法測定。35.權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括從患者獲得第二份樣品并檢測該第二份樣品針對至少一種HPV的E6或E7肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。36.權(quán)利要求1所述的方法，其中在治療其癌前期的或癌的生長后至少一個月以后從患者獲得樣品。37.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者對其泌尿生殖道內(nèi)的癌前期的或癌的生長已經(jīng)受過燒蝕治療。38.一種鑒別有危險復(fù)發(fā)癌前期的或癌的生長的HPV感染患者的方法，包括a)用E6或E7肽溫育來自患者的血液樣品；b)評價所述樣品針對該肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的E6或E7肽具有K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，Q20P，P10I，R16R，G10S，T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C的氨基酸序列。40.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的人乳頭瘤病毒是高級型。41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的人乳頭瘤病毒是HPV16。42.一種防止感染有HPV并對其癌前期的或癌的生長接受過治療的患者復(fù)發(fā)其癌前期的或癌的生長的方法，包括a)鑒別有危險復(fù)發(fā)HPV相關(guān)的癌前期的或癌的生長的患者；與b)對該患者施用有效量的至少一種HPV的E6或E7肽來誘導(dǎo)針對該肽的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。43.一種用于確定感染有HPV并對其癌前期的或癌的生長接受過治療的患者復(fù)發(fā)其癌前期的或癌的生長的可能性的試劑盒，其在適當(dāng)?shù)娜萜髦邪?，至少一種E6或E7HPV肽，抗體，和檢測試劑。44.權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種E6肽。45.權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，VI0C，P9L，P10I，Q20P，R16R或GS10S。46.權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種E7肽。47.權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中所述E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C。48.權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述抗體抗TH1細(xì)胞因子。49.權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述抗體抗TH1細(xì)胞因子受體。全文摘要本發(fā)明涉及來自人乳頭瘤病毒(HPV)的E6和E7肽的用途，用于評價感染HPV的患者體內(nèi)的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答以確定該患者關(guān)于發(fā)生或復(fù)發(fā)包括子宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)的癌前期或癌的生長的預(yù)測。文檔編號G01N33/50GK1556863SQ02818351公開日2004年12月22日申請日期2002年7月19日優(yōu)先權(quán)日2001年7月20日發(fā)明者J·K·薩斯特里,G·托特雷羅－露納,M·弗倫,JK薩斯特里,乩茁露納申請人:得克薩斯大學(xué)體系董事會