本發(fā)明屬于益生菌領域，具體涉及一種益生菌共生體、培養(yǎng)方法及應用。

背景技術：

益生菌(probiotics)是一類通過改善宿主腸道微生物菌群的平衡而發(fā)揮作用的活性微生物，是人體腸道重要的生理細菌，對機體有多種其它正常生理菌群無法比擬的生理作用。其生理作用包括：調整腸道菌群；提高蛋白質和維生素的代謝；防止便秘；產生抗菌素：緩解乳糖不耐癥；治療肝損傷；降低結腸癌的發(fā)病率；抗腫瘤；增強免疫系統(tǒng)；降低膽固醇；治療泌尿系統(tǒng)感染等。腸道菌群的組成對人體營養(yǎng)、免疫、癌癥、衰老等有著密切的關系，促進腸道中有益菌的增殖，抑制有害細菌的生長，對于高血壓、高血脂、心臟病、糖尿病和癌癥等生活習慣病防治方面具有重要意義。

技術實現要素：

本發(fā)明的發(fā)明人經過不斷實驗，從一種傳統(tǒng)的乳制品中分離一對天然互惠共生乳酸菌，共生體益生菌sr-19與cr-29，都為革蘭氏陽性，兼性厭氧菌，其在相互促進生長方面產生了預料不到的效應，還通過驗證過的生產工藝對該共生體益生菌進行高密度發(fā)酵，本發(fā)明即是基于以上發(fā)現而完成。

本發(fā)明的第一個方面在于公開一種益生菌共生體，其特征在于，其包括cgmcc編號11870的耐久腸球菌cr-29(enterococcusduranscr-29)和cgmcc編號11869的腸膜明串珠菌腸膜亞種菌sr-19(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidessr-19)。

優(yōu)選的，所述益生菌共生體中，耐久腸球菌cr-29與腸膜明串珠菌腸膜亞種菌sr-19的cfu/g比例為1:10-10:1。

進一步優(yōu)選的，所述益生菌共生體中，耐久腸球菌cr-29與腸膜明串珠菌腸膜亞種菌sr-19的cfu/g比例為5：7。

本發(fā)明的第二個方面在于公開一種制備益生菌共生體的培養(yǎng)方法，

采用液體培養(yǎng)基，腸膜明串珠菌腸膜亞種均sr-19與耐久腸球菌cr-29的接種量分別為5％與7％，初始ph6.8；

初始培養(yǎng)溫度為44℃(1.0-1.5小時)；中段培養(yǎng)溫度為42℃(2.0-2.5小時)，發(fā)酵中段為ph5.9；末段培養(yǎng)溫度為38℃(1.5-2.0小時)；

振蕩頻率140r/min的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后添加補充營養(yǎng)物質繼續(xù)培養(yǎng)，至活菌數不小于1010cfu/ml收獲；

培養(yǎng)出的活菌體可通過低溫離心分離獲得；

所述液體培養(yǎng)基，即工業(yè)培養(yǎng)基，的配方為：脫脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，檸檬酸鈉2g/l,醋酸鈉0.5g/l，ph6.8-7.2；所述補充營養(yǎng)物質的配方為：牛肉膏與胡蘿卜原汁2:1體積混合溶液。

本發(fā)明的第三個方面在于公開一種益生菌共生體的菌粉，通過以下方法制成：活菌數不小于1010cfu/ml益生菌共生體發(fā)酵液經過濾或離心，利用凍干保護劑進行真空冷凍干燥，凍干曲線為：起始溫度-42℃，預凍4小時，-42℃至-5℃每小時升溫5℃；-5℃至11℃每小時升溫2℃，從10℃至40℃每小時升溫5℃；從40℃至50℃每小時升溫2℃，在30小時內完成凍干制備，制得共生體益生菌菌粉；以上操作均在無菌條件下進行。

本發(fā)明的第四個方面在于公開一種耐久腸球菌和/或腸膜明串珠菌腸膜亞種菌益生菌替代劑，用于在食品、食品添加劑、保健食品、人類藥品、獸藥、動物飼料。

本發(fā)明的第五個方面在于公開一種益生菌促生長劑，用于在食品、食品添加劑、保健食品、人類藥品、獸藥、動物飼料；所述益生菌選自保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌、糞腸球菌的一種或多種。

在一些實施例中，該共生體益生菌的生產過程是通過：接種、復壯、發(fā)酵培養(yǎng)、分離、凍干等步驟。具體的，

共生體益生菌腸膜明串珠菌腸膜亞種sr-19與耐久腸球菌cr-29的接種量5％與7％，培養(yǎng)基為：牛奶(羊奶或馬奶)、脫脂奶粉、乳清蛋白、維生素k、礦物元素為原料，初始培養(yǎng)溫度為44℃(1.0-1.5小時)；中段培養(yǎng)溫度為42℃(2.0-2.5小時)；末段培養(yǎng)溫度為38℃(1.5-2.0小時)。初始ph6.8，發(fā)酵中段為ph5.9，振蕩頻率140r/min的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后以補料速度6.3m/h補充營養(yǎng)物質(牛肉膏與胡蘿卜汁2:1混合溶液)繼續(xù)培養(yǎng)至收獲可使益生菌菌活菌數不小于1010cfu/ml以上。培養(yǎng)出的活菌體可通過低溫離心分離(6000r/min)獲得，利用海藻酸鈉、木糖醇、初乳蛋白(2:1:1)作為凍干保護劑進行真空冷凍干燥，凍干曲線為：起始溫度-42℃，預凍4小時，-42℃至-5℃每小時升溫5℃；-5℃至11℃每小時升溫2℃，從10℃至40℃每小時升溫5℃；從40℃至50℃每小時升溫2℃，在30小時內完成凍干制備，制的共生體益生菌菌粉。

所述培養(yǎng)基與凍干保護劑配方：

益生菌共生體的培養(yǎng)基詳細配方，包括各組分和含量；實驗室培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000ml，ph6.4。

工業(yè)化培養(yǎng)基組成為:脫脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，檸檬酸鈉2g/l,醋酸鈉0.5g/l，ph6.8-7.2。補充營養(yǎng)物質：牛肉膏beefextract與胡蘿卜原汁2:1混合溶液按發(fā)酵總量的0.8％補充；

培養(yǎng)基121℃濕熱滅菌，備用。

凍干保護劑：海藻酸鈉50％、木糖醇25％、初乳蛋白25％(2:1:1)作為凍干保護劑按1:10比例與發(fā)酵液干物質混合。

本發(fā)明涉及的主要儀器及設備：

4℃冰箱sc-276，海爾集團；-86℃冰箱dw-fw3_51，中科美菱低溫科技有限公司；電子天平ja2003，上海精密科學儀器有限公司；數顯酸度計phs-2_5，上海儀電科學儀器股份有限公司；無菌超凈工作臺sw-cj一1f，蘇凈airtech；高壓滅菌鍋ldzx-30kb，上海三申醫(yī)療器械有限公司；恒溫培養(yǎng)箱jb202，上海錦屏儀器儀表有限公司；無菌過濾裝置250ml，美國nalgene公司；數顯恒溫水浴鍋hh-2，金壇市富華儀器有限公司；hitachiu-2000型紫外可見分光光度計；eppendorftgl-168高速臺式離心機；olympusbx50型光學顯微鏡；olympusbx50型攝像系統(tǒng)；722型分光光度計；厭氧罐(bblgaspark)；olympuspm-20型攝像系統(tǒng)；250m1聚丙烯離心管、(gilson)、涂菌平皿為國產；巴斯德吸管、吸管、微量加樣器8道排槍，eppendorf公司。

主要實驗材料：耐久腸球菌cr-29，腸膜明串株菌sr-19，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，編號分別為cgmcc編號11870、和cgmcc編號11869。

保加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌來自長春中俄科技園中俄生物工程與技術聯(lián)合研發(fā)中心；青春雙歧桿菌來自俄羅斯莫斯科大學；糞腸球菌f-3由俄羅斯圣彼得堡國立大學基礎醫(yī)學與醫(yī)療技術系提供。腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)、單核細胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大腸桿菌(escherichiacoli)由吉林大學公共衛(wèi)生學院提供。

生物材料保藏信息：

耐久腸球菌cr-29，分類命名為耐久腸球菌enterococcusdurans，于2015年12月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為：cgmccno.11870。

腸膜明串株菌sr-19，分類命名為腸膜明串珠菌腸膜亞種leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides，于2015年12月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為：cgmccno.11869。

本發(fā)明的有益效果是：

1.更安全。不僅是健康個體正常菌群的代表菌，亦可從傳統(tǒng)乳制品中提取的。在傳統(tǒng)的食用乳制品中，得到長期的實踐驗證。

2.更容易存活。兩種菌種為微量需氧和兼性厭氧菌，相較嚴格厭氧菌，如：雙歧桿菌等更容易在應用中保持活性。

3.更美味。腸膜明串珠菌腸膜亞種(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)可發(fā)酵檸檬酸而產生特異風味物質，其有稱為風味菌，香氣菌或產香菌。在醫(yī)藥和食品應用中無需添加糖衣或者美味劑，就具有怡人味道。

4.更有效(定殖能力更強)。本產品的主要成分是一對共生體益生菌l.mesenteroides和e.durans分相互間具有促進作用。在體內的定殖能力大大優(yōu)于以往的任何單一菌種。并且，對每個個體本身存在于體內的有益菌群打造適宜環(huán)境，拮抗有害菌群，同時釋放對人體健康有益物質：維生素a、b1、b2、b5、b9、b12、c、d、e、有機酸(乳酸,不飽和脂肪酸等)、酶，微量元素(fe、cu、ca、k、mg、p、zn)。從而打破傳統(tǒng)治療人體消化道菌群失調的填補失去的有益菌群方法。特別的服用方法：分別有益生菌膠囊和片劑，膠囊水送入腸，片劑含化或咀嚼，從而最大實現共生體對整體消化道內的活性。

5.應用更廣闊?？捎糜谌粘１＝。t(yī)學臨床(小兒的上消化道炎)，獸醫(yī)藥，食品工業(yè)中。

附圖說明：

圖1共生體益生菌單一菌體的無細胞上清液對菌落形成的影響

圖2益生菌sr-19無細胞上清液對其他益生菌的影響

圖3益生菌cr-29無細胞上清液對其他益生菌的影響

圖4益生菌共生體sr-19與cr-29混合發(fā)酵無細胞上清液對其他益生菌的促生影響

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但足本領域技術人員將會理解，下列實施例僅于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。

實施例1sr-19和cr-29的互相促生長

通過平板打孔生長圈測定法驗證益生菌對其他菌體的影響。

1)益生菌無細胞上清液(free-cellsupernatant)的制備:分別取單一益生菌sr-19、cr-29的培養(yǎng)24h后的菌液，在無菌條件下離心(8000r/min，4℃，20min)。上清液分別經0.45μm微孔濾膜過濾除菌。收集于無菌的4.0mlep管中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2)實驗操作：將耐久腸球菌cr-29與混勻的45℃上層瓊脂倒在底層培養(yǎng)基上，凝固后以無菌打孔器打孔(孔徑8mm),孔中加入1ml制備好的腸膜明串株菌sr-19無細胞上清液，培養(yǎng)24h，測定菌落的大小與密度。同時，將本實驗的研究客體互換，即將腸膜明串株菌sr-19與混勻的45℃上層瓊脂倒在底層培養(yǎng)基上，加入耐久腸球菌cr-29的無細胞上清液。并且，測定單一益生菌和益生菌共生體無細胞上清液彼此之間的促進生長作用以及對其他益生菌的影響。將一種菌的無細胞上清液與培養(yǎng)基按1:10混合，接入1％待檢菌，厭氧培養(yǎng)24小時，以uv-9100型紫外可見分光光度計測定od600值。待測菌分別為耐久腸球菌cr-29，腸膜明串株菌sr-19，保加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌，青春雙歧桿菌，糞腸球菌f-3。

培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂o.5g，硫酸錳o.25g，瓊脂，15g，加蒸餾水至1000ml，ph6.4。

從圖1可以看出，無論是腸膜明串株菌sr-19還是耐久腸球菌cr-29，這兩株菌的發(fā)酵活性代謝物質對彼此具有相互的促進生長的作用。在打孔處加入1ml無細胞上清液的情況下，sr-19菌的菌落個數是空白組的4倍，cr-29菌的菌落個數是空白組的4.5倍。

除了研究益生菌平板固態(tài)生長的互惠共生情況，還要了解共生體益生菌在液態(tài)發(fā)酵過程中彼此影響，以及此益生菌共生體對其他益生菌的生長是否具有促進作用。

測定單一益生菌無細胞上清液彼此之間的促進生長作用以及對其他益生菌的影響。

圖2表明sr-19對cr-29的液體培養(yǎng)促生長作用。

實施例2益生菌共生體的作用

比較圖2、圖3、圖4中，sr-19、cr-29、共生體對四種菌的影響，可以看出，共生體的顯著促進四種菌的作用，兩種菌具有協(xié)同作用。

由本實驗得出，在液態(tài)靜止培養(yǎng)下單一益生菌對彼此互為共生的菌株有促生效應，這進一步驗證了之前平板打孔生長圈測定法的實驗結果。而單一的sr-19或cr-29對其他代表性的腸道益生菌的促進生長的作用不明顯；而益生菌共生體的聯(lián)合發(fā)酵上清液對不同的益生菌促生作用很好，至少可刺激一倍以上的擴增，對于青春雙歧桿菌促生可達3倍以上。分析原因可能是共生體益生菌的活性代謝物以及有機酸等對益生菌有協(xié)同促生的影響。這為該益生菌在腸道內定殖后，促進其他腸道內的原生益生菌的生長提供了實驗基礎。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。