本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌及其在防治仔豬腹瀉中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

單寧酶全稱(chēng)單寧?；饷?，屬于誘導(dǎo)型胞外酶，可高效、專(zhuān)一、定向裂解單寧中的酯鍵、縮酚鍵和糖苷鍵。單寧酶可以作為脫除單寧成分的添加劑，用于茶、葡萄酒、啤酒及果汁飲料的生產(chǎn)。另外，單寧酶可將五倍子單寧降解為沒(méi)食子酸(ga)。通過(guò)單寧酶水解單寧生產(chǎn)沒(méi)食子酸，與化學(xué)方法相比具有產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、生成的污染物少等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化工生產(chǎn)的要求。采用酶法生產(chǎn)沒(méi)食子酸的關(guān)鍵在于獲得具有高產(chǎn)酶能力的菌株，目前關(guān)于產(chǎn)單寧酶菌株分離、篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化已有不少報(bào)道，包括從植物的莖葉組織、土壤等來(lái)源分離產(chǎn)單寧酶真菌，以及通過(guò)固體或液體發(fā)酵的方法對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的研究。但要獲得酶活力高、穩(wěn)定性好、適于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株，仍需不斷進(jìn)行高酶活菌株的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作?，F(xiàn)有報(bào)道的能夠產(chǎn)單寧酶的菌株主要有曲霉屬、青霉屬、根霉屬和毛酶屬菌等，但還未見(jiàn)有嗜酸乳桿菌產(chǎn)單寧酶的報(bào)道。

由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(etec)引起的仔豬大腸桿菌性腹瀉是一種發(fā)病率和死亡率極高的傳染病，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在眾多血清型中，k88流行最為廣泛。該病的治療主要依賴(lài)抗生素，但長(zhǎng)期濫用抗生素造成病原菌耐藥性的增強(qiáng)。而普通疫苗及基因工程苗因菌型差異或保護(hù)面窄的原因而不能起到有效的預(yù)防作用，免疫效果往往不夠理想。

中草藥、微生態(tài)制劑無(wú)副作用、無(wú)殘留，在目前針對(duì)腸毒素大腸桿菌引起的仔豬腹瀉的研究中越來(lái)越引起人們的重視。中草藥治療疾病在我國(guó)已有幾千年的歷史，中草藥含有的各種有效成分，對(duì)病原體有直接抑制或殺滅作用，目前臨床上已經(jīng)有中藥用于治療仔豬的大腸桿菌性腹瀉的報(bào)道。但中草藥因?yàn)樽陨淼某煞謴?fù)雜，有效成分或部位不完全清晰，目前的使用方法大多還局限于傳統(tǒng)的炮制工藝，對(duì)藥物的有效成分的利用率較低。因此，尋求一種安全、高效、綠色且不產(chǎn)生抗性的新的治療方法尤為重要。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵法在中草藥的研究上是越來(lái)越廣泛，大量的研究證明，微生物定向發(fā)酵中藥，具有提高中藥藥效，產(chǎn)生新成分等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為中藥發(fā)酵研究的新方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌及其在防治仔豬腹瀉中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一株高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌，其為嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)blcc2-0111，已于2017年3月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cctcc)，地址為：武漢市武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno：m2017098。

該菌株是從泰安市蛋雞場(chǎng)蛋雞腸道內(nèi)容物中分離得到的，菌株的生理生化特征為：菌落在mrs培養(yǎng)基上呈圓形，邊緣光滑，表面凸起，乳白色或微帶黃色，直徑約0.5mm、呈桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，不產(chǎn)芽孢，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，能發(fā)酵果糖、蔗糖及葡萄糖，不液化明膠，接觸酶陰性，最適ph值為5.5-6.4，最適生長(zhǎng)溫度為35℃～38℃。

本發(fā)明的第二方面，提供一種菌劑，其活性成分為上述嗜酸乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的嗜酸乳桿菌，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

上述制備方法中，發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：2.0％葡萄糖、0.2％檸檬酸銨、0.5％乙酸鈉、0.5％磷酸氫二鉀、0.02％硫酸錳、0.05％硫酸錳、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土溫-80、1.5％瓊脂粉，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，調(diào)ph至6.0。

上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：35-40℃，恒溫培養(yǎng)20-28h；優(yōu)選的，發(fā)酵的條件為37℃，恒溫培養(yǎng)24h。

本發(fā)明的第三方面，提供上述嗜酸乳桿菌和/或菌劑在制備單寧酶中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供上述嗜酸乳桿菌和/或菌劑在制備防治仔豬腹瀉的中藥益生菌制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供一種防治仔豬腹瀉的中藥益生菌制劑。

本發(fā)明的防治仔豬腹瀉的中藥益生菌制劑，由上述的嗜酸乳桿菌在中藥組方培養(yǎng)基中發(fā)酵而成；

所述中藥組方培養(yǎng)基由蒲公英、烏梅和五味子組成，所述蒲公英、烏梅和五味子的質(zhì)量比為(5-7)：(1-2)：1。

優(yōu)選的，所述蒲公英、烏梅和五味子的質(zhì)量比為6：1：1。

本發(fā)明的第五方面，提供上述中藥益生菌制劑的制備方法，步驟如下：

(1)將蒲公英、烏梅和五味子粉碎，用mrs液體培養(yǎng)基溶解，滅菌，作為中藥組方培養(yǎng)基；

(2)無(wú)菌條件下將嗜酸乳桿菌的種子液接種至步驟(1)的中藥組方培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，即制備得到中藥益生菌制劑。

步驟(2)中，所述嗜酸乳桿菌的種子液的接種量為3-5％(體積比)；優(yōu)選為4％。

步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：ph5-6(優(yōu)選為5.5)，37℃培養(yǎng)24h。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次篩選分離得到一株高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌，該菌株產(chǎn)單寧酶的水平可達(dá)70.1u/ml以上。

而且，本發(fā)明的嗜酸乳桿菌屬于乳酸菌，而乳酸菌作為益生素中應(yīng)用最廣的菌種，能有效調(diào)控宿主胃腸道微生物區(qū)系平衡，預(yù)防及早期治療一些由特定病原菌感染引起的疾病，因此，相比于現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的能夠產(chǎn)單寧酶的其他菌株，本發(fā)明的高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌可以更加安全的應(yīng)用于防治腹瀉的中藥益生菌制劑的制備。

附圖說(shuō)明

圖1：不同發(fā)酵時(shí)間胞外單寧酶活力和活菌數(shù)的變化；

圖2：有機(jī)酸的混標(biāo)色譜圖；

圖3：各組有機(jī)酸色譜疊加圖；

圖4：小鼠攻毒后精神狀態(tài)及臨床表現(xiàn)；

圖5：不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清ifn-γ水平；

圖6：不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清il-4水平；

圖7：不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清ifn-γ/il-4變化。

具體實(shí)施方式

正如背景技術(shù)所介紹的，為獲得酶活力高、穩(wěn)定性好、適于工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)單寧酶的菌株，需要不斷進(jìn)行高酶活菌株的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作，基于此，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘恢旮弋a(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌及其在防治仔豬腹瀉中的應(yīng)用。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例與對(duì)比例詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。

實(shí)施例1：菌株的篩選與鑒定

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品：泰安市蛋雞場(chǎng)蛋雞腸道內(nèi)容物。

1.1.2主要試劑：?jiǎn)螌帯](méi)食子酸購(gòu)于sigma；繞丹寧、沒(méi)食子酸丙酯(pg)，購(gòu)于源葉生物；koh溶液，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；nacl、檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醇，購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基：mrs培養(yǎng)基；單寧酶液體培養(yǎng)基：mrs液體培養(yǎng)基中添加1％的單寧酸，ph5.0，121℃滅菌20min。

1.2方法

1.2.1菌株的篩選

(1)菌株的分離純化

將采集自泰安市蛋雞場(chǎng)蛋雞腸道內(nèi)容物的樣品稀釋至適當(dāng)濃度后，涂布于mrs固體培養(yǎng)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，挑取單菌落，將分離到的菌進(jìn)行反復(fù)劃線(xiàn)分離純化，純化的菌株于mrs固體斜面培養(yǎng)基保存。

(2)產(chǎn)單寧酶菌株的篩選

將分離到的菌株接種在含有1％的單寧酸的mrs液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，得到含單寧酶液體培養(yǎng)基質(zhì)，離心取上清，即為粗酶液，進(jìn)行酶活力測(cè)定。酶活力的測(cè)定采用保玉心的繞丹寧法(參考文獻(xiàn)：一種胞外單寧酶的活力檢測(cè)方法，精細(xì)化工，2008)。粗酶液和底物沒(méi)食子酸丙酯反應(yīng)得到的產(chǎn)物與繞丹寧結(jié)合，在koh的存在下形成有色團(tuán)物質(zhì)，利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)得吸光值來(lái)測(cè)定各株菌產(chǎn)物的酶活，得到產(chǎn)單寧酶水平較高的菌株，作為目標(biāo)菌株。

1.2.2菌株生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定

(1)生理生化特性

挑選單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌落進(jìn)行生化鑒定，包括觸酶試驗(yàn)、葡萄糖試驗(yàn)、果糖試驗(yàn)、蔗糖試驗(yàn)、v.p試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)，具體方法參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

(2)16srdna的擴(kuò)增與序列分析

目的菌株接種于新鮮的mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，采用天根公司的試劑盒提取菌體dna，并對(duì)其進(jìn)行16srdna序列擴(kuò)增。所用引物為細(xì)菌16srdna通用引物(f：5′-cggcaacgagcgcaaccc-3′；r：5′-ccattgtagcacgtgtgtagcc-3′)，pcr反應(yīng)體系(50μl)為:mixture25μl(含taqdna聚合酶及dntp等，購(gòu)于天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μl，模板dna2μl，超純水21μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2結(jié)果

2.1產(chǎn)單寧酶菌株的分離與篩選

泰安市蛋雞場(chǎng)蛋雞腸道內(nèi)容物共分離得到21種菌株，通過(guò)產(chǎn)單寧酶菌株液體發(fā)酵篩選，得到5株具有產(chǎn)單寧酶活力的菌株，其中1株菌株的產(chǎn)單寧酶酶活力相對(duì)較高，編號(hào)為0111，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1測(cè)定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活力結(jié)果

2.2菌株鑒定

2.2.1菌落形態(tài)及染色結(jié)果

挑取菌株0111純培養(yǎng)物接種于mrs固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)呈圓形，邊緣光滑，表面凸起，乳白色或微帶黃色，菌體為革蘭氏陽(yáng)性，直徑約0.5mm、呈桿狀，不產(chǎn)芽孢，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。

2.2.2菌株生化鑒定結(jié)果

對(duì)菌株0111進(jìn)行一系列的生化反應(yīng)，結(jié)果得出該菌能發(fā)酵果糖、蔗糖及葡萄糖，不液化明膠，接觸酶陰性，與嗜酸乳桿菌菌種特性描述一致，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2菌株0111的生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽(yáng)性或能利用；“－”表示陰性或不能利用。

2.2.3菌株0111的16srdna鑒定結(jié)果

結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果及生化鑒定結(jié)果，對(duì)菌株0111進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。以提取的總dna產(chǎn)物作為模板，用pcr方法擴(kuò)增，經(jīng)1％(m/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，發(fā)現(xiàn)被檢菌株特異性條帶大小約為1500bp，與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符，說(shuō)明pcr反應(yīng)成功擴(kuò)增出了目的片段。

對(duì)0111菌株16srdna序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如seqidno.1所示。

將測(cè)序結(jié)果與genbank中細(xì)菌16srdna序列進(jìn)行blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)0111菌株與nr_113638.1、nr_117062.1、nr_117812.1和nr_043182.1同源性高達(dá)99％，菌株0111被鑒定為嗜酸乳桿菌(bacillusacidophilus)。

3結(jié)論

從蛋雞腸道內(nèi)容物中分離篩選出了一株產(chǎn)單寧酶性能較好的菌株0111。該菌株發(fā)酵液的單寧酶酶活達(dá)到了70.1u/ml。

4.菌株0111的保藏

上述獲得的嗜酸乳桿菌0111，已于2017年3月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cctcc)，地址為：武漢市武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno:m2017098。

實(shí)施例2：拮抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88的中藥及益生菌的體外篩選

1材料與方法

1.1材料和試劑

1.1.1試驗(yàn)器材

jj300型電子天平、sw-cj-2f型超凈工作臺(tái)、thz-c恒溫振蕩器、dhp-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、mek--6318k型光電全自動(dòng)血液分析儀、tgl-16b臺(tái)式離心機(jī)。

1.1.2中草藥

白頭翁，黃柏，烏梅，黃連，白術(shù)，五倍子，金銀花，蒲公英，板藍(lán)根，秦皮，黃芪，連翹，茯苓，黨參，大青葉，柴胡，石榴皮，馬齒莧，穿心蓮。以上19種中藥均購(gòu)于山東泰安市永春堂藥業(yè)有限公司永欣藥店。

1.1.3菌株

致病菌株：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88菌株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

益生菌株：來(lái)源于山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物研究院的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌種，編號(hào)分別為0001植物乳桿菌、0003干酪乳桿菌、0012屎腸球菌、0015植物乳桿菌、0020植物乳桿菌、0031鼠李糖乳桿菌、0038鼠李糖乳桿菌及本發(fā)明實(shí)施例1篩選分離得到的嗜酸乳桿菌0111。

1.1.4培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tsa)，胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tsb)，mrs固體培養(yǎng)基，均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。mrs液體培養(yǎng)基：2.0％葡萄糖、0.2％檸檬酸銨、0.5％乙酸鈉、0.5％磷酸氫二鉀、0.02％硫酸錳、0.05％硫酸錳、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土溫-80。

1.1.5試劑

單寧、沒(méi)食子酸購(gòu)于sigma；繞丹寧、沒(méi)食子酸丙酯(pg)，購(gòu)于源葉生物；koh溶液，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；nacl、檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醇，購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1中藥水提液制備

單味中藥水提液制備：采用常規(guī)的煎煮法進(jìn)行，最后將藥液濃縮，使藥液中生藥含量為1g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2益生菌菌液制備

接種環(huán)挑取固體斜面菌種，之字劃線(xiàn)接種于新的mrs固體斜面，活化菌種?；罨木N接種于mrs液體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基的組成為：2.0％葡萄糖、0.2％檸檬酸銨、0.5％乙酸鈉、0.5％磷酸氫二鉀、0.02％硫酸錳、0.05％硫酸錳、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土溫-80)內(nèi)，搖菌，備用。

1.2.3中藥與益生菌抑菌試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)采用牛津杯法進(jìn)行測(cè)定。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)按《中藥藥理學(xué)》介紹標(biāo)準(zhǔn)即：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，15mm～19mm為高敏，10mm～14mm為中敏，10mm以下為低敏。

1.2.4不同乳酸菌產(chǎn)單寧酶活力的對(duì)比

對(duì)上述1.1.3所述的8種乳酸菌，在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行產(chǎn)單寧酶能力的測(cè)定。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

配制一系列濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(40-200μmol/l)。取標(biāo)準(zhǔn)溶液與0.3ml甲醇繞丹寧溶液(0.667％，w/v)混合，30℃水浴5min，然后加入0.2ml的koh溶液(0.5m)，再于30℃水浴5min。加入4ml蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)?0℃保溫10min。緩沖液代替標(biāo)準(zhǔn)液作為空白對(duì)照，于520nm處測(cè)定吸光值(a520)。以沒(méi)食子酸含量(μmol/l)為橫坐標(biāo)，a520為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

在520nm處，沒(méi)食子酸(40-200μmol/l)與吸光值呈線(xiàn)性相關(guān)，其線(xiàn)性回歸方程為y＝0.0018x+0.0035(r²＝0.9973)。

1.2.4.2單寧酶酶活力測(cè)定方法

酶活力的測(cè)定采用保玉心的繞丹寧法。該法以沒(méi)食子酸丙酯(pg)作為反應(yīng)的底物，單寧酶分解pg產(chǎn)生的沒(méi)食子酸可與繞丹寧在堿性條件下形成紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在520nm處有最大吸收，據(jù)此可通過(guò)測(cè)定a520的變化量來(lái)計(jì)算反應(yīng)生成的沒(méi)食子酸的量，從而計(jì)算酶活力。

1.2.5乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活力與活菌數(shù)的相關(guān)性測(cè)定

1.2.5.1乳酸菌活菌計(jì)數(shù)：采用梯度稀釋方法，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.2乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)單寧酶活力測(cè)定

乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，在不同的時(shí)間點(diǎn)采樣，測(cè)定單寧酶活力，測(cè)定方法同1.2.4.2。

2結(jié)果

2.1單味中藥對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)共19味中藥，對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88有抑菌作用的中藥共5種，分別為烏梅、五倍子、黨參、石榴皮、蒲公英，其抑菌圈直徑大小如表3：

表3中藥對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，不同單味中藥水提液對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88產(chǎn)生的抑菌作用不同。其中烏梅、五倍子、石榴皮、蒲公英抑菌效果為極敏，黨參為高敏。

結(jié)論：烏梅、五倍子、石榴皮、蒲公英可作為后續(xù)試驗(yàn)材料。

2.2乳酸菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表4乳酸菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以看出，除乳酸菌0012對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88無(wú)抑菌作用外，其余各株乳酸菌均有抑菌作用，菌株0015和嗜酸乳桿菌0111的抑菌效果較好。

2.3不同乳酸菌產(chǎn)單寧酶活力對(duì)比結(jié)果

表5不同乳酸菌單寧酶活力對(duì)比結(jié)果

注：表中‘--’代表未檢測(cè)到單寧酶活力。

由表5可以看出：嗜酸乳桿菌0111產(chǎn)單寧酶活力明顯高于其他菌株。而且與目前文獻(xiàn)報(bào)道的其他種類(lèi)的產(chǎn)單寧酶的菌株相比，嗜酸乳桿菌0111產(chǎn)單寧酶的活力也更為突出。

2.4乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活力與活菌數(shù)的相關(guān)性測(cè)定

測(cè)定乳酸菌0111發(fā)酵24h內(nèi)單寧酶活力及乳酸菌活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6和圖1。

表6乳酸菌發(fā)酵24h內(nèi)單寧酶活力及乳酸菌活菌數(shù)

由表6和圖1可知，乳酸菌0111在7h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h進(jìn)入平穩(wěn)期，此時(shí)單寧酶活力也達(dá)到了75.876u/ml。說(shuō)明單寧酶活力的變化與乳酸菌的活菌數(shù)成正相關(guān)。

實(shí)施例3：中藥及益生菌免疫增強(qiáng)作用的動(dòng)物體內(nèi)篩選試驗(yàn)

1材料與方法

1.1材料和試劑

試驗(yàn)器材：本實(shí)施例所用的試驗(yàn)器材同本發(fā)明實(shí)施例2。

中草藥：本發(fā)明實(shí)施例2所篩選出的抑菌效果較好的4味中草藥(烏梅、石榴皮、蒲公英、五倍子)，及玉屏風(fēng)散(黃芪、白術(shù)、防風(fēng))，中草藥均購(gòu)于山東泰安市永春堂藥業(yè)有限公司永欣藥店。

益生菌株：嗜酸乳桿菌0111(本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到)、植物乳桿菌0015(山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物研究院提供)。

試驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠160只，體重18-20g，雌雄各半，購(gòu)自山東泰邦生物集團(tuán)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。

試劑：注射用環(huán)磷酰胺(cy)，為山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1中藥水提液制備

單味中藥水提液制備：采用常規(guī)的煎煮法進(jìn)行，最后將藥液濃縮，使藥液中生藥含量為1g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)方中藥水提液制備：玉屏風(fēng)散(ypf)，選自《中國(guó)藥典》，按照黃芪：白術(shù)：防風(fēng)為3:1:1比例配制，制備方法同單味中藥水提液制備。

1.2.2益生菌菌液制備：同本發(fā)明實(shí)施例2中“1.2.2”。

1.2.3動(dòng)物試驗(yàn)給藥方法及給藥量

采用飲水給藥，即將一定量的中藥濃縮液加入到小鼠的飲水瓶中，讓其自由飲用，每天晚上給藥，給藥期間正常采食，次日替換清水。每只小鼠的給藥量按照小鼠的體表面積折算動(dòng)物的等效劑量的2倍計(jì)算。

1.2.4動(dòng)物分組及處理：

160只小鼠于購(gòu)買(mǎi)后預(yù)飼2天，第3天隨機(jī)分組，共分為16組，每組10只小鼠，稱(chēng)量記錄每組小鼠的初始體重。第1組灌胃生理鹽水作為對(duì)照組，第2、3、4、5、6組分別為玉屏風(fēng)、五倍子、烏梅、石榴皮、蒲公英組，7、8組分別為乳酸菌0015組、嗜酸乳桿菌0111組。每組小鼠按照表格對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)灌胃給藥，連續(xù)給藥1周；1+組為免疫抑制對(duì)照組，灌胃生理鹽水，第2+、3+、4+、5+、6+、7+、8+組小鼠給藥方式和給藥量同本實(shí)施例中“1.2.3”，從喂藥的第3d起，每組開(kāi)始以75mg/kg體重的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，每隔一天注射一次，共注射4次，注射期間正常給藥，直至停止注射環(huán)磷酰胺的第2d，眼球采血處死。

表7試驗(yàn)分組及處理方式

1.3指標(biāo)測(cè)定

分組后稱(chēng)量小鼠初始體重，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)量末體重，計(jì)算增重率；試驗(yàn)結(jié)束后眼球采血處死，血液用于血常規(guī)wbc、rbc、hct、mch、mcv檢測(cè)，血清用于siga、igg檢測(cè)；摘取肝、脾、胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件spss10.0進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果

2.1中藥及乳酸菌對(duì)小鼠體重的影響

中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠體重的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠體重的影響(n＝10)

由表8可知，對(duì)于正常組小鼠，各組小鼠末體重差異不顯著(p>0.05)。除石榴皮外，其他各中藥及益生菌組均可不同程度的提高小鼠的平均增重率，蒲公英組增重率為54％，與經(jīng)典方劑玉屏風(fēng)組更接近。乳酸菌以0111較高，增重率為51.29％。

結(jié)論：蒲公英與嗜酸乳桿菌0111在提高小鼠增重率方面效果較優(yōu)。

2.2中藥及乳酸菌對(duì)免疫抑制小鼠體重的影響

中藥及乳酸菌對(duì)免疫抑制小鼠體重的影響結(jié)果見(jiàn)表9。

表9中藥及乳酸菌對(duì)cy所致的免疫抑制小鼠體重的影響(n＝10)

由表9可知，對(duì)于免疫抑制組小鼠，各組平均增重率均低于對(duì)照組。烏梅與0111平均增重率均高于玉屏風(fēng)對(duì)照組。

2.3中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫器官的影響

中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫器官的影響結(jié)果見(jiàn)表10和表11。

表10中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠免疫器官的影響

由表10可知，對(duì)于正常小鼠，各中藥及乳酸菌組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)相比于生理鹽水對(duì)照組略有增加或減少，但均差異不顯著(p>0.05)。說(shuō)明各中藥和益生菌對(duì)正常小鼠的免疫器官指數(shù)影響較小。

表11中藥及乳酸菌對(duì)cy所致免疫抑制小鼠免疫器官的影響

對(duì)于免疫抑制組小鼠，各組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝臟指數(shù)與對(duì)照組和玉屏風(fēng)組相比差異不顯著(p>0.05)，其中五倍子、烏梅、蒲公英、嗜酸乳桿菌0111組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝臟指數(shù)均高生理鹽水對(duì)照組，說(shuō)明五倍子、烏梅、蒲公英、嗜酸乳桿菌0111在一定程度上可以解除小鼠的免疫抑制反應(yīng)。

2.4中藥及乳酸菌對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響

中藥及乳酸菌對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表12-表13。

表12中藥及乳酸菌對(duì)正常小鼠血常規(guī)的影響

由表12可知，正常小鼠灌胃中藥和益生菌，血液中白細(xì)胞數(shù)目及血紅蛋白均有所降低，但差異不顯著；紅細(xì)胞數(shù)目也呈下降趨勢(shì)，2-7組與對(duì)照差異不顯著，8組(嗜酸乳桿菌0111)與對(duì)照差異顯著；平均紅細(xì)胞體積均有所升高，但差異不顯著；除了嗜酸乳桿菌0111的平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量與對(duì)照差異顯著，其他各組均差異不顯著；各組的紅細(xì)胞壓積與對(duì)照差異不顯著。結(jié)果表明，正常小鼠灌胃中藥和乳酸菌，會(huì)一定程度上降低小鼠的白細(xì)胞數(shù)目及紅細(xì)胞數(shù)目，但影響不大。

表13中藥及乳酸菌對(duì)免疫抑制小鼠血常規(guī)的影響

由表12與表13可知：免疫抑制組(1+)與非免疫抑制組(1)相比，白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白量均顯著降低，平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積變化不顯著；對(duì)于免疫抑制小鼠，灌胃不同的中藥及益生菌，能夠不同程度的提高血液中白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目及血紅蛋白；降低平均紅細(xì)胞體積，且五倍子組(3+)與對(duì)照組(1+)差異顯著；灌胃中藥會(huì)降低平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量，對(duì)紅細(xì)胞壓積影響不大。結(jié)果表明，注射免疫抑制劑，會(huì)明顯造成血液中白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目及血紅蛋白含量減少，而灌胃中藥及益生菌，會(huì)不同程度上調(diào)上述指標(biāo)，從而解除免疫抑制反應(yīng)。綜合考慮，烏梅、石榴皮、蒲公英、乳酸菌0111效果較優(yōu)。

2.5中藥及乳酸菌對(duì)小鼠血清免疫球蛋白的影響

中藥及乳酸菌對(duì)小鼠血清免疫球蛋白的影響結(jié)果見(jiàn)表14。

表14中藥及乳酸菌對(duì)小鼠血清免疫球蛋白的影響

由表14可知：與對(duì)照相比，非免疫抑制組與免疫抑制組小鼠，盲腸粘膜siga含量與血清中igg含量均有不同程度的升高。對(duì)非免疫抑制組小鼠，五倍子、石榴皮與乳酸菌0111與對(duì)照組(1)差異顯著；對(duì)免疫抑制組小鼠，五倍子、烏梅、乳酸菌0111與對(duì)照組(1+)差異顯著。結(jié)果表明，灌胃中藥及乳酸菌能夠上調(diào)小鼠腸粘膜及血清中免疫球蛋白的含量(siga、igg)。其中，五倍子及乳酸菌0111能夠提高小鼠血清中igg含量，增強(qiáng)免疫力。

結(jié)論：綜合分析上述各項(xiàng)指標(biāo)，中藥烏梅、五倍子、蒲公英及嗜酸乳桿菌0111(本發(fā)明實(shí)施例1中篩選得到)對(duì)小鼠的免疫增強(qiáng)效果較優(yōu)。

實(shí)施例4：中藥益生菌制劑的制備條件優(yōu)化

1試驗(yàn)材料

1.1中藥：蒲公英、烏梅、五倍子，購(gòu)于山東泰安市永春堂藥業(yè)有限公司永欣藥店。

1.2供試菌株：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88菌株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

嗜酸乳桿菌0111，為本發(fā)明實(shí)施例1篩選分離得到。

1.3培養(yǎng)基：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tsa)，胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tsb)，均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

2試驗(yàn)方法

2.1嗜酸乳桿菌0111種子液制備

將本實(shí)施例“1.2”中已低溫保藏的供試菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)，挑取新的嗜酸乳桿菌0111接種于100ml乳酸菌液體培養(yǎng)基中活化，制備新鮮活化的種子液，4℃冷藏備用。

2.2中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備各味藥材烘干，用小型粉碎機(jī)磨成粉末狀，過(guò)80目篩，之后用mrs液體培養(yǎng)基配成一定質(zhì)量濃度的中藥溶液，滅菌備用，作為中藥基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3嗜酸乳桿菌0111發(fā)酵中藥條件的優(yōu)化

菌株發(fā)酵條件的摸索，包括最佳中藥組方摸索、最佳接種量摸索、最佳初始ph摸索。

2.3.1最佳中藥組方摸索：在無(wú)菌條件下，將“2.1”制備的嗜酸乳桿菌0111種子液分別按照體積比4％的接種量，分別接入蒲公英：烏梅：五倍子配比為2:1:1、6:1:1、7:2:1、8:1:1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)24h。采用平板計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.3.2最佳接種量摸索：在無(wú)菌條件下，將“2.1”制備的嗜酸乳桿菌0111種子液分別按照體積比2％、4％、8％的接種量，分別接入到由“2.3.1”得出的最佳中藥組方培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)24h。采用平板計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.3.3最佳發(fā)酵初始ph摸索：在無(wú)菌條件下，將“2.1”制備的嗜酸乳桿菌0111種子液按照2.3.2得出的最佳接種量，分別接入到“2.3.1”得出的最佳中藥組方培養(yǎng)基中，用0.5nnaoh和0.5nhcl將培養(yǎng)基ph值分別調(diào)為不調(diào)整、6.5、7、7.5，37℃，靜置培養(yǎng)24h。采用平板計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1最佳中藥組方摸索

表15中藥組方對(duì)嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)的影響(10⁹cfu·ml^-1)

由表15可知：在蒲公英：烏梅：五倍子＝6:1:1時(shí)，嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)最高，菌株生長(zhǎng)性能最好。

3.2最佳接種量摸索

表16接種量對(duì)嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)的影響(10⁹cfu·ml^-1)

由表16可知；在接種量為4％條件下，嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)最高，菌株生長(zhǎng)性能最好。

3.3最佳發(fā)酵初始ph摸索

表17初始ph對(duì)嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)的影響(10⁸cfu·ml^-1)

由表17可知：在蒲公英：烏梅：五倍子＝6:1:1(質(zhì)量比)，接種量為4％(體積分?jǐn)?shù))，培養(yǎng)溫度為37℃條件下，ph5.5左右(不調(diào)整)時(shí)，嗜酸乳桿菌0111活菌數(shù)最高，菌株生長(zhǎng)性能最好。

4.小結(jié)：

中藥益生菌制劑的優(yōu)選的制備條件為：

(1)將蒲公英、烏梅和五味子干燥，粉碎，過(guò)80目篩，用mrs液體培養(yǎng)基溶解(每8g的中藥組方用100mlmrs液體培養(yǎng)基溶解)，滅菌，作為中藥組方培養(yǎng)基；中藥組方培養(yǎng)基中蒲公英、烏梅和五味子的質(zhì)量比為6：1：1。

(2)無(wú)菌條件下將嗜酸乳桿菌0111的種子液按4％的接種量接種至步驟(1)的中藥組方培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為ph5.5左右(不調(diào)整)，37℃培養(yǎng)24h，制備得到中藥益生菌制劑。

實(shí)施例5：中藥益生菌制劑中有效成分的含量測(cè)定

嗜酸乳桿菌0111發(fā)酵對(duì)中藥益生菌制劑中有機(jī)酸(草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸)含量的影響

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：島津lc-20at型高效液相色譜儀(sil-20a自動(dòng)進(jìn)樣器，spd-20a紫外檢測(cè)器，cto-20a柱溫箱，dgu-20a3真空脫氣機(jī)，cto-10asvp柱溫箱，lc-20at溶液傳輸單元)；超純水儀器；

試劑：甲醇(色譜純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)、磷酸(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)、磷酸二氫銨(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，超純水。

對(duì)照品：草酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b20132)、酒石酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b25642)、蘋(píng)果酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b20937)、乳酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b21929)、乙酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b25615)、檸檬酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b20461)、琥珀酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)b20534)。

1.2測(cè)定方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：intersustainc18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：20mm磷酸二氫銨緩沖液(ph2.3)-甲醇(98：2)；流速：0.6mg/ml；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：28℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.2.2溶液配制

嗜酸乳桿菌0111菌液組:96ml乳酸菌培養(yǎng)基接種嗜酸乳桿菌0111種子液4ml，37℃培養(yǎng)24h，取菌液12000rpm離心10min，取上清液，過(guò)0.22μm膜2次，即為嗜酸乳桿菌0111菌液組待測(cè)液。

中藥水提液組:中藥蒲公英、烏梅、五倍子烘干，磨粉，過(guò)80目篩，按蒲公英、烏梅、五倍子6：1：1比例準(zhǔn)確稱(chēng)取，水提40min，65℃烘干。精確稱(chēng)取8g烘干粉末置于100ml乳酸菌液中，超聲震蕩30min。12000rpm離心10min，取上清液，過(guò)0.22μm膜2次，即為中藥水提液組待測(cè)液。

中藥益生菌組:按本發(fā)明實(shí)施例4中優(yōu)選的制備條件制備中藥益生菌制劑，12000rpm離心10min，取上清液，過(guò)0.22μm膜2次，即為中藥益生菌制劑組待測(cè)液。

1.2.3樣品測(cè)定

按照供試品溶液的制備的方法制備，并按照本實(shí)施例“1.2.1色譜條件”進(jìn)行含量測(cè)定。

2.結(jié)果與分析

有機(jī)酸的混標(biāo)色譜圖如圖2所示。

各組有機(jī)酸色譜疊加圖如圖3所示，由圖3可知，經(jīng)嗜酸乳桿菌0111發(fā)酵后的中藥益生菌制劑中的部分成分發(fā)生變化，測(cè)定有機(jī)酸的含量增高，或出現(xiàn)新峰，或峰消失。具體各組中有機(jī)酸含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表18。

表18各組中有機(jī)酸含量(單位：mg/ml)

由表18可知，中藥益生菌組中，除蘋(píng)果酸含量有所降低外，各種有機(jī)酸均有不同程度的升高，其中檸檬酸和琥珀酸含量增加較多，分別為中藥水提液組的1.28和2.51倍。有機(jī)酸的含量的增加有益于動(dòng)物腸道微生物群平衡，用于斷奶仔豬日糧中，對(duì)仔豬的健康和生長(zhǎng)都有積極作用。

對(duì)比例1：

(1)將蒲公英和五味子干燥，粉碎，過(guò)80目篩，用mrs液體培養(yǎng)基溶解(每8g的中藥組方用100mlmrs液體培養(yǎng)基溶解)，滅菌，作為中藥組方培養(yǎng)基；中藥組方培養(yǎng)基中蒲公英和五味子的質(zhì)量比為6：1。

(2)無(wú)菌條件下將嗜酸乳桿菌0111的種子液按4％的接種量接種至步驟(1)的中藥組方培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為ph5.5左右(不調(diào)整)，37℃培養(yǎng)24h，制備得到中藥益生菌制劑。

對(duì)比例2：

(1)將蒲公英、烏梅、五味子、黨參和石榴皮干燥，粉碎，過(guò)80目篩，用mrs液體培養(yǎng)基溶解(每8g的中藥組方用100mlmrs液體培養(yǎng)基溶解)，滅菌，作為中藥組方培養(yǎng)基；中藥組方培養(yǎng)基中蒲公英、烏梅、五味子、黨參和石榴皮的質(zhì)量比為6:1:1:1:1。

(2)無(wú)菌條件下將嗜酸乳桿菌0111的種子液按4％的接種量接種至步驟(1)的中藥組方培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為ph5.5左右(不調(diào)整)，37℃培養(yǎng)24h，制備得到中藥益生菌制劑。

對(duì)比例3：

(1)將蒲公英、烏梅和五味子干燥，粉碎，過(guò)80目篩，用mrs液體培養(yǎng)基溶解(每8g的中藥組方用100mlmrs液體培養(yǎng)基溶解)，滅菌，作為中藥組方培養(yǎng)基；中藥組方培養(yǎng)基中蒲公英、烏梅和五味子的質(zhì)量比為6：1：1。

(2)無(wú)菌條件下將常規(guī)的市售嗜酸乳桿菌(本對(duì)比例的嗜酸乳桿菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為cicc20980)的種子液按4％的接種量接種至步驟(1)的中藥組方培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為ph5.5左右(不調(diào)整)，37℃培養(yǎng)24h，制備得到中藥益生菌制劑。

對(duì)比例4：

將蒲公英、烏梅和五味子干燥，粉碎，過(guò)80目篩，將蒲公英、烏梅和五味子按質(zhì)量比為6：1：1混合，采用傳統(tǒng)水提方法進(jìn)行提取，濃縮至中藥濃度為8g/100ml，得到中藥水提液。

應(yīng)用例1：中藥益生菌制劑在小鼠體內(nèi)的作用效果的研究

1試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)小鼠

巴比西小鼠(6-8周齡)100只，雌雄各半，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2試驗(yàn)菌株

大腸桿菌k88菌株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

2試驗(yàn)方法

2.1鼠糧制備

中藥發(fā)酵鼠糧：采用本發(fā)明實(shí)施例4中經(jīng)優(yōu)化后的制備條件制備的中藥益生菌制劑，進(jìn)行凍干處理，將凍干粉按照10％添加量與常規(guī)鼠糧粉末混勻，成型，烘干即得。

中藥水提鼠糧：中藥蒲公英、烏梅、五倍子烘干，磨粉，過(guò)80目篩，按蒲公英、烏梅、五倍子6：1：1比例準(zhǔn)確稱(chēng)取8g，水提40min，濃縮至100ml，凍干，凍干粉按照10％添加量與常規(guī)鼠糧粉末混勻，成型，烘干即得。

常規(guī)鼠糧：常規(guī)鼠糧粉碎后成型，烘干即得。

2.2大腸桿菌菌懸液制備

挑取保存于tsa斜面培養(yǎng)基的k88大腸桿菌，接種至tsb液體培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)18h，菌液離心，棄上清，加入適量生理鹽水，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尵鷳乙簼舛戎?×10⁸cfu/ml，即得。

2.3試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

分組：100只小鼠，隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組(ck)，模型組(mx)，中藥水提組(st)，中藥發(fā)酵組(fj)，每組25只，其中10只用于腹瀉指數(shù)、腹瀉率等指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)，另15只用于斷尾采血，測(cè)定細(xì)胞因子。各組小鼠置于小鼠籠，籠內(nèi)鋪潔凈無(wú)污跡的白色濾紙，每天更換干凈濾紙。

造模：模型組(mx)，中藥水提組(st)，中藥發(fā)酵組(fj)均用林可霉素(15mg/ml)和頭孢曲松鈉(25mg/ml)兩種抗生素灌胃，0.3ml/次/只，2次/天，連續(xù)灌胃4天，第5天腹腔注射k88菌懸液0.3ml/只(2.7億)，空白對(duì)照組不做處理。

給藥：中藥水提組(st)、中藥發(fā)酵組(fj)小鼠灌胃抗生素期間分別飼喂中藥水提鼠糧和中藥發(fā)酵鼠糧，藥量據(jù)成人用量按體表面積換算法得，給藥劑量(原藥)為0.4g/只/天，空白對(duì)照組及模型組(mx)小鼠灌胃抗生素期間飼喂常規(guī)鼠糧，所有小鼠自由采食及飲水。

2.4評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.4.1觀察小鼠臨床癥狀，包括小鼠的精神狀態(tài)、被毛狀態(tài)、大便性狀等。

2.4.2統(tǒng)計(jì)腹瀉率、腹瀉指數(shù)

(1)腹瀉率＝腹瀉的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100％；

(2)腹瀉指數(shù)＝稀便率×平均稀便級(jí)

稀便率：每只動(dòng)物所排的稀便數(shù)與總便數(shù)之比。稀便級(jí):表示每只動(dòng)物稀便的程度，以稀便污染濾紙的直徑定級(jí)，分為4級(jí)：小于1cm(1級(jí))，1～1.9cm(2級(jí))，2～3cm(3級(jí))，大于3cm(4級(jí))。平均稀便級(jí)＝所有稀便級(jí)數(shù)/稀便次數(shù)

統(tǒng)計(jì)時(shí)先逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每一堆稀便的級(jí)數(shù)，然后將該鼠所有稀便級(jí)數(shù)相加除以稀便次數(shù)得稀便的平均級(jí)數(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)稀便級(jí)。

2.4.3細(xì)胞因子測(cè)定

以灌胃抗生素為試驗(yàn)第一天，取15只小鼠于灌胃前1h、腹腔注射大腸桿菌前1h、注射后2h、12h、24h、36h尾靜脈采血，冷藏過(guò)夜，4000r/min，離心10min，分裝血清，分別檢測(cè)小鼠血清ifn-γ、il-4、il-10水平的表達(dá)，并計(jì)算ifn-γ/il-4和ifn-γ/il-10的比值。

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1小鼠攻毒后精神狀態(tài)及臨床表現(xiàn)

結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可以看出，攻毒2h后，空白對(duì)照組(ck)小鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)稀便；模型組(mx)、中藥發(fā)酵組(fj)、中藥水提組(st)小鼠精神沉郁，身體蜷縮，活動(dòng)減少，出現(xiàn)稀便，其中以模型組(mx)腹瀉較嚴(yán)重，中藥發(fā)酵組(fj)、中藥水提組(st)腹瀉較輕。

3.2攻毒后不同時(shí)間各組小鼠腹瀉指數(shù)

表19攻毒后不同時(shí)間段各組小鼠腹瀉指數(shù)

由表19可以看出，24h前，與空白對(duì)照組(ck)相比，試驗(yàn)組(fj、st)與模型組(mx)腹瀉指數(shù)差異顯著(p＜0.05)，中藥發(fā)酵組腹瀉指數(shù)最低，模型組腹瀉指數(shù)最高。24h-36h，與對(duì)照組相比，模型組(mx)與中藥水提組腹瀉指數(shù)差異顯著(p＜0.05)，中藥發(fā)酵組與對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果表明，中藥發(fā)酵能降低小鼠腹瀉指數(shù)。

3.3攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠腹瀉率

表20攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠腹瀉率(％)

由表20可知，攻毒后0-36h期間，mx、fj、st三組小鼠的腹瀉率均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在36h時(shí)，fj組腹瀉率最低，st次之，mx組最高。說(shuō)明中藥發(fā)酵組能夠顯著降低攻毒小鼠的腹瀉率，對(duì)小鼠腹瀉有較好的治療作用。

3.4不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清ifn-γ水平

結(jié)果見(jiàn)表21和圖5。

表21不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清ifn-γ水平

結(jié)果表明：不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清ifn-γ含量呈先下降后上升趨勢(shì)。灌胃抗生素前，各組ifn-γ含量無(wú)顯著性差異。灌胃抗生素4天，即攻毒大腸桿菌前，中藥發(fā)酵組與對(duì)照組差異不顯著，中藥水提組、模型組與對(duì)照組差異顯著。感染2小時(shí)，各組均低于對(duì)照組，且差異顯著。感染12小時(shí)，各組均高于對(duì)照組，且差異顯著。感染24h，中藥發(fā)酵組與對(duì)照組差異顯著，其余各組與對(duì)照組差異不顯著。感染36h后各組間無(wú)顯著性差異。

3.5不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清il-4水平

結(jié)果見(jiàn)表22和圖6。

表22不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清il-4水平

結(jié)果表明：不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清il-4含量呈先上升后下降趨勢(shì)。中藥發(fā)酵組與中藥水提液組，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，差異不顯著。在攻毒前和攻毒后12h，模型組il-4含量迅速上升，與對(duì)照組、中藥發(fā)酵組、中藥水提組差異顯著。

3.6不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清ifn-γ/il-4變化

結(jié)果見(jiàn)表23和圖7。

表23不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清ifn-γ/il-4變化

攻毒大腸桿菌前，即給藥4d后，中藥發(fā)酵組ifn-γ/il-4更接近對(duì)照組，降低比值向th2偏移趨勢(shì)。感染24h后，給藥組，特別是中藥發(fā)酵組，能迅速提高ifn-γ/il-4比值，使已經(jīng)發(fā)生的th2方向的漂移迅速恢復(fù)平衡。

4結(jié)論

在攻毒大腸桿菌前，中藥發(fā)酵組能夠緩解灌胃抗生素和應(yīng)激造成的ifn-γ含量下降。攻毒大腸桿菌12h后，各組ifn-γ呈上升趨勢(shì)，其中中藥發(fā)酵組上升較快，ifn-γ恢復(fù)水平高于模型組與中藥水提組。與模型組相比，給藥組能降低il-4急劇升高的趨勢(shì)，變化較為平緩與對(duì)照組相當(dāng)。中藥發(fā)酵液和中藥水提液對(duì)腹瀉小鼠有一定的作用效果，且中藥發(fā)酵組效果更優(yōu)，能夠顯著降低腹瀉指數(shù)和腹瀉率。

應(yīng)用例2：中藥益生菌制劑在防治仔豬腹瀉中的作用效果研究

1.材料與方法

1.1藥品

本發(fā)明實(shí)施例4中在優(yōu)化后的條件下制備的中藥益生菌制劑；

對(duì)比例1-3制備的中藥益生菌制劑，對(duì)比例4制備的中藥水提液；

1.2病例來(lái)源及分組：在泰安市寧陽(yáng)鄉(xiāng)飲鄉(xiāng)巴夫豬場(chǎng)采用自然發(fā)病的流行性腹瀉仔豬300頭，隨機(jī)分為5組。

1.3病例診斷：以自然病例根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化，實(shí)驗(yàn)室確診。綜合分析，進(jìn)行確診。

1.4治療方法：按劑量和療程飲水給藥，試驗(yàn)1組給藥本發(fā)明實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑，試驗(yàn)2組給藥對(duì)比例1制備的中藥益生菌制劑，試驗(yàn)3組給藥對(duì)比例2制備的中藥益生菌制劑，試驗(yàn)4組給藥對(duì)比例3制備的中藥益生菌制劑；試驗(yàn)5組給藥對(duì)比例4制備的中藥水提液；每組的給藥量均按2g/kg/天。一周內(nèi)觀察，回訪(fǎng)并記錄病情。

1.5療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：

治愈：用藥3-4次后患畜病癥完全消失，精神、體溫、食欲恢復(fù)正常，尿液糞便正常；

有效：用藥3-4次后患畜病癥基本消失，精神、體溫、食欲有所改善，尿液糞便正常；

無(wú)效：用藥4次后患畜病癥未消失，病情惡化或死亡，尿液糞便顏色、性狀不正常。

2.結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表24。

表24仔豬腹瀉治療效果統(tǒng)計(jì)

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司

<120>一株高產(chǎn)單寧酶的嗜酸乳桿菌及其在防治仔豬腹瀉中的應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1436

<212>dna

<213>菌株0111

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